Abstract
Våre tidligere forskningsresultater viser at både Ras homolog familiemedlem C (RhoC) og IQ-domene GTPase aktiverende protein 1 (IQGAP1) var over-uttrykt i mage kreft vev og celler, men deres rolle i tumorigenensis har ikke blitt adressert tydelig. Heri vi rapporterte spredning stimulerende effekten av RhoC og IQGAP1 på mage kreftceller og samspillet mellom to proteiner i å regulere spredning av mage kreftceller. Plasmider og virale konstrukter som koder for mål-siRNA og DNA ble anvendt for å endre ekspresjon av RhoC og IQGAP1. MTT-metoden og BrdU-inkorporering assay ble anvendt for å analysere effekten av RhoC og forskjellige strukturer av IQGAP1 på proliferasjon. Proteinnivåer av IQGAP1 og RhoC i cellelinjer ble påvist ved Western blotting. Immunfluorescens og Co-Immunoutfellingsunder analyser ble brukt for å undersøke lokalisering og bindende mellom RhoC og IQGAP1. Resultatene viste at RhoC, IQGAP1 og det C-terminale fragment av IQGAP1 signifikant stimulert proliferasjon av magekreftceller, og forbedret ekspresjon av cyclin E og cyklin D1. I motsetning til reduksjon av endogent IQGAP1 eller RhoC ved siRNA dempes celleproliferasjon. Uttømming av IQGAP1 ekspresjon av siRNA blokkert i betydelig grad den proliferative aktivitet av konstitutivt aktiv RhoC, mens RhoC tie ved siRNA hadde ingen virkning på IQGAP1-indusert proliferasjon i magekreftceller. Co-immunoprecipitation og immunfluorescens analyser viste at RhoC og IQGAP1 bundet hverandre. I konklusjonen, våre resultater tyder på at RhoC stimulerer spredning av mage kreftceller gjennom rekruttering IQGAP1 som en effektor
Citation. Wu Y, Tao Y, Chen Y, Xu W (2012) RhoC Regulerer spredning av Gastric kreft~~POS=TRUNC celler~~POS=HEADCOMP gjennom interaksjon med IQGAP1. PLoS ONE 7 (11): e48917. doi: 10,1371 /journal.pone.0048917
Redaktør: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, Østerrike
mottatt: 26 juni 2012; Godkjent: 02.10.2012; Publisert: 07.11.2012
Copyright: © 2012 Wu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av Specialized forskningsfond for ledende personell Program i Jiangsu University (Nei. 11JDG114) og Natural Science Foundation National of China (Nei. 31040002). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Rho GTPases kan indusere viss intracellulær signaloverføring og påvirke ulike cellulære aktiviteter, herunder omorganisering av aktin cytoskjelettet, gentranskripsjon, overlevelse og spredning [1], [2]. Selv om tre Rho isoformer, RhoA, RHOB, og RhoC, utstillings mer enn 85% aminosyre identitet, jf de forskjeller i funksjon i celler [3]. RhoA og RhoC proteiner har vist seg å ha en positiv rolle i spredning og ondartet transformasjon [4], [5], [6], mens rollen til RHOB i disse prosessene synes å være mer divergerende [7], [8]. De fleste av studiene viste at RhoC hadde flere funksjoner i metastase, iscenesetter handlingen av flere nedstrøms effektorer, nedbrytning og gjenoppbygging av den ekstracellulære matriks (ECM). Men det gjenstår en del uenighet om rollen til RhoC ved regulering av celleproliferasjon [9], [10], [11], [12]. Resultatene fra Pile laboratorium indikerte at RhoA og RhoC siRNA representerer kraftige verktøy for å hemme kreftcelle spredning, invasivitet og angiogenese både
in vitro Hotell og
in vivo product: [9]. Sun
et al
fant at intratumoral injeksjon av RhoA eller RhoC siRNA til hårløse mus kan hemme tumorvekst [13]. I kontrast, Faried
et al
rapportert at RhoA fremmer tumorvekst mer enn RhoC, mens RhoC induserer fjernmetastaser i forhold til RhoA [11], i samråd med de observasjoner av Clark og medarbeidere [14]. En studie av Ikoma og kolleger viste at RhoC ikke påvirke tumorvekst, men forbedrer metastatisk natur lungekreft ved å stimulere cellemotilitet [10]. Derfor er videre studier for å identifisere rolle i å regulere RhoC biologiske aktiviteter av tumorceller.
