Abstract
Menneskelige utstillingen store variasjoner i sine metabolske profiler på grunn av forskjeller i genetiske faktorer, kosthold og livsstil. Derfor, for å detektere metabolske forskjeller mellom individer robuste analysemetoder er nødvendig. En protokoll ble fremstilt basert på bruk av flytende Chromatography- High Resolution massespektrometri (LC-HRMS) i kombinasjon med ortogonal hydrofil Interaction (HILIC) og omvendt fase (RP) væskekromatografi fremgangsmåter for analyse av urin metabolomet, som ble deretter vurdert som et diagnostisk verktøy for prostatakreft (en vanlig, men svært heterogen tilstand). LC-HRMS metoden ble funnet å være robust og utstilt utmerket repeterbarhet for oppholdstider ( ± 1%), og masse nøyaktighet ( ± 1 ppm). Basert på normaliserte data (mot kreatinin nivåer, osmolalitet eller MS totalt nyttige signaler /MSTUS) kombinert med veiledet multivariat analyse ved hjelp av Orthogonal Partial Least Square-diskriminant analyse (OPLS-DA), var vi i stand til å diskriminere urinprøver fra menn med eller uten prostata kreft med R2Y (cum) 0,9. I tillegg, ved hjelp av mottageroperatøren egenskaper (ROC) test, arealet under kurven (AUC) for kombinasjonen av de fire best karakteriserte biomarkør forbindelser var 0,896. De fire biomarkør Forbindelsene ble også funnet å signifikant forskjellig (P 0,05) mellom en uavhengig pasient kohort og kontroller. Dette er første gang en slik grundig test har blitt brukt til denne type modell. Hvis validert, gir den etablerte protokollen en robust tilnærming med et potensielt bredt program til metabolitt profilering av menneskelige biofluids i helse og sykdom
Citation. Zhang T, Watson DG, Wang L, Abbas M, Murdoch L, Bashford L, et al. (2013) Bruk av Holistisk væskekromatografi høy oppløsning massespektrometri Based Urin Metabolomics for Prostate Cancer Detection og biomarkører. PLoS ONE 8 (6): e65880. doi: 10,1371 /journal.pone.0065880
Redaktør: Irina U. Agoulnik, Florida International University, USA
mottatt: 30 januar 2013; Godkjent: 29 april 2013; Publisert: 18 juni 2013
Copyright: © 2013 Zhang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne erkjenne Scottish biovitenskap Alliance for støtte for massespektrometri utstyr. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft er den vanligste kreftsykdommen i den mannlige befolkningen i vestlige land. Prostatakreft er svært heterogen med svært varierende kliniske utfall: lat sykdommen har en tendens til ikke å utvikle seg selv over mange år mens aggressive (høy grad) sykdom ofte utvikler seg raskt til å resultere i metastaser som uunngåelig fører til tidlig død. I tillegg er det en betydelig begrensning i spesifisitet med dagens praksis ved anvendelse av serum prostata spesifikt antigen (PSA) måling som et diagnostisk verktøy. Det er derfor et stort behov for bedre diagnostiske og prognostiske tester for prostatakreft.
Utvikling bevis peker til bruk av svært allsidige metabolske veier i å fyre opp kreft [1] slik detaljert analyse av tumorassosiert metabolomet kan avslører nye biomarkører [2], [3]. Analyse av urin, plasma og /eller vevsprøver kan utføres med Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spektroskopi og /eller massespektrometri (MS) sammen med separasjonsteknikker som for eksempel væskekromatografi (LC) og /eller gasskromatografi (GC). Sreekumar
et al
. utført vilkårlige metabolomic profilering for prostatakreft ved hjelp av LC /GC-MS over tre forskjellige typer kliniske prøver (urin, plasma og vev). Over 1000 funksjoner ble oppdaget over de analyserte prøvene [4]. En seks-metabolitt profil ble foreslått å betegne høy risiko for kreft progresjon og ytterligere isotopfortynning GC-MS analyse identifisert sarcosine som en potensiell urin biomarkør for aggressiv prostatakreft. Skuffende, sarcosine som en (urin eller plasma) biomarkør i prostata kreft har ikke blitt støttet av flere uavhengige studier senere [5] – [15]. I tillegg er det kun en håndfull av disse studiene har forsøkt å utføre vilkårlige metabolittprofilering [6], [16], [17]. I disse påfølgende studier, -MS bruk av GC-MS eller differensial mobilitet analyse (DMA) ga enda mer begrenset dekning av metabolitter i forhold til studiet av Sreekumar
et al product: [4]. Derfor er det er et reelt behov for å utvikle en robust metodisk og analytisk plattform for å legge til rette for videre arbeid i global profilering av metabolomet i prostata kreft biomarkører [18].
