Abstract
Tykktarmskreft (CRC) er assosiert med livsstilsfaktorer som påvirker insulin /IGF-signalering, hvorav insulin reseptor substrat 1 (IRS1) er en nøkkel svinger. Vi undersøkte uttrykk, lokalisering og patologiske korrelasjoner av IRS1 i kreft-uninvolved kolonepitelet, primær CRC med tilkoblede levermetastaser og
in vitro
polariserende Caco2 og HT29 celler. IRS1 mRNA og protein resulterte høyere, i forhold til paret slimhinner, i adenomer av familiær adenomatøs polypose pasienter og i CRC som overuttrykt
c-MYC
, ß-catenin, InsRß, og IGF1R. Analyse av IRS1 farging i 24 tilfeller av primær CRC med paret kolonepitelet og levermetastaser viste at fargeintensitet var betydelig høyere i metastaser i forhold til både primær CRC (
P
0,01) og kolonepitelet (
P
0,01). Primære og metastatisk CRC, sammenlignet med kolonepitelet, inneholdt betydelig høyere antall IRS1-positive celler (
P
= 0,013 og
P
= 0,014, henholdsvis). Patologiske sammenhenger i 163 primær CRC avdekket at diffuse IRS1 farging ble assosiert med svulster som kombinerer differensiert fenotype og aggressive markører (høy Ki67, p53, og ß-catenin). I Caco 2 IRS1 og InsR ble maksimalt uttrykt etter polarisering, mens IGF1R var høyest i pre-polarisert celler. Ingen atom IRS1 ble oppdaget, mens, med polarisering, fosforylert IRS1 (pIRS1) flyttet fra den laterale til den apikale plasma membran og ble uttrykt i overflateceller bare. I HT29, som bærer mutasjoner konstitutivt aktivere overlevelse signalering, IRS1 og IGF1R redusert med polarisering, mens pIRS1 lokalisert i kjernefysiske kapasitet gjennom hele kurset. Samlet er disse dataene gir bevis for at IRS1 er modulert ifølge CRC differensiering, og støtte en rolle IRS1 i CRC progresjon og lever metastatization
Citation. Esposito DL, Aru F, Lattanzio R, Morgano A, Abbondanza M , Malekzadeh R, et al. (2012) insulinreseptoren Substrat 1 (Irs1) i intestinal epithelial Differensiering og tykktarmskreft. PLoS ONE 7 (4): e36190. doi: 10,1371 /journal.pone.0036190
Redaktør: Venugopalan Cheriyath, Texas A M University, USA
mottatt: 15 november 2010; Godkjent: 01.04.2012; Publisert: 27 april 2012
Copyright: © 2012 Esposito et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (https://www.airc.it/), IG 9168 (2009); Italienske departementet for Scientific Research (https://www.istruzione.it/). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP (CRC) har vært knyttet til livsstil risikofaktorer, spesielt dietter basert på energitette matvarer og lav fysisk aktivitet [1] – [3]. Epidemiologisk og eksperimentelle bevis indikerer at hormonet insulin og insulin-lignende vekstfaktorer (IGF) en og to trekk nøkkelrolle (e) i mediering av den komplekse effekt (r) av diett og mosjon på CRC risiko [4] – [10] . Over-ekspresjon av insulinreseptoren (InsR) og av det nært beslektede IGF1-reseptor (IGF1R) er kritisk for insulin /IGF-system overaktivering hos kreft [4], [7], [9]. Tarmepitelet, som besitter en av de høyeste fornyelsesrater blant humane vev, uttrykker både InsR og IGF1R, og nivåene av disse reseptorene er høyere i CRC forhold til kolon mukosa [4], [7], [8], [ ,,,0],11].
Tarm epitelial differensiering er regulert av flere veier, spesielt SS-catenin avhengig WNT signale [12], [13]. De fleste CRC ser ut til å initiere etter inaktive mutasjoner i adenomatøs polypose coli (
APC
) genet, som koder for en sentral komponent i den cytosoliske multi-proteinkompleks som styrer P-catenin degradering [14] – [16].