IQ-domene GTPase-aktiverende proteiner (IQGAPs) er viktige regulatorer av cellulære prosesser som inkluderer cytoskeletal rearrangementer i cellemigrering , spredning og cytokinese [15], [16], [17]. IQGAP1 er ett av medlemmene av de tre relaterte pattedyr IQGAPs og endring i intracellulær IQGAP1 ekspresjon eller funksjon har rapportert å endre celleaktiviteter [17], [18], [19], [20]. Som et stillas protein binder IQGAP1 flere proteiner, slik som onkogener β-catenin og Src, tumor suppressor E-cadherin og Rho GTPases Cdc42 og Rac1, og bevirker endring av cellulære oppførsel, spesielt for kreftceller. Vår tidligere studie viste at de høyere uttrykk for RhoC og IQGAP1 i magekreft vev ble signifikant omvendt korrelert med differensiering av mage kreftceller [21]. Videre protein nivåene var også relevant for spredning og migrering av kreftceller. Derfor hypoteser vi at både RhoC og IQGAP1 kan spille viktige rolle i kreftcelletransformasjon og proliferasjon, og det er en mulig sammenheng mellom dem. I den foreliggende forskning, studerte vi påvirkning av RhoC og forskjellige strukturer av IQGAP1 på kreftcelleformering og cellesyklusrelaterte proteiner. Vi har også undersøkt forholdet mellom de to molekyler ved felles anvendelse av siRNA forstyrrelser og viral infeksjon teknikk.
(A) Western blot-analyse av RhoC ekspresjon i BGC-823-celler infisert med Ad-RhoC-V14. (B) Den relative spredning aktivitet av BGC-823 celler infisert med Ad-RhoC-V14 ble undersøkt ved MTT-analyse. (* P 0,05, sammenlignet med Ad-LacZ gruppe). (C) Et protein ekspresjon av RhoC i BGC-823-celler transfektert med RhoC siRNA. (D) Knocking ned av RhoC hemmet spredning av BGC-823 celler (MTT analyse, * P 0,05, sammenlignet med kontroll siRNA gruppe). Dataene er midler ± SD fra tre uavhengige eksperimenter hver utført i duplikat.
Materialer og metoder
Reagenser
Den magekreft cellelinjer BGC-823 [ ,,,0],22] og afrikanske grønne aper nyre fibroblast cellelinjer COS-7 ble levert av Institute of Cell Biology (Shanghai, Kina). The Green Fluorescent Protein (GFP) plasmid og celle transfeksjon reagens Lipofectamin ™ 2000 var fra Invitrogen (Carlsbad, California); De plasmider som koder for Flag tagget IQGAP1 (pflag-IQGAP1), flagg merket IQGAP1 C-terminalt fragment (pflag-IQGAP1-C), og flagg merket IQGAP1 N-terminale fragment (pflag-IQGAP1-N), og adenovirale vektorer som koder for β-galaktosidase (PAD-LacZ), en konstitutivt aktiv form for RhoC (PAD-RhoC-V14), full lengde IQGAP1 (PAD-IQGAP1), og den C-terminale fragment av IQGAP1 (PAD-IQGAP1-C) var snill gaver fra Dr. Gerry Boss og Dr. Renate Pilz i University of California, San Diego, USA. Human-EGF, BrdU, mus anti-BrdU-antistoff, DNase I, MTT, Hoechst 33342, FITC- og Cy3-konjugerte sekundære antistoffer var fra Sigma (St. Louis, MO). Den anti-IQGAP1 antistoff (mot N-terminalt fragment, 314-422 aa), anti-RhoA-antistoff, anti-IgG-antistoff, anti-CDK1 /CDK2 antistoff, korte interfererende RNA (siRNA) for RhoC og negativ kontroll var fra Santa Cruz Bioteknologi (Santa Cruz, California). Rho C siRNA er en pool av tre mål spesifikke 20-25 nt sirnas designet for å slå ned genuttrykket med sekvenser som følger: sekvens1, sanse 5′-CUACUGUCUUUGAGAACUAtt-3’and anti 5′-UAGUUCUCAA- AGACAGUAGtt-3 «; sequence2, avføle 