Urin har noen fordeler for metabolomics studier siden det har en høy overflod av metabolitter, lavt innhold av protein, oppsamles en ikke invasiv og krever minimal prøvepreparering før analyse. Nylig har anvendelsen av høy oppløsning (HR) MS basert urin metabolomics vunnet popularitet i studiet av kreftdiagnose og biomarkører, spesielt i kombinasjon med ulike LC teknikker. HRMS viser økt dekning av metabolitten profil enn andre metoder, og evnen til å identifisere potensielle biomarkører Forbindelsene [19] – [24]. Innføringen av hydrofil Interaction Liquid Chromatography (HILIC), hvor festemekanismen er vinkelrett på den av reversfase (RP) væskekromatografi, og har en passende separasjonsplattform for de mange sterkt polare metabolitter i urin [25]. I en fersk studie av blære og nyre kreft biomarkører [22], kombinert multivariat analyse (MVA) og Orthogonal Partial Least Square-diskriminant analyse (OPLS-DA) av sammenslåtte data fra RP og HILIC LC-HRMS viste 100% nøyaktighet i segregerende kreft og friske riktig.
data~~POS=TRUNC normalisering er ansett som et viktig men unstandardised skritt i menneskelig urin analyse [26]. Principal Component Analysis (PCA) resultater plott kan gjøres helt forskjellig bare avhengig av normaliseringsfremgangsmåten som brukes, og verdien av kandidat biomarkører kan bli brutt ved å velge en «feil» indre komponent som referanse. Signalet /nivået av kreatinin og total ionestrøm (TIC) blir ofte brukt som normaliseringsfaktorer i LC-HRMS basert urin metabolittprofilering studier [4], [20], [22], [24]. Warrack
et al
innført en ny normalisering strategi basert på MS Total nyttige signaler (MSTUS) som hadde oppmuntrende korrelasjon til de data basert på normalisering til urin osmolalitet og anbefalt ved bruk av minst to forskjellige normalisering metoder for å sikre statistisk signifikant endringer i metabolitt profil [27].
en protokoll ved å bruke en kombinasjon av GC-MS og LC-MS for å utføre metabolske profilering av plasma og serum ble nylig beskrevet [28]. Til forskjell fra urin er det ikke nødvendig å normalisere dataene for blod avledet prøver i metabolomics studier. Selv om omfattende protokoller ved hjelp av GC-MS og LC-MS for å profilere urin metabolomet har også blitt rapportert [29], [30] ingen av dem har diskutert eller forhold normaliserings metoder til noen stor grad. I tillegg er metabolitten dekningen ved hjelp av GC-MS nødvendigvis begrenset til flyktige komponenter. Kombinasjonen av to ortogonale LC metoder for metabolomic profilering har kun blitt benyttet i perioden etter protokollen beskrevet i referanser 28 og 30. Basert på våre tidligere arbeid [25], vi har ytterligere optimalisert vår metodikk og analyse rørledning, og profilert urinprøver fra pasienter med prostatakreft og kontroll urinen ved LC-HRMS ved hjelp av ortogonale separasjonsmetoder. Effekten av tre forskjellige normaliserings metoder i dataanalysen ble demonstrert. Ved å bruke resultater fra kliniske tester den diskriminerende evne metabolomic profilering av urin i forhold prostatakreft ble evaluert ved å bruke begge OPLS-DA modeller og spesifikke biomarkører. Studien ble ledet av en standard for rapportering av diagnostisk nøyaktighet (Stard) kriterier [31] og evaluering sjekkliste kan finnes i (Fil S1).