APC
-mutated celler viser høy cytoplasma og atom ß-catenin; sistnevnte, etter binding til TCF /LEF transkripsjonsfaktorer, danner komplekser som, ved å bytte på flere kreftrelaterte gener, ilegge en proliferativ krypten stamfar fenotype (anmeldt i https://www.stanford.edu/~rnusse/wntwindow.html ) [17].
det er interessant siste bevis knytter ß-catenin og insulin /IGF signalveier. Faktisk
IRS1
, som koder for ett av de to store insulin reseptor substrater (IRS1 og IRS2), som integrerer signalerings fra InsR, IGF1R og andre cytokiner og vekstfaktor-reseptorer [18], er sterkt oppregulert i cellene med eksogent-indusert eller konstituerende ß-catenin signal [19]. Dette synes å være avhengig av direkte regulering av
IRS1
av TCF /LSF-ß-catenin komplekser. Videre er IRS1 nødvendig for transformasjon i celler som ectopically uttrykker onkogene ß-catenin og for vedlikehold av neoplastiske fenotype i
APC
-mutated celler [19]. Disse funnene er i tråd med tidligere bevis på at ektopisk IRS1 fremmer transformasjon, mens en dominant-negative
IRS1
mutant fungerer som en tumor suppressor [20]. Videre i
Apc product: (
Min Twitter /+) musemodell, intestinal tumorigenesis svekkes av
irs1
knock-out [21].
i denne studien undersøkte vi uttrykket, lokalisering og clinicopathologic korrelasjoner av IRS1
ex vivo
, i kreft-uninvolved menneskelige colonic epitel, primære CRC og sammenkoblede levermetastaser, og
in vitro
i to CRC cellemodeller som kan spontan
in vitro
polarisering, Caco2 og HT29 [22], [23].
Materialer og metoder
Pasienter og prøver
En formalinfiksert, parafininnebygd (FFPE) serie av 24 primær CRC med paret kreft-uninvolved colonic slimhinnen og synkrone levermetastaser ble retrospektivt identifisert ved Institutt for kirurgisk og onkologisk Sciences, University of Palermo, Palermo, Italia. For denne serien standard hele seksjoner ble brukt for immunhistokjemi (IHC). En ekstra FFPE serien, som bare består av primære CRC, levert av Digestive Disease Research Center (DDRC), Teheran University of Medical Sciences, Teheran, Iran, inkludert 163 av de 205 CRC tilfeller som beskrevet i Bishehsari et al. og i Mahdavinia et al. [24], [25], velges basert på vev tilgjengelighet. Disse CRC hadde tidligere blitt karakterisert for mikro ustabilitet (MSI) status og
p53 Hotell og
KRAS
mutasjoner [24], [25]. Klinisk-patologiske data, inkludert alder og kjønn, tumorstørrelse, scene og karakter, var tilgjengelig for alle 163 pasienter. Ingen oppfølging og overlevelsesdata var tilgjengelig. Microarray (TMA) ble konstruert ved å trekke histologisk-bekreftet CRC kjerner fra giver blokker med en Beecher MTA 2 mm Punch Set (Beecher Instruments, Sun Prairie, WI, USA). Kjernene ble gjeninnebygd i rutenett parafinblokker og standard TMA snitt ble brukt for IHC.
Prøver av svulsten og paret colonic mucosa, snap-frosset eller raskt fast i RNAlater (Ambion, Applied Biosystems, Foster City, CA), ble samlet ved Institutt for klinisk physiopathology, University of Florence, Firenze, Italia, fra 8 uselekterte CRC tilfeller og 2 familiær adenomatøs polypose (FAP) pasienter med molekylært-identifisert kimcellelinje
APC
mutasjoner (henholdsvis Glu1309fsX1312 og Ser843fsX860). Innsamling og analyse av prøver og klinisk-patologiske data ble godkjent av
G. D’Annunzio
Universitetet Etisk komité og av Institutional Review Board av DDRC, Shariati Hospital, Universitetet i Teheran (protokoll datert 17/03/2004). Alle saker ble anonymisert.
IHC
TMA og standard hele vevssnitt ble kuttet ved 4 pm og farget med anti-IRS1 kanin polyklonale (C-20, SC-559, Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Tyskland) ved 1:300 fortynning i 30 minutter, etter antigen gjenfinning av mikrobølgebehandling ved 750 V i 10 minutter i 10 mM natriumcitrat, pH 6,0 (Dako, Glostrup, Danmark). Den anti-kanin EnVision kit (K4003, Dako) ble anvendt for signalforsterkning. Serial TMA snitt ble også inkubert med følgende mus monoklonale antistoffer: anti-P-catenin (17C2, Novocastra Laboratories Ltd, Newcastle, UK), anti-p53 (DO7, Novocastra) og anti-Ki67 (MIB-1, Dako), som antigen gjenfinning ble utført av termostat bad ved 96 ° C i 40 min i natriumsitrat buffer (Dako), og anti-EGFR pharmDx (2-18C9, Dako), i henhold til produsentens instruksjoner. Alle immunreaksjoner ble avslørt av en streptavidin-biotin forbedret peroxydasesystemet (Super Sensitive Link-etikett IHC Detection System, BioGenex, Milano, Italia). Positive og negative kontroller ble inkludert for hvert antistoff og i hvert parti av farging.