5»-GCAGGAAGACUAUGAUCGAtt-3 «og 5′-antisense UCGAUCAUAGUCUUCCUGCtt-3′; sequence3, fornemme 5»-CAC- ACCAGCACUUUAUACAtt-3 «og antisense 5′-UGUAUAAAGUGCUGGUGUG- tt-3». Den anti-IQGAP1 antistoff (for C-terminale fragment tilsvarende aminosyrene 863-1657 av human IQGAP1) var fra Millipore (Billerica, Massachusetts). Den anti-RhoC antistoff var fra Abcam (Cambridge, MA). Den anti-cyclin B antistoff var fra BioWorld Technology (St. Louis Park, MN). Den anti-cyklin D1-antistoff og anti-Cyclin E antistoffer var fra BOOSTER (Wuhan, Kina). SiRNA for IQGAP1 ble syntetisert ved Qiagen (Valencia, CA), målsekvensen var IQGAP1 5′-AAGTTCTACGGGAAGTAATTG-3 «(5058-5078 bp). Pepperrot (HRP) konjugert sekundært antistoff var fra Rock immunochemicals (Gilberts, PA). Protein G Plus /Protein A-Agarose var fra Calbiochem (San Diego, California). Elektrokjemiluminescens (ECL) reagenser var fra Millipore (Billerica, MA). Alle reagenser som brukes i denne studien var av analytisk kvalitet.
(A) Western blot analyse av IQGAP1 uttrykk i magekreft celle BGC-823 linjer infisert med Ad-LacZ, Ad-IQGAP1-C, Ad-IQGAP1- N eller Ad-IQGAP1. (B) Ved MTT-analysen, IQGAP1-C og IQGAP1 spissen uttrykk celler har både mer spredning aktivitet enn kontrollgruppen (* P 0,05, sammenlignet med Ad-LacZ-gruppe). (C) Et protein Ekspresjonsnivået av IQGAP1 i magekreft cellelinje BGC-823 transfektert med IQGAP1 siRNA. (D) Spredning av BGC-823 celler transfektert med IQGAP1 siRNA ble undersøkt ved MTT-analyse. (* P 0,05, sammenlignet med kontroll siRNA gruppe). (E) BGC-823 celler ble transient transfektert med plasmider Flag-IQGAP1, flagg-IQGAP1-C, eller Flag-IQGAP1-N i 48 timer. Western blotting viste uttrykk for IQGAP1, IQGAP1-N, og IQGAP1-C konstruerer i BGC-823 cellelinjer. Like mengder av celle-lysat fra hver gruppe ble lastet og blottet med anti-IQGAP1 antistoffer (for C-terminale fragment eller N-terminalt fragment). (F) BrdU-analysen ble anvendt for analyse celleproliferasjon. Representative bilder av BGC-823 celler som uttrykker de angitte IQGAP1 konstruksjonene ble farget med antistoffer mot BrdU (andre paneler rød) og Hoechst 33342 for kjerner (første panel, blå). Prosentandelen av celler med BrdU-inkorporering ble beregnet. Gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige eksperimenter er presentert (* P 0,05).
Cell Culture transfeksjon og infeksjon
BGC-823 og COS-7-celler ble dyrket i 1 x Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) supplementert med 10% føtalt bovint serum (FBS) ved 37 ° C i 5% CO
2 atmosfære. Mediet ble skiftet hver annen dag og cellene ble underdyrket ved konfluens. For transfeksjon, ble cellene subdyrkes dagen før prosessen og transfeksjon av magekreftceller med plasmider eller siRNA ble utført i henhold til produsentens instruksjon. For infeksjon, ble 293a fremstilte celler transfektert med adenovirus vektorer PAD-lacZ, pad-RhoC-V14, pad-IQGAP1 og PAD-IQGAP1-C, og viruspartikler produsert av cellene ble høstet og forsterket. Virusene ble kalt Ad-LacZ, Ad-RhoC-14, Ad-IQGAP1 og Ad-IQGAP1-C henholdsvis, og ble brukt til å infisere BGC-823 celler. På dagen før infeksjonen, ble BGC-823 celler ferskt seeded på 70-80% samløpet og infeksjonen prosessen ble utført i henhold til produsentens instruksjoner på andre dagen.