Materialer og metoder
Kjemi og materialer
HPLC grade acetonitril (ACN) ble kjøpt fra Fisher Scientific, UK. HPLC-kvalitet vann ble laget med en direkte-Q tre ultrarent vann System fra Millipore, UK. AnalaR karakter maursyre (98%) ble oppnådd fra BDH-Merck, UK. Ammoniumkarbonat og ammonium acetat ble kjøpt fra Sigma-Aldrich, UK.
Prøvetaking
Alle prøvene studert ble oppnådd med passende skriftlig samtykke fra pasientene. Innsamling av prøver ble godkjent av institusjonelle etikk vurdering bord (Joint The Chinese University of Hong Kong – New Territories East Cluster Klinisk forskningsetiske komité). Detaljer om pasientrelaterte kliniske opplysninger inkludert prostata kreft parametere er beskrevet i Tabell 1.
Prøvepreparering
Urinprøvene ble lagret ved -30 ° C og tint ved romtemperatur før forberedelse for LC-MS-analyse. For analyse ved hjelp av HILIC betingelser ble 200 ul urin grundig blandet med 800 ul acetonitril, etterfulgt av sentrifugering ved 3000 omdreininger per minutt (RPM) i 5 minutter; 800 ul supernatant ble deretter overført til en LC ampulle. For RP betingelsene 200 ul urin ble fortynnet med 800 ul vann i et LC hetteglass. Den sammenslåtte prøve ble fremstilt ved å samle 100 ul av urin fra hver prøve som så ble behandlet som ovenfor.
Måling av kreatinin og osmolalitet
50 pl av fortynnede prøver og fremstilt kreatininnivåene standardløsninger ble grundig blandet med 100 pl av kreatinin deteksjonsreagensen (Enzo Life Sciences, UK) i en 96-brønns plate og absorbansen ble avlest ved 490 nm ved anvendelse av en Spectra Max M5 fra Molecular Devices. Konsentrasjonene av kreatinin i testprøvene ble beregnet ved anvendelse av en 7-punkts kalibreringskurve hvor hvert punkt ble målt i duplikat. Etter kalibrering med standardløsninger (Vitech Scientific Ltd, UK), frysepunktsnedsettelse måling for hver prøve ble utført med en osmometer (Advanced Micro, modell 3300) for å kunne fastslå osmolaliteten.
LC-MS datainnsamling
Prøver ble tilfeldig plassert i autosampler skuffen og LC-MS forsøket ble utført på en Accela 600 HPLC-system kombinert med en Exactive (Orbitrap) massespektrometer fra Thermo Fisher Scientific (Bremen, Tyskland). En ZIC-file kolonne (150 x 4,6 mm, 5 mm) og også en ACE C18-AR-kolonne (150 x 4,6 mm, 5 mm) (HiChrom, Reading UK) ble ansatt for HILIC og RP separasjoner hhv. De mobile faser anvendt i HILIC Betingelsene var 20 mM ammonium-karbonat-buffer (pH 9,2) og ren ACN Under RP betingelser 0,1% volum /volum maursyre i vann og 0,1% volum /volum maursyre ble benyttet som mobile faser. De HILIC og RP LC utdrivning gradient profiler og parameterinnstillingene MS ble beskrevet i vår tidligere studie [25]. Den selektive MS
2 fragmentering av potensielle biomarkører ble utført ved hjelp Kollisjon Induced Dissosiasjon (CID) ved 35 V ved hjelp av en takstmann HPLC system kombinert med en LTQ-Orbitrap massespektrometer fra Thermo Fisher Scientific (Bremen, Tyskland).