For hver markør prosenter av positive celler ble beregnet i fire felt på 400 × forstørrelse (≈1000 celler). IRS1, Ki67, p53, EGFR og ß-catenin ble betraktet som positive når 1% av tumorceller ble farget, ble SS-catenin scoret separat for farging i cytoplasma, kjernen og langs cellemembranen. Den uavhengige utvalg t-test ble anvendt for å evaluere forskjellene i IRS1 uttrykket (% positive celler) i henhold til patologiske og mutasjons egenskaper. Ekspresjon av IRS1 ble korrelert med den i hver av de andre markører ved Spearmans rho test. SPSS (versjon 15.0) program (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) ble brukt for alle statistiske analyser. Alle siterte
P
verdier er tosidig;
P
. 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Tettheten av IRS1 farging i paret kreft-uninvolved kolonepitelet, primær CRC og levermetastaser ble bestemt ved semikvantitativ digital analyse ved hjelp ImageJ programvare ( https://rsbweb.nih.gov/ij/). Bilder ble kjøpt til standardiserte lys-feltinnstillinger (400 × forstørrelse). Captured farge jpeg-bilder ble konvertert til gråskala 8 bits bilder, da regionen av interesse leder funksjonen ble brukt til å skissere cytoplasmatiske områder, hver bestående av 5-15 celler. Uønskede kjernefysiske eller stromal elementer ble redigert bort. Områdene analysert i 4 matchet sett med krypten epitel, primær CRC og levermetastaser var 11 for bunn krypten epitel, 10 for topp krypten epitel, 78 for total kolonepitelet, 84 for primær CRC, og 84 for metastatisk CRC. Ved hjelp av standard ImageJ innstillingene, enhetene målt for hvert område var tettheten verdi, samlet areal i kvadratiske piksler, gjennomsnittlig størrelse og område brøkdel. Tetthet verdier for krypten epitel, primær CRC og metastatisk CRC, normalisert per område størrelser, ble analysert ved hjelp av uparet t-test. En verdi på
P
0,05 ble ansett som statistisk signifikant [26]
kvantitativ real-time PCR (RTqPCR)
Total RNA fra paret slimhinnen og CRC prøvene ble. isolert med QIAzol (Qiagen, Hilden, Tyskland), behandlet med DNAase-en (Ambion), sjekket ved spektrofotometri og agarosegelelektroforese, og retro-transkribert med høy kapasitet DNA Arkiv Kit (Applied Biosystems), etter produsentens anvisninger. RTqPCR analyser ble utført i duplikat ved anvendelse av 96-brønners reaksjons optiske plater og en ABI 7500HT maskin (Applied Biosystems). Baseline forsterkning plottet verdier ble satt automatisk og terskler ble holdt konstant for å få normalisert syklustider og lineær regresjon data. Reaksjonsblandingen per brønn inneholdt 10 ul Strøm Syber Grønn (Applied Biosystems), 2,4 ul av primere (sluttkonsentrasjon 150 nM), 4,6 ul RNAase-fritt vann, 3 pl cDNA (60 ng). For alle forsøkene var den PCR-protokollen: denaturering ved 95 ° C i 10 min, deretter 40 sykluser ved 95 ° C i 15 sek og ved 60 ° C i 60 sek. Kvantifisering ble utført i forhold til
Cyklofilin product: [27] med ΔΔCT metoden. Validert RTqPCR primere, designet med Primer Express 3.0-programvaren, var:
Cyklofilin
, FW 5’TTTCATCTGCACTGCCAAGA3 «; RV5’TTGCAAAACACCACATGCT3 «;
IRS1
, FW 5’GCAACCAGAGTGCCAAAGTGA3 «RV5’GGAGAAAGTCTCGGAGCTATGC3»;
c-MYC
, FW5’CCACCACCAGCAGCGACT3 «, RV5’CAGAAACAACATCGATTTCTTCCTC3».