(a) protein uttrykk nivåer av IQGAP1 , IQGAP1-C og RhoC i BGC-823 celler. BGC-823 celler ble transient transfektert med IQGAP1 siRNA eller RhoC siRNA i 24 timer. De transfekterte celler ble etterpå infisert med Ad-RhoC-V14, Ad-IQGAP1-C eller Ad-IQGAP1 for ytterligere 48 timer fulgt av Western blotting. (B) RhoC uttømming påvirket ikke IQGAP1 eller IQGAP1-C indusert spredning av BGC-823 celler. (C) ved å stanse all IQGAP1 av siRNA markert hemmet RhoC-indusert celleproliferasjon i BGC-823 celler. (MTT analyse, * P 0,05, ** P 0,01). Dataene er middelverdi ± SD fra tre uavhengige eksperimenter hver utført i duplikat.
Western blotting
Dyrkede celler ble vasket tre ganger i PBS og lysert med RIPA-buffer (50 mM Tris -HCI, pH 7,4, 1% (v /v) Triton X-100, 1 mM EDTA, 1 mM leupeptin, 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid, 10 mM NaF, 1 mM Na
3VO
4). Like mengder protein ble separert ved 8% eller 12% SDS-PAGE i henhold til proteinmolekylvekt. De primære antistoffene ble inkubert over natten ved 4 ° C, og de tilsvarende sekundære antistoffer ble inkubert i 1 time ved RT. Tre vaskinger ble utført med TBS /T etter hvert antistoff inkubasjon. ECL reagenser ble brukt til å vise de positive band på membranen.
(A) BGC-823 celler ble infisert med Ad-IQGAP1, Ad-IQGAP1-C eller Ad-RhoC-V14 i 48 timer, og Western blottet ble brukt for å analysere uttrykk for cyclin E, cyklin D1 cyclin B og CDK. (B) BGC-823-celler ble transfektert med IQGAP1 siRNA eller RhoC siRNA i 72 timer, og de uttrykk for cyclin E, cyklin D1, cyclin B og CDK ble analysert ved Western blotting. (C) Protein uttrykk for cyclin E, cyclin D1, cyclin B og CDK i BGC-823 celler som ble transient transfektert med IQGAP1 siRNA eller RhoC siRNA i 24 timer og etterpå infisert med Ad-RhoC-V14, Ad-IQGAP1-C eller Ad-IQGAP1 for ytterligere 48 h (Resultater av Western blotting).
MTT analysen
0,5-1 x 10
3cells i 150 ul medium ble belagt i brønn i 96-brønners plater. Etter festing, ble cellene infisert med tilsvarende adenovirus i 48 timer, eller transfektert med siRNA i 72 timer, henholdsvis. I kombinasjonsgruppene, ble cellene transfektert med siRNA rettet mot RhoC eller IQGAP1 i 24 timer og deretter infisert med Ad-IQGAP1-C /Ad-IQGAP1 eller Ad-RhoC-V14 for ytterligere 48 timer ved 37 ° C i 5% CO
2. De dyrkede celler ble vasket med PBS, ble behandlet med 20 ul av MTT (0,5 mg /ml), og deretter inkubert ved 37 ° C i 1 time. Mediet ble fjernet, og 100 ul dimetylsulfoksid (DMSO) ble tilsatt til hver brønn. Absorbansen ble bestemt ved 490 nm ved å bruke mikroplateleser. Alle analyser ble utført i tre eksemplarer.