LC-MS databehandling av MZMine 2.10 [32]
Den rå data ble delt inn i en enkelt ESI positive og negative datasett, og også konvertert til mzML format ved hjelp ProteoWizard. Prosedyren og innstillingene for hvert trinn brukes i MZMine 2.10 er beskrevet i File S2. Her strategien med å bruke data fra samleprøver for å filtrere ut tekniske og urelaterte biologiske variasjoner fra datasettet ble innført. De fem samleprøver ble fremstilt sammen med testprøvene og de ble målt som kvalitetskontroller (QCS) periodisk gjennom hele LC-MS eksperiment. En av dem ble injisert tre ganger og resten ble injisert bare én gang, derfor syv sett med QC data ble anskaffet for å vurdere systemets stabilitet og til å generere en repeterbarhet filter. Funksjonene ikke presentere i alle 7 QC datasettene ble fjernet fordi de enten var forårsaket av variasjon av prøvepreparering, eller ved LC-MS-system under datainnsamling. Basert på denne filtrert topp liste, ble dataene for de enkelte testprøvene justert og alle funksjoner som ikke samsvarer med samleprøve topp liste ble fjernet. Funksjoner innenfor QC datasettet inngår bare hvis de blir observert i 75% av prøvene. Til slutt ble de funksjoner med et relativt standardavvik (RSD) for toppareal mindre enn 25% i løpet av de QCs brukes til videre analyse av data.
Normalisering
For kreatinin eller osmolalitet normalisering metoden, toppområdet av hvert trekk i en prøve ble skalert til kreatinin konsentrasjon eller osmolalitet av prøven. For MSTUS metoden under hver kombinasjon av LC tilstand og ESI-modus, ble topparealene for alle funksjoner som forble gjennom de tre filtrene ble summert opp og deretter erstattet av sine prosenter av den totale verdien.
Multivariate /statistisk analyse
Simca-P 13 (Umetrics, Sverige) ble brukt til å utføre alle MVA. Før PCA og OPLS-DA, dataene var en dårlig sentrert og enhet varians (UV) skalert. Pareto skalering ble også prøvd, men de modellene som genereres ble dominert av noen få funksjoner med store normaliserte verdier (f.eks kreatinin og dimer av urea). Dermed vurderer det faktum at i å søke etter biomarkører alle funksjoner er biologisk lik og at det meste av støy ble fjernet av filtrene, ble UV skalering brukt. P-verdiene ble beregnet ved de to hale Student
t
test (Microsoft Office 2010). ROC Testen ble utført av IBM SPSS statistikk 21.
Resultater og diskusjon
LC-HRMS metode evaluering og validering
vilkårlige metabolomic profilering basert på to ortogonale LC separasjonsmetoder var utførte [33]: A ZIC-file-kolonne med en mobil fase pH-verdi på 9,2 for den HILIC fremgangsmåte og en ACE C18-AR-kolonne med en mobil fase pH-verdi på 2,6 for RP-metoden, referert heretter som «ZIC-file» og » henholdsvis RP «. For å undersøke komplementaritet av de to ortogonale LC fremgangsmåter noen standard metabolitter ble målt sammen med prøvene i henhold til LC hver betingelse. Som vist i vår forrige undersøkelse alanin og p-alanine kan skilles etter ZIC-file forhold [25]. Her en klar separasjon av isomerer sarkosin, som tidligere var foreslått som markør prostatakreft, alanin og β-alanin ble også oppnådd i henhold til ZIC-file betingelser, men de har alle eluert ved kolonnens dødt volum under RP betingelser (figur S1 og S2 i File S3). LC-HRMS rådata ble behandlet med 2,10 MZMine som beskrevet i den eksperimentelle delen. Tabell 2 viser antall funksjoner igjen etter hvert filter og deres prosenter basert på opprinnelig oppdaget funksjoner. Den sammenslåtte prøve repeterbarhet filter effektivt fjernet mer enn 75% av oppdaget funksjoner, hvorav de fleste stammer fra LC-HRMS system støy og bakgrunnssignaler. Numrene på funksjoner ble beskjedent redusert gjennom den 25% mangler filter, som fjernet biologiske forbindelser som var meget variabel i prøvene. Gjennom peak området RSD filterfunksjoner med store topparealvariasjoner kan fjernes. Slike funksjoner er vanligvis på grunn av lave MS svar eller dårlig kromatografiske peak former. Omtrent 5200 funksjoner i totalt overlevde disse tre filtere og ble slått sammen som en helhetlig datasett for multivariat og statistisk analyse.