Cellekulturer
Modulation av IRS1 og av insulin /IGF1 aksen ble undersøkt i Caco- 2 og HT29 CRC cellelinjer, som under spesifikke dyrkningsforhold, gjennomgår spontan
in vitro
differensiering [22], [28], [29]. Caco-2, utviklet seg fra en primær CRC fjernet fra en 72 år gammel mann kaukasisk, MSI-stabil og bærer en inaktive
APC
punktmutasjon, med andre rammet av tap av heterozygositet (LOH), en missense mutasjon i
SS-catenin
ekson 5 (som ikke ser ut til å påvirke nedbrytning), og er villtype for
KRAS
,
BRAF
,
PIK3CA
og
PTEN product: [23], [30] – [32]. HT29, utviklet seg fra en primær CRC fjernet fra en 44 år gammel kvinne kaukasisk, er også MSI-stabil og bærer dobbelt treffe inaktivere
APC
mutasjoner (som fortsatt tillater begrenset ß-catenin fosforylering og ubiquitinering), samt som mutasjoner i
SMAD4
,
BRAF
,
TP53
, og
PI3KCA
, som koder p110α katalytiske subenheten av klassen jeg phosphatidylinositol 3-kinaser ( PI3K) [23], [31] (se også Katalog av somatiske mutasjoner i kreft, https://www.sanger.ac.uk/cosmic).
Caco-2 og HT29 celler ble hentet fra ATCC (ATCC-LGC Promochem, London UK). Caco-2-celler ble opprettholdt i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) med 10% føtalt bovint serum (FBS), L-glutamin (2 mM), penicillin (100 enheter /ml) og streptomycin (100 ug /ml) under en fuktet atmosfære med 5% CO2 ved 37 ° C. Celler ble sådd ut på 10 cm Petri-skåler og tillatt å vokse ved konfluens. Ved konfluens (betegnet som nulltidspunktet) Caco-2-kultur ble utført i DMEM med 20% FBS. Hele tidsforløpet var utført to ganger, og helcellelysater ble erholdt ved 3, 7 og 14 dager etter sammenflyting. HT29-celler ble opprettholdt i DMEM med 10% FBS og fikk vokse i tre (preconfluent), 7 (sammenflytende) og 14 (post-konfluente) dager, ved hvilken tid helcellelysater ble erholdt.
Western blotting
hele celle eller vev lysater hele ble fremstilt ved bruk iskald lyseringsbuffer (100 mM NaCl, 10 mM EDTA, 1% TritonX-100, 50 mM Hepes pH 7,9, 10 mM NaF, 4 mM natriumpyrofosfat, 2 mM Na3VO4) supplementert med proteasehemmere (1 mM phenylmethylsulphonylfluoride, 2 ug /ml aprotinin, 2 ug /ml leupeptin). Lysater ble fjernet ved sentrifugering (10 000 x g i 20 min), og proteininnhold ble bestemt ved Bradford-metoden. Femti mikrogram (ug) 50 av de totale proteinene ble løst under reduserende betingelser på 7,5% SDS-PAGE og overført til nitrocellulose forsterket. Membranen ble blokkert med 3% ikke-fettholdig tørrmelk i PBS med 0,01% Tween 20 i 1 time ved romtemperatur og deretter inkubert over natten med følgende primære antistoffer: anti-IRS1 kaninpolyklonalt (C-20, Santa Cruz), fortynnet 1:500; anti-tyrosin 632-fosforylert IRS1 (pIRS1 Tyr632) polyklonale antistoff (Santa Cruz), fortynnet 1:200; anti-ß-catenin monoklonalt (Ylem, Roma, Italia), fortynnet 1:50 eller anti-SS-catenin polyklonale (# 9562, Cell Signaling, Danvers, MA, USA), fortynnet 1:1000; polyklonale mot ß subenhet av InsR (InsRß) (C-19, Santa Cruz) fortynnet 1:200; polyklonale mot ß subenhet av IGF1R (anti-IGF1Rß, Cell Signaling Technology /Euroclone, Milano, Italia) fortynnet 1:800; anti-aktin monoklonalt (Sigma-Aldrich, Milano, Italia) fortynnet 1:10000. Membranen ble deretter vasket i PBS og inkubert i 1 time ved romtemperatur med det tilsvarende pepperrot-peroksidase-konjugert sekundært antistoff, fortynnet 1:2000 (GE Healthcare, Milano, Italia). Bundet antistoff ble påvist ved hjelp av forsterket kjemiluminescerende (ECL) metode (Pierce-Celbio, Pero, Italia). Kvantifisering av western blot-signaler (gjennomsnitt ± SE fra minst to uavhengige forsøk) ble det oppnådd analyse digitaliserte signaler med ImageJ programvare (https://rsbweb.nih.gov/ij/). Dataene ble normalisert for ß-aktin og uttrykt som prosent av maksimal verdi.