(A) BGC-823 celler vokser på 100 mm plater ble transient ko-infisert med Ad-IQGAP1 og Ad-RhoC-V14, eller Ad-IQGAP1-C og Ad- RhoC-V14 i 48 timer. Cellene ble lysert og like mengder av protein lysatet ble immunopresipitert (IP) med anti-RhoC, anti-IQGAP1 antistoffer eller isotype-matchet IgG. Hele cellelysat ble anvendt som en proteininngangskontroll. (B) BGC-823-celler ble transfektert med ovenfor adenovirus i 24-48 timer, og det ko-lokalisering av RhoC og IQGAP1 i cellene ble bestemt ved immunofluorescens-mikroskopi ved anvendelse av anti-RhoC og anti-IQGAP1 antistoffer. Kjerner ble farget med Hoechst 33342 (blå). (C) COS-7 celler ble transient ko-infisert med Ad-IQGAP1-C /Ad-IQGAP1 og Ad-RhoC-V14 i 48 timer. Cellene ble gjennomgår den samme Co-IP fremgangsmåten beskrevet ovenfor. (D) COS-7-celler ble transfektert med ovennevnte adenovirale vektorer for 24-48 h, og det ko-lokalisering av RhoC og IQGAP1 i celler ble vist ved immunfluorescens. Dataene er representative fra tre uavhengige eksperimenter med lignende resultater.
BrdU innlemmelse analysen
DNA-syntese hastigheten ble målt med BrdU inkorporering av immunfluorescens. Såing Mengden av celler som ble justert for å oppnå en tetthet på 70-80% konfluens på dagen for transfeksjon. Plasmidet pflag-IQGAP1, pflag-IQGAP1-C eller pflag-IQGAP1-N ble ko-transfektert med GFP plasmid i BGC-823 celler ved hjelp Lipofectamin ™ 2000 som beskrevet ovenfor. 24 timer etter transfeksjon, ble cellene i serum-sultet natten over, behandlet med 200
μ
M BrdU og inkubert i omtrent 16 timer. Cellene ble deretter vasket med PBS, fiksert i nyfremstilt 4% (v /v) paraformaldehyd ved romtemperatur i 10 min, og permeabilisert med 0,5% (v /v) Triton X-100, etterfulgt av inkubasjon med DNase I (0,5 U /ul) i 30 minutter ved 37 ° C. Cellene ble inkubert med primært antistoff mot BrdU over natten ved 4 ° C etterfulgt av Cy3-konjugert sekundært antistoff i 1 time ved RT. Til slutt ble kjernene teller-farget med Hoechst 33342 i 15 minutter, skylles med PBS tre ganger, og visualisert under fluoriserende mikroskopi. Hver analyse ble utført i kvadruplett og gjentatt tre ganger.
Når RhoC stimuleres av ekstracellulære eller intracelluar signaler, det binder seg med den scaffoldprotein IQGAP1, påvirker ekspresjonen av cellesyklusrelaterte proteiner som cyklin D1 og cyklin B, påvirker G1-S-overganger i cellesyklus, og deretter bevirker endringen i celleproliferasjon. Den signaltransduksjon hendelsen der IQGAP1 påvirker uttrykk for cyclin fortsatt trenger å bli belyst.
Co-immunoprecipitation
For å undersøke samspillet mellom RhoC og IQGAP1, COS-7 og BGC -823 celler ble infisert med Ad-IQGAP1 eller Ad-IQGAP1-C, og Ad-RhoC-V14 i 48 timer og deretter ble lysert med RIPA buffer som beskrevet. Antistoffet mot RhoC, IQGAP1 eller isotypematchende IgG ble anvendt for immunopresipitering, respektivt. Immunopresipitater ble analysert ved Western blotting som ovenfor, ved anvendelse av anti-RhoC eller anti-IQGAP1 antistoff.