Stabiliteten av LC-HRMS system ble verifisert ved å sammenligne de nøyaktige masser (± 3 ppm) og retensjonstider (± 0,5 min) av forbindelsene som er tilstede i urinen mot autentiske standarder: 42 og 51 funksjoner ble tilpasset til de standarder under ZIC-file forhold i ESI henholdsvis positive og negative modi, og 39 og 34 funksjoner ble tildelt i henhold RP forhold. Systemet stabilitet ble overvåket med hensyn til variasjon i oppholdstiden, toppareal og masse nøyaktigheten av disse identifiserte metabolitter i 7 QC prøvene under hvert LC-HRMS tilstand (Fil S3). Etter MZMine behandling, de fleste av de vanlige matchet metabolittene som er tilstede i prøvene viste ekstremt lave RSDs for masse nøyaktighet (mindre enn 1 ppm) og oppholdstid (mindre enn 1%). Bare noen få av dem viste store variasjoner for toppområdet ( 25%) på grunn av deres lave MS svar; disse ble ekskludert av 25% RSD filter. Etter å ha utviklet datafiltrering metodikken disse filtrene ble deretter anvendt på data fra 30 pasienter og 30 kontrollprøver. Funksjonene gjenværende etter bruk filtrene ble deretter viderebehandles.
Normalisering og multivariat /statistisk analyse
Det er for øyeblikket ingen enighet om normalisering metoden (e) i urinen metabolomics studier. Vi søkte tre uavhengige normaliseringsmetoder og tilsvarende PCA rille tomter er vist i Figur 1. Gitt mangfoldet i livsstil mellom fag, uten tilsyn MVA ikke skille prøvene fra kreft og kontrollgrupper. I tillegg kunne observeres noen likhet mellom de mønster strukturene som er reflektert av de helt forskjellige retninger og avstander (vektorer) på grunnlag av en prøve (formet som diamant) referert til tre andre prøver (formet som fire-punktsstjerne, 5-punktsstjerne og omvendt trekant) i hvert mønster. Summen av den første og den andre hovedkomponentene er mindre enn 30% for hver modell som reflekterer den dårlig korrelasjon mellom variablene (funksjoner) i datasettet. Viktigere, i alle fire PCA modeller, de 7 QC funksjoner (i grønt) er nær hverandre som en klynge i midten av mønsteret, noe bekrefter utmerket system stabilitet i hele. Som en overvåket MVA metode, OPLS-DA var i stand til å skille studiegrupper i henhold til forhåndsdefinerte biologiske kriterier [22], [34]. I denne studien som test satt 5 kreft fag inkludert tre på et tidlig stadium (T1N0M0) og 5 kontroller ble tatt ut fra hver gruppe ble sikret OPLS-DA-modeller bygget opp ved hjelp av de resterende 25 prostatakreft og kontrollprøver som et treningssett ved hjelp av data normalisert ved hjelp av de tre ulike normaliseringsmetoder og un-normaliserte data. Figur 2 viser diskrimineringen av treningssettet, og prediksjon av testsettet ved å anvende OPLC-DA til un-normaliserte data og dataene normalisert ved hjelp av tre forskjellige metoder. Veldig klare separasjoner mellom to gruppene ble oppnådd for opplæring satt i modellene generert med data etter normalisering til kreatinin og MSTUS. Bare en cancer, og en kontrollprøve krysset over skillelinjen i modellen generert med osmolaliteten fremgangsmåte og rådata. Verdien av R2Y (cum), noe som forklarer den diskriminerende makt OPLS-DA-modellen, er mer enn 0,9 med kreatinin og MSTUS normalisering og 0,8 med osmolalitet normalisering, men mindre enn 0,7 med un-normaliserte data. Verdien av Q2Y (cum), som er beregnet ved 7-mappe kryssvalidering og i stand til å indikere den prediktive