immunfluorescens
Caco-2 og HT29 celler dyrket på Dekk under forholdene som er beskrevet ovenfor, ble løst i metanol (-20 ° C) og inkubert med anti-P-catenin monoklonalt (BD Science, Franklin Lakes, NJ, USA), anti-IRS1 kaninpolyklonalt (C-20, Santa Cruz), fortynnet 1:50; og anti-pIRS1 (Tyr632) polyklonale (Santa Cruz), fortynnet 1:50. Kjerner ble farget med 4,6-diamido-to-phenylindole (DAPI, Sigma-Aldrich) og cellemembraner med hvetekim agglutinin (WGA, Sigma-Aldrich). Primære antistoffer ble visualisert ved bruk av geit-anti-mus-IgG fluorescein isotiocyanat-konjugert (Cappel, MP Biomedicals Europa, Illkirch, Frankrike) eller geite-anti-kanin-IgG-Texas-Red-konjugert (Jackson Immunoresearch Laboratories Europa, Newmarket, Suffolk, UK) for 30 min ved romtemperatur. Celler ble analysert ved hjelp av en Apotome Axio Observer Z1 invertert mikroskop (Zeiss, Oberkochen, Tyskland) er utstyrt med en AxioCam MRM Rev.3 på 40 × forstørrelse. Colocalization av fluorescens-signalene ble analysert med AxioVision 4.6.3 programvare. Bildeanalyse ble utført ved hjelp av Adobe Photoshop.
Elektronmikros
Celler ble løst i en blanding av 2% paraformaldehyde-2% glutaraldehyd i PBS (pH 7,4), post-fiksert i 1% osmium tetroxide i veronal-acetat-buffer (pH 7,4) i en time ved 25 ° C, beiset med 0,1% garvesyre i den samme buffer i 30 minutter ved 25 ° C og med uranyl-acetat (5 mg /ml) i 1 time ved 25 ° C, dehydrert i aceton og innebygd i Epon 812. Tynne snitt ble endelig undersøkt under et Philips CM10 transmisjonselektronmikroskop, etter post-farging med uranylacetat og føre citrate.
Resultater
IRS1 i CRC
Vi bestemmes av RTqPCR den konstituerende uttrykk for
IRS1 Hotell og av
c-MYC, etter nøkkelen WNT mål og effektor [17], i total RNA fra paret tykktarmsslimhinnen og CRC prøver (figur 1A). Fem CRC overuttrykt
IRS1
forhold til paret slimhinner. Totalt sett er mRNA nivåer av
IRS1
var i god overensstemmelse med de
c-MYC
.
Panel A viser histogrammer av den relative uttrykk for
IRS1
(til venstre) og
c-MYC plakater (høyre) transkripsjoner i sammenkoblede prøver av kreft-upåvirket tykktarmsslimhinnen (hvit) og CRC (svart), som bestemmes av kvantitativ real-time PCR (RTqPCR). Mucosa prøver ble satt lik 100% og normalisert til den relative ekspresjon av husholdningsgenet,
Cyklofilin
. Cancer prøver ble uttrykt i forhold til slimhinne og normalisert til den relative ekspresjon av husholdningsgenet. Parvis M1T1 til M4T4 og i M8T8, både
c-MYC Hotell og
IRS1
økning i CRC forhold til slimhinner, bare i M5T5 og M6T6
IRS1 Hotell og
c-MYC
uenig (
IRS1
:
P
= 0,05,
c-MYC
:
P
0,001, uparet t-test på middel for alle forskjeller, data ikke vist). Panel B viser Western blot analyse av IRS1, beta-underenheten av insulinreseptoren (InsRß), beta-underenheten av den insulin-lignende vekstfaktor-1-reseptor (IGF1Rß), ß-catenin og ß-aktin, som lasting kontroll, i den sammenkoblede colonic slimhinner og CRC prøvene vist i A (unntatt M6T6, som vev for western blot analyse var ikke tilgjengelig). Histogrammene i Panel C viser quantitations, etter normalisering for ß-aktin, av IRS1, InsRß, IGF1Rß og ß-catenin signaler. I forhold til paret slimhinner, er IRS1 uttrykt i CRC par M1T1-M4T4, sammen med InsRß, IGF1Rß og ß-catenin (IRS1:
P
= 0,017, InsRß:
P
= 0,044 , IGF1Rß:
P
0,001, ß-catenin:
P
0,001, uparet t-test på gjennomsnittet for alle forskjeller, data ikke vist). Spesielt de CRC som overuttrykt den IRS1, InsRß, IGF1Rß og ß-catenin proteiner også overexpressed
IRS1 Hotell og c-
MYC
mRNA.