Immunofluorescence Mikros
celler dyrket på dekkglass ble fiksert med nyfremstilt 4% (v /v ) paraformaldehyd i PBS i 15 minutter, permeabilisert med 0,3% Triton X-100 i PBS i 10 min, og blokkert med 3% (w /v) bovint serumalbumin (BSA) i PBS. For Immunofluorescence ble cellene på dekkglass sekvensielt inkubert med kanin-polyklonalt antistoff mot IQGAP1 ved 4 ° C over natten, FITC-konjugert geite-anti-kanin-IgG i 1 time ved RT, muse-monoklonalt antistoff mot RhoC i 2 timer ved RT, og endelig geit-anti-mus-IgG konjugert med Cy3 i 1 time ved RT. Tre vasker ble utført etter hvert antistoff inkubasjon. Kjernene ble kontra farget med Hoechst 33342. Resultatet ble observert under et fluorescens mikroskop sammen med en CCD-kamera (Leica).
Statistical Analysis
Dataene ble analysert ved hjelp av en to-tailed ANOVA eller Student
t
-test med SPSS statistisk programvare, og uttrykt som betyr ± standardavvik (SD).
P
. 0,05 ble betraktet som signifikant
Resultater
RhoC Fremmes spredning av BGC-823 celler
Effekten av RhoC på celleproliferasjon var også undersøkt. BGC-823-celler ble infisert med adenovirus som koder for konstitutivt aktiv RhoC og celleproliferasjon ble detektert ved MTT-analyse. Resultatene viste at RhoC også fremmet spredning av magekreftceller BGC-823. Over-ekspresjon av RhoC-V14 i BGC-823-celler forårsaket 48,7% økning i celleproliferasjon (fig. 1A og B). I mellomtiden, uttømming av RhoC av siRNA redusert spredning av BGC-823 celle med 43,1% (Fig. 1C og D).
IQGAP1 Forbedret spredning av BGC-823 celler
(1) resultater av MTT analysen.
for å vurdere bidraget av IQGAP1 til spredning, ble MTT analyse brukes til å oppdage levedyktigheten til magekreft cellelinje BGC-823. Resultatene viste at sammenlignet med kontrollceller (Ad-LacZ gruppe), høy ekspresjon av det C-terminale fragment av IQGAP1 (Ad-IQGAP1-C-gruppe) eller full lengde IQGAP1 (Ad-IQGAP1 gruppe) forsterkes celleproliferasjon med 116% og henholdsvis 39%, (
*
P 0,05,
*
P. 0,05, 2A og B). I motsetning til den N-terminale fragment av IQGAP1 ikke har noen tydelig virkning på celleformering. På den annen side, innblanding av IQGAP1 uttrykk med siRNA redusert celleproliferasjon med 43%, sammenlignet med negativ kontroll (
*
P . 0,05, figur 2C og D). Disse resultatene indikerte at IQGAP1 var i stand til å akselerere celleproliferasjon; den aktive domenet ble plassert i den C-terminale fragment av proteinet.
(2) Resultater av BrdU innlemmelse analysen.
BrdU innlemmelse analysen ga et mønster av respons lik den som er observert i MTT-analyse. Expression of Flag-IQGAP1 og Flag-IQGAP1-C markert forfremmet DNA syntese til nivåene nesten 1-flod og to ganger enn det som er observert med Flag-D1 (* P 0,05, * P. 0,05, Fig 2E og F) , mens IQGAP1-N ikke vist noen effekter på DNA syntese, noe som tyder på at IQGAP1 annerledes regulerer DNA-syntese via forskjellige domener.
Sammenhengen mellom RhoC og IQGAP1 i Stimulating spredning av BGC-823 celler
(1) RhoC og IQGAP1 ikke påvirke uttrykket hverandre.
resultatene ovenfor sterkt at både RhoC og IQGAP1 bidratt til spredning av BGC-823 celler. For å belyse mulig sammenheng mellom RhoC og IQGAP1 i å regulere cellevekst, vi først undersøkt om IQGAP1 og RhoC påvirke deres uttrykk hverandre. BGC-823-celler ble transfektert med siRNA til knockdown ekspresjonen av RhoC eller IQGAP1, og deretter ble infisert med adenovirus som koder for IQGAP1, IQGAP1-C eller konstitutivt aktiv RhoC respektivt. Western blotting ble brukt for å detektere om endring av ekspresjon og aktivitet av en protein kan påvirke ekspresjon av andre proteiner eller ikke. Resultatene viste at økende eksogene eller knockdown av endogent IQGAP1 eller IQGAP1-C, ikke påvirke RhoC uttrykk. Tilsvarende øker konstitutivt aktiv RhoC eller innblanding av endogen RhoC ikke påvirker ekspresjonen av IQGAP1 eller IQGAP1-C (Fig. 3A).