kraft av modellen, er omtrent 0,3 for alle metoder. Selv om denne verdien ikke er så høy som forventet ( 0.5) for alle prøvene i testsettet ble korrekt forutsagt for alle tre normaliseringsfremgangsmåter, bortsett fra en i det MSTUS basert modell. Det er interessant å merke seg at i motsetning til PCA-modellene OPLS-DA modeller med ulike normaliseringsfaktorene viser lignende mønster strukturer og dette også tilfelle med ikke-normaliserte data. De vektorer fra den samme prøven til de tre andre er ganske like i enhver OPLS-DA-modellen (figur 2). Basert på ovennevnte observasjoner virker det som normaliseringsstrategi i stor grad påvirker utfallet av unsupervised MVA men ikke overvåket. Imidlertid, ved å fjerne avviket av metabolitten konsentrasjon introdusert av urinvolum variasjon, forbedrer ytelsen normalisering av veiledet MVA. Verdien av Variable betydning for Projection (VIP) indikerer impact factor av variabelen i modellen. Vanligvis en variabel anses viktig for modellen hvis VIP verdien er 1. Totalt 406 unike funksjoner med VIP-verdier 2 ble valgt ut fra alle tre OPLS-DA-modeller. Det ble funnet at 76 var vanlig i alle tre modeller, 89 var i alle to modellene og 241 var fra bare en modell (figur S1 i File S4). Disse funksjonene vanlige i tre modeller viste de høyeste gjennomsnittlige VIP verdier i forhold til de vanlige i to eller bare i en modell, og de inkluderte 80% av topp 10 funksjoner i VIP verdi fra hver modell og de resterende 20% kan bli funnet i gruppe som var vanlig i to modeller. Som anbefalt av Warrack
et al product: [27] for å sikre påliteligheten av biomarkører vi fokusert på VIP-funksjoner som var vanlig i tre normaliseringsmetoder. Denne gruppen inkluderte mange funksjoner som viste de samme m /z-verdier under forskjellige LC forhold eller ble påvist i både positive og negative ion moduser med samme oppholdstid. Denne observasjonen tyder på at disse funksjonene kan bli tildelt enkelt metabolitter som ville gjøre dem mer pålitelig som ekte biomarkører. Uparet Student
t
og ROC-tester ble utført for disse funksjonene på tvers av alle prøvene og de beregnede P-verdier og arealet under kurven (AUC) oppnådd ved ROC er vist i Tabell S1 i File S4. Som forventet alle av dem viste høy AUC ( 0,63) og lav P-verdier ( 0,05) og deres forhold mellom kreft og kontrollprøvene er også svært like hverandre under forskjellige LC-HRMS betingelser med forskjellige normaliseringsfremgangsmåter som støtter påliteligheten av resultatene. Noen andre funksjoner kan også bli betraktet som potensielle biomarkører på grunn av betydelige statistiske resultater selv om de var bare til stede i en enkelt LC-HRMS tilstand. Den diskriminerende evne sarcosine for prostatakreft ble også evaluert (tabell S1 i File S3); i tråd med flere tidligere rapporter, fant vi ingen signifikant forskjell i sarcosine nivå mellom kreft og kontrollgrupper [6], [8] -. [10], [12], [15]
kreft fag er merket i rødt, styrer i blått og QCs i grønt. Vektoren fra diamant til 5-punkts stjerne er merket i svart, til 4-punkts stjerne i grønt og omvendt trekant i lilla. (A-C) Normalisering til henholdsvis kreatinin, MSTUS og osmolalitet. (D) rådata uten normalisering.
Kreft fag er formet som kvadrater og kontroller som sirkler. Treningssettet er merket i fylt rødt og testen satt i uthulet blått. De fire utvalgte fag og vektorene er samme form og farge som Figur 1.