For å utforske modulering av IRS1 og andre insulin /IGF sti komponenter, vi vurdert av western blot proteinnivåer IRS1, InsRß, IGF1Rß og ß-catenin i 7 av de 8 ovenfor anmeldte CRC tilfeller (som vev var tilgjengelig), og i parede colonic slimhinner og adenom prøver fra to urelaterte FAP-pasienter [33]. I den primære CRC de IRS1 protein nivåer reflekterte mRNA nivåer, er høyere i forhold til paret slimhinner, i 4 av 5 tilfeller som overuttrykt
IRS1 Hotell og
c-MYC
mRNA. Disse CRC også uttrykt InsRß, IGF1R, og ß-catenin, mens i andre tilfeller slimhinne nivåer av InsRß, IGF1R, og ß-catenin var lik eller over de av den parede CRC (Figur 1B-C). I de to FAP tilfeller IRS1 markert økning i adenom i forhold til slimhinner, sammen med InsRß, IGF1Rß og ß-catenin, og IHC viste diffus IRS1 i adenomer (Figur S1).
Vi videre undersøkt IRS1 protein uttrykk ved IHC i individuelt matchet parafininnstøpte deler av colonic slimhinner, primær og metastatisk CRC. Tjuefire tilfeller med paret primær CRC og levermetastaser, også inkludert kreft-uninvolved colonic slimhinnen, var tilgjengelig for analyse. Immunreaktive IRS1 var klart påvises i krypt epitel, såvel som i primære og metastatisk CRC (figur 2A-E). Primære og metastatiske svulster, sammenlignet med kolonepitelet, inneholdt høyere antall celler som uttrykker IRS1 (80,8 ± 6,2% for primære og 81,3 ± 6,6% for metastatisk CRC versus 59,1 ± 5,6% for kolonepitelet,
P
= 0,013 og
P
= 0,014, henholdsvis figur 2F). Tetthet verdier av piksler for IRS1, som kvantifiseres ved hjelp ImageJ programvare, ikke skiller mellom primære CRC og kolonepitelet, men var betydelig høyere i levermetastaser sammenlignet med CRC (
P
0,01) og kolonepitelet (
P
0,01) (tabell 1). Forskjeller i tetthetsverdier for IRS1 mellom kolonepitelet av bunnen og toppen krypten var ikke signifikant. Vi ytterligere utforsket patologiske korrelasjoner av IRS1 uttrykk i en serie av 163 primær CRC testet av IHC på TMA (tabell 2). Totalt 151/163 tilfeller (92,6%) var IRS1-positive. IRS1 uttrykk var ikke signifikant forskjellig i forhold til alder ved diagnose, kjønn, tumor plassering (høyre mot venstre colon), Duke etappe, og MSI status. Men CRC med høy /moderat differensiering var mer sannsynlig å vise høye prosenter av IRS1-positive celler enn dårlig differensierte tumorer (
P
= 0,001), mens CRC med mucinous /signet-ring fenotype var forbundet med fokal eller ingen IRS1 (
P
0,001). Dårlig differensierte CRC ofte manifestert atom flekker i tillegg til cytoplasma reaktivitet. Figur 3A-E eksemplifiserer IRS1 fargemønstre.