(2) IQGAP1 var en effektor av RhoC i å stimulere proliferasjon av cellene.
MTT analysen ble brukt til å belyse forholdet mellom RhoC og IQGAP1 i å stimulere spredning. Resultatene viste at RhoC-siRNA var ikke tydelig effekt på proliferasjonen forårsaket av IQGAP1 (** P 0,01, figur 3B.). Men uttømming av IQGAP1 uttrykk av siRNA blokkert spredning forårsaket av uttrykk for konstitutivt aktiv RhoC (* P 0,05, ** P 0,01, figur 3C.). Dette indikerte at under prosessen med å stimulere proliferasjon av BGC-823-celler, RhoC kreves deltakelse av IQGAP1. Videre, siden RhoC effekt kreves IQGAP1 mens IQGAP1 effekt ikke krever RhoC, kan RhoC være oppstrøms IQGAP1 og tok IQGAP1 som en effektor.
Effekt av RhoC og IQGAP1 på Expression of Cell Cycle Relaterte Proteiner
for ytterligere å bekrefte spredning stimulerende effekt av RhoC og IQGAP1 og undersøke mulig mekanisme som disse proteinene regulere spredning av cellene, søkte vi Western blotting for å detektere uttrykket av cellesyklusrelaterte proteiner i celler behandlet med metoder for øke eller redusere RhoC og IQGAP1. Resultatene viste at økningen av RhoC og IQGAP1 stimulert ekspresjon av cyclin E og cyklin D1, mens det hadde ingen effekt på ekspresjonen av cyclin B og CDK1 /2. På den annen side reduksjonen av RhoC og IQGAP1 inhiberte ekspresjon av cyclin E og cyklin D1. I mellomtiden, i tilfelle av RhoC stanse ved siRNA, øke IQGAP1 eller IQGAP1-C fremdeles forbedre ekspresjonen av cyclin E og cyklin D1 (fig. 4). Avhandlinger Resultatene indikerte at RhoC og IQGAP1 kan regulere spredning gjennom å endre uttrykket av cellesyklus relatert protein og forårsaker flere celler til å gå inn i S-fasen.
RhoC og IQGAP1 samlokalisert og Bound hverandre i Cells
immunfluorescens og Co-immunoprecipitation metoden ble brukt til videre undersøke mulige binding mellom RhoC og IQGAP1. Både BGC-823 og COS-7 celler ble infisert med Ad-IQGAP1 og Ad-RhoC-V14 eller Ad-IQGAP1-C og Ad-RhoC-V14 i 48 timer, og den totale cellelysat ble immunopresipitert med anti-RhoC antistoff og probet med antistoff mot IQGAP1, eller immunopresipitert med anti-IQGAP1 antistoff og probet med antistoff mot RhoC, respektivt. Resultatene viste RhoC og IQGAP1 bundet til hverandre, med C-terminale fragment av IQGAP1 som bindingssetet med RhoC (Fig. 5A og C). Videre immunfluorescens analysen viste at IQGAP1 ble distribuert hovedsakelig i cytoplasma, der det samlokalisert med RhoC (Fig. 5B og D).