Identifisering av en potensiell biomarkør panel
Alle funksjonene som brukes i MVA ble søkt etter nøyaktig masse med en toleranse vindu mot en in-house metabolitt bibliotek [25] 3 ppm. 1673 og 1159 funksjoner ble putatively identifisert som metabolitter eller relaterte signaler henhold ZIC-file og RP forhold henholdsvis. Identifikasjons resultater i Excel-format kan lastes ned fra vår hjemmeside: https://www.metabolomics.strath.ac.uk og folk som ønsker å sende aksjen rådata er velkommen til å kontakte oss. De biomarkører i File S4 ble vellykket tildelt ekte metabolitter, men noen av dem med flere isomerer. For å sluttføre identiteten til biomarkører en MS
2 Forsøket ble utført. En funksjon som er nevnt i tabell S1 i File S4 (145,062 m /z i ESI negativ og 147,076 m /z i ESI positiv modus) ble tildelt formel C
5H
10N
2o
3 med masse feil mindre enn 1 ppm. Tre isomerer kan tildeles denne formelen i HMDB. Dette er glutamin, ureidoderivat isosmørsyre og alanylglycine. Som kan blitt sett i figur 3A det interessant trekk refererer til Peak B i de utpakkede ionekromatogrammer. Ved MS
2 Analyse toppene A og C viste de samme fragmenter mønster som kan forklares som vist i figur 3B, og ble identifisert som glutamin ved å sammenligne med en standard MS /MS-spektrum i HMDB. Peak B viste en helt annen fragmenteringsmønster og tilsvarer ureido isosmørsyre fra tolkningen av MS
2-spektra. Ingen standard MS /MS spekteret ble funnet i noen offentlig database. Fragmenteringen synes å være styrt av ureido-gruppen i molekylet (figur 3B). Fraværet av en fri amingruppe reduserer polariteten av molekylet som forklarer den motsatte elueringen for å at glutamin under de to ortogonale LC-betingelsene (figur 3A). Til slutt, ved å sjekke rådata Peak A ble identifisert til å være på grunn av en i-kilde-fragmentet av a-N-fenylacetyl-L-glutamin som er en meget rik komponent i human urin. Alanylglycine kan tilsvare den lille toppen før og etter Peak B i henhold ZIC-file og RP forhold hhv. Men sitt signal på MS nivå 1 var for svak til å skaffe pålitelig MS
2 fragmentering. De endelige potensielle biomarkører og deres identiteter, inkludert MS
2 fragmentering data, er vist i File S5. Flere potensielle biomarkører ble identifisert under ZIC-file forhold enn etter RP forhold. Det var interessant å merke seg at det var noen biomarkører identifisert fra mat f.eks stachydrine og 3-hydroxystachydrine. Deres pålitelighet /autentisitet som biomarkører ble naturlig mistenkt.
Ekstraherte ionekromatogrammer under 4 forskjellige LC-HRMS forhold (A) og tolkningen av deres MS
2 fragmentations (b).
fra vår litteraturgjennomgang for kreftdiagnostikk ved metabolomics ingen studier har vurdert diskriminerende evne foreslåtte biomarkører i et enkelt stykke papir ved å teste prøver samlet helt uavhengig av den opprinnelige studien. Vi har gjennomført analyser av urinprøver innhentet fra 30 ekstra prostatakreftpasienter og sammenlignet data mot kontrollprøvene som ble analysert tidligere. Basert på den optimale metoden som er identifisert ovenfor i disse 60 prøvene ble sammenlignet med bare under ZIC-file betingelser og dataene ble normalisert mot kreatininkonsentrasjonen. I sammenligningen mellom kontrollene og uavhengig innsamlede prostatakreft prøvene var 14 av 33 biomarkører under 0,05 P-verdi terskel inkludert ureidoderivat isosmørsyre som hadde nesten identiske statistiske resultatene i både ES1 positive og negative moduser (Tabell 3). Noen av mat metabolittene viste ikke signifikant forskjell mellom kreft og sunne grupper. Fire av 14 validerte biomarkører ble identifisert med selvtillit som ureidoderivat isosmørsyre, indolylacryloyglycine, acetylvanilalinine og 2-oksoglutarat alle som ikke har blitt rapportert i forrige metabolitten profilering studier for prostatakreft.