Panel A viser IRS1 farging i full lengde lengdesnitt av kreftfrem uninvolved colonic krypter. Paneler B-E er et eksempel på IRS1 farging i primær CRC (B-C) versus paret metastase (leverbiopsi kjerne, D-E). Begge viser diffuse cytoplasma IRS1, med mye sterkere immunfarging i metastatiske celler. Panel F viser histogrammer av de gjennomsnittlige prosenter av IRS1-positive celler i 24 tilfeller av matchende ikke-neoplastisk kolon epitel, primær CRC og metastatisk CRC (feilfelt gjennomsnitt ± SEM). Det var signifikante forskjeller mellom kolonepitelet (59,1 ± 5,6%) og primær CRC (80,8 ± 6,2%,
P
= 0,013 av uavhengige utvalgs t-test) og mellom epitel (59,1 ± 5,6%) og levermetastaser ( 81,3 ± 6,6%,
P
= 0,014). Forskjellen mellom primære og metastatisk CRC var ikke signifikant (
P
= 0,964).
Paneler A og B viser henholdsvis diffus cytoplasma IRS1 i ikke-mucinkjertler colorectal CRC, inkludert en moderat differensiert tumor, med sterk farging av kreftceller, og en dårlig differensiert tumor, med svakere og muligens også atom IRS1 (pilspisser). Paneler C-E viser en dårlig differensiert CRC med mucinous, for det meste signet-ring fenotype. Spesielt i den marginale område (én stjerne) beskrevet i panelet D, tumorceller med ikke-mucinous fenotype vis atom /perinukleær IRS1 (pilspisser), mens signet-ring celler som flyter i mucin (dobbel stjerne), detaljert i panelet E, gjøre ikke vis IRS1 farging.
som vist i tabell 3, som rapporterer Spearmans korrelasjon mellom IHC markører, IRS1 var positivt assosiert med Ki67 (
P
= 0,008 ), p53 (
P
= 0,032), membran (
P
= 0,001) og cytoplasma (
P
0,001) ß-catenin. Andre foreninger involvert cellemembranen ß-catenin, positivt korrelert med cytoplasmatiske ß-catenin (
P
0,001) og EGFR (
P
= 0,005), og cytoplasmatiske ß-catenin, positivt korrelert med kjernefysisk ß-catenin (
P
0,001), Ki67 (
P
= 0,002) og p53 (
P
= 0,009), mens kjernefysisk ß-catenin positivt korrelert med p53 (
P
= 0,049). Forutsigbart, ble en positiv korrelasjon funnet mellom Ki67 og p53 (
P
= 0,029).
Disse resultatene tyder på at høy IRS1 er assosiert med CRC kombinerer godt /moderat differensiert histologisk fenotype med immunhistokjemiske markører for dårlig prognose (uttrykk for Ki67, p53, og cytoplasmatiske ß-catenin).
IRS1 i Caco-2 polarisering
Caco-2 bærer en inaktivere APC mutasjon med andre rammet av LOH , men er kjent for å være negativ for mutasjoner i
KRAS
,
BRAF
,
PIK3CA Hotell og
PTEN product: [23], [31] (se også COSMIC, https://www.sanger.ac.uk/cosmic). Caco-2 celler er i stand til spontan differensiering, dokumentert av uttrykket av microvilli, enzymer og transportører som er karakteristiske for polariserte enterocytter og ved utvikling av tett veikryss, som i
in vivo
setting, er nødvendig for oppadgående migrering av krypten epitelceller mot slimhinneoverflaten [28], [29], [34]. IRS1 ekspresjon og aktivering ble analysert ved hjelp av western blot i Caco-2-kulturer i løpet av polarisasjon ved 3, 7 og 14 dager etter sammenflyting, i nærvær og i fravær av serum, sammen med ekspresjon av InsRß og IGF1Rß (figur 4A). Under begge kulturbetingelser redusert IRS1 ved dag 7, men øket deretter, med høyest ekspresjon ved dag 14. Spesielt, i både normale og serumfrie kulturer, InsRß resulterte svakt uttrykt ved dag 3 og en signifikant økning på dag 7, med maksimal ekspresjon hos dag 14. Omvendt, igjen under begge betingelser, IGF1Rß var høyest ved dag 3 og dramatisk redusert på dag 7 og 14. For å vurdere IRS1 aktivering, Caco-2-celler ved 3, 7 og 14 dager fra konfluens ble serum-sultet over natten og deretter stimulert med eller uten insulin (100 nM) eller IGF1 (10 nM) i 5 minutter. Totalt proteinlysatene (80 mikrogram) oppnås etter 5 min behandling ble løst og utslettet med anti-pIRS1 Tyr632 (figur 4G). IRS1 tyrosinfosforylering var relevant i dag 7 av polarisering og synes ikke å være modulert av eksogent insulin eller IGF1 (spor 4-6). Men på dag 3, bare eksogene IGF1 aktivert IRS1. Disse dataene antyder at IRS1 kunne mekle autocrinely-aktivert InsR signalering i polariserte celler (hvor IRS1 og InsRß er maksimalt uttrykt og IGF1Rß er lavest), og IGF1R signalering, aktiveres ved eksogene IGF, i pre-polarisert celler (hvor IRS1 uttrykkes ved lavere nivå og IGF1Rß og InsRß ved høyeste og laveste nivå, henholdsvis).