Basert på de totale 90 pasienter (60 kreft vs 30 kontroller) den diagnostiske makt for prostatakreft ble evaluert av en ROC test for hver av dem, så vel som for deres samlede makt. Topparealet var UV skalert og dersom nivået av den biomarkør var høyere i kreft-gruppen enn i den friske gruppe, vil det bli behandlet som positiv effekt og lavere som negativ påvirkning. Den genererte AUC-verdien for de kombinerte biomarkører var 0,896 og sensitivitet og spesifisitet ble også forbedret på den beste cut-off punkt i forhold til andre enkelt biomarkører (figur 4. Den diagnostiske effekt kan forbedres ytterligere ved å inkludere flere enkelt biomarkører, men på grunn av deres antatte identifikasjon de ikke ble inkludert i kombinasjonen. Totalt sett er bruken av den kombinerte biomarkør panelet kan sammenlignes med bruk av PSA-testing (AUC 0,94). et fremtidig avgrensning, slik enhet kan være av klinisk bruk, enten i isolasjon eller i kombinasjon med PSA selv. på grunn av begrensning av antall fag målt i denne studien, og usikkerheten om betydningen av noen viktige biomarkører valgt fra over tusen funksjoner, ytterligere validering av panelet og de spesifikke biomarkører vil bli utført med flere fag og dataene vil være offentlig tilgjengelig på våre nettsider. https://www.metabolomics.strath.ac.uk
de fire identifiserte biomarkers er ikke knyttet på en tydelig måte selv om individuelt de har noen interessant biokjemisk bakgrunn som biomarkører for andre medisinske tilstander. Ureidoisobutyric syre (UIBA) er godt etablert som en urin markør av en medfødt feil i metabolismen grunn ureidopropionase mangel der nivåene er forhøyet [35]. I dagens tilfelle nivåene er lavere hos personer med prostatakreft. UIBA er en metabolitt av DNA basen tymidin. UIBA er også et DNA-nedbrytningsprodukt som stammer fra oksydativ skade av tymidin og slike skadede baser er fjernet fra DNA ved reparasjonsenzym-DNA glycosylase [36] – [38]. Unnlatelse av å fjerne slike rester kan føre til mutasjoner som dannes i løpet av replikasjonen på grunn av feil baseparring med det skadede området. Lavere nivåer av UIBA kan peke til reduserte priser av excision reparasjon.
Indoylacroylglycine (IAG) er foreslått som en markør for autisme hos barn. Dens opprinnelse er uklar, selv om det er blitt foreslått at det er produsert av metabolsk omdanning av tryptofan ved tarmmikroflora. Men det har blitt etablert at dets nivåer svinge i human urin i henhold til tid på året og høyere nivåer kan være knyttet til økt eksponering for UV-lys. I denne forbindelse er det analogt med urocanic syre som produseres fra histidin som respons på UV-stråling [39].
N-acetylvanilalinine (AVA) har blitt overvåket i urinen for påvisning av en sjelden medfødt feil i metabolismen på grunn av aromatisk aminosyre decarboxylase (AAD) mangel [40]. I gruppen av biomarkører presentert i tabell 3 er det en uidentifisert markør (268,083 m /z, negativ modus), som i likhet AVA er sterkt forhøyet i prostatakreftpasienter. Denne markøren er forskjellig i elementær komposisjon av ett oksygenatom fra AVA tyder på det kan være hydroksylerte AVA.
Konklusjoner
Den aktuelle studien har etablert en enkel robust protokoll for screening av urin for biomarkører ved hjelp av ortogonale LC metoder i forbindelse med HRMS. En datauttrekk protokoll basert på MZmine ble etablert for å fjerne tekniske og biologisk ikke-relaterte variasjoner. Påføring utviklet metoden vi vellykket utført en forstudie på urin metabolomics for diagnostisering av prostatakreft og biomarkører. Sammenlignet med tidligere studier mye mer omfattende metabolittprofilering ble oppnådd ved å bruke to ortogonale LC metoder kombinert med HRMS som ga en større mulighet til å avdekke flere potensielle biomarkører.