Panel A viser western blot analyse av IRS1, beta-underenheten av insulinreseptoren (InsRß), beta-underenheten av den insulin-lignende vekstfaktor-1-reseptor (IGF1Rß) og ß-aktin, som lasting kontroll, i Caco-2 celler på dag 3, 7 og 14 post-konfluens, dupliseres i fravær (-) og nærvær (+) av serum i kulturmediet. Histogrammene viser quantitations, etter normalisering for ß-aktin, av IRS1, InsRß og IGF1Rß signaler (betyr ± SE fra de to forsøkene). Under både kultur forholdene økt espression av IRS1 og InsRß er tydelig i polariserte celler på dag 14 (IRS1) og på dag 7 og 14 (InsRß), mens maksimal uttrykk for IGF1Rß oppdages bare på dag 3. Transmisjonselektronmikroskopi av Caco- 2-celler på dag 3 av den spontane polarisasjon tidsforløpet åpenbarer dannelse av elektrontette veikryss på toppen av de laterale membraner av tilstøtende celler (panel A, pil). Med utviklingen av polarisering, tett veikryss og desmosomes (paneler C-D, piler) og vedheft veikryss (panel D) blir tydelig som elektrontette plakater på tilstøtende side membraner på dager 7 og 14, henholdsvis. I tillegg trange flercellede klynger, med differensiering funksjoner, for eksempel intracellulær lumina rik av apikal børstesømmen (paneler E-F), bli tydelig på dag 14. Forkortelser: tj, tight junction; annonse, vedheft krysset; ds, desmosom. Panel G viser Western blot nivåer av tyrosin 632-fosforylert IRS1 (IRS1tyr632), og som lasting kontroll, ß-aktin, i serum-sultet Caco-2 celler unstimulated (-) og stimulert (+) med insulin (100 nM) eller IGF1 (10 nM). IRS1 tyrosin-fosforylering er aktuelt på dag 7 av polarisering, uavhengig av tilsetningen av eksogen insulin eller IGF1. Men på dag tre, avgjør bare eksogene IGF1 IRS1 fosforylering.
Transmission elektronmikroskopi av de Caco-2 kulturer dokumentert på dag 3 dannelsen av lokaliserte elektrontette områdene i nærheten av motsetningen mellom tilstøtende side plasma membraner, som er karakteristiske for å danne tett veikryss, og ved dag 14 tilstedeværelsen av komp intercellulære synaptiske komplekser, samt polarisasjonen av den absorptive apikale børstegrense (figur 4B-F). Totalt, bekreftet dette enterocytic polariseringen i løpet av kulturen tidsforløpet [28].
Immunofluorescensanalyse viste forskjeller i det subcellulære fordelingen av total IRS1 og av pIRS1 Tyr632 i løpet av Caco-2-kultur tidsforløp (figur 5). På dag 3 IRS1 immunolabeling var tydelig mindre intens enn ved dag 7 og 14, og er hovedsakelig lokalisert langs de laterale og basolaterale cellemembraner. Sammenslåing av SS-catenin og IRS1 bilder bekreftet colocalization av de to proteinene langs basolaterale membraner. På dag 3 farging av pIRS1 Tyr632 var forholdsvis svake og hadde en fordeling i likhet med den av den totale IRS1. På dag 7 økt pIRS1 Tyr632 og det meste så ut som punktformet flekk på toppen av overflateceller, tyder på lokalisering under plasmamembranen på den apikale siden. Total IRS1 forble hovedsakelig er lokalisert langs basolaterale membraner, sammen med ß-catenin. Spesielt, på dag 14 pIRS1 Tyr632 var begrenset til færre overflate celler, som imidlertid opptrådte sterkere merkede enn ved dag 7, med den typiske apikale plasmamembranen punktformet mønster (det lavere antall positive celler var i overensstemmelse med reduksjonen i pIRS1 Tyr632