Diskusjoner
Ukontrollert kreftcelle spredning krever koordinert og strengt regulert funksjon av mange proteiner [23], [24], [25], [26]. Det er derfor avgjørende for å studere mekanismen for hvordan disse proteinene samhandler i regulering av kreftcelle-proliferasjon. Våre tidligere resultater har dokumentert at uttrykket av IQGAP1 og RhoC ble økt i magekreft vev og kreftcellelinjer [21]. Nivået på deres uttrykk hadde en signifikant sammenheng med den dårlige differensiering av magekreft. Men det er ikke helt klart om hvorvidt IQGAP1 og RhoC er assosiert med celleproliferasjon i tumorigenensis. I denne studien uttrykket nivået av IQGAP1 og RhoC og deres biologiske aktivitet i magekreft cellelinje BGC-823 ble justert gjennom infeksjon med adenovirus konstruksjoner eller transfeksjon med plasmid DNA eller siRNA. Spredning av cellen ble deretter undersøkt ved anvendelse av BrdU-inkorporering analyse og MTT-metoden. Resultatene viste at konstitutivt aktiv RhoC forfremmet betydelig spredning aktivitet av magekreft cellelinje BGC-823, og uttømming av RhoC av siRNA hemmet de egenskapene. Forsknings data har vist at RhoC hatt en viktig rolle i cellemigrering og metastase [27], [28], [29], [30], [31], men det var noen motsetninger om RhoC regulere prosessen for transformasjon og proliferasjon i tumorceller [27], [29], [32]. Våre resultater gir bevis for at RhoC har spredning stimulerende effekt på mage kreftceller. Dette vil være nyttig i å belyse rollen som RhoC i å regulere spredning av kreftceller.
Våre resultater viste at lik RhoC, over-uttrykk for eksogene IQGAP1 og IQGAP1-C også fremmet spredning av BGC-823 celler, mens knockdown av endogent IQGAP1 attenuert spredning evnen av cellen, noe som indikerer at IQGAP1 bidrar også til regulering av celleproliferasjon. Tatt i betraktning at både RhoC og IQGAP1 ha rolle i å regulere spredning av kreftceller og deres uttrykk ble sterkt korrelert, vi videre utforsket den funksjonelle sammenhengen mellom RhoC og IQGAP1. Resultatene viste at i BGC-823 celler med knock-down av IQGAP1 uttrykk, infeksjon med adenovirus koding konstitutivt aktiv RhoC kunne stimulere aktiviteten spredning lenger; mens i BGC-823 celler med knock-down av RhoC uttrykk, over-uttrykk IQGAP1 eller IQGAP1-C gjennom infiserer cellene med adenovirus som koder for tilsvarende DNA forårsaket fortsatt høyere spredning aktivitet. Dette indikerte at RhoC drev tumor proliferasjon gjennom IQGAP1, nærmere bestemt ved den C-terminale fragment av IQGAP1. Dette funksjonelle sammenhengen mellom RhoC og IQGAP1 ble videre støttet av Co-immunoprecipitation og immunfluorescens. Disse resultatene antydet at RhoC tok IQGAP1 som en effektor i å regulere kreftcelle spredning, kaster nytt hint om forholdet mellom disse proteinene.
For å primært utforske nedstrøms mekanisme som RhoC /IQGAP1 regulere spredning av magekreftceller undersøkte vi effekten av RhoC /IQGAP1 på ekspresjonen av cellesyklusrelaterte proteiner, inkludert cyclin E, cyklin D1, cyclin B og cyklinavhengig kinase (CDK). Resultatene viste at både RhoC og IQGAP1 stimulert ekspresjon av cyclin E og cyklin D1, men hadde ingen virkning på ekspresjon av cyclin B og CDK. Spredning av eukaryote celler reguleres på bestemte punkter i cellesyklus, særlig ved den første åpning fase (G1) til den DNA-syntetiske fase (S) og den andre spalten fasen (G2) for å mitose (M) overganger. Herav er det G1-S-overganger hoved regulering punktet av cellesyklusen. Cyclin D1 og cyclin E kontrollere cellen progresjon gjennom å fremme G1 til S-fasen av cellesyklus. Våre resultater antydet at når RhoC ble aktivert ved ekstracellulært eller intracellulært signal, det er bundet til IQGAP1 og deretter påvirket ekspresjon av cellesyklusrelaterte proteiner direkte eller indirekte gjennom noen uklare signaloverføringstrinn, som til slutt kan føre til endring av celle progresjon og spredning (fig. 6).
i konklusjonen, disse dataene fra studien, i forbindelse med tidligere publiserte data [21], støtter hypotesen om at RhoC deltar i både migrasjon og spredning av mage kreftceller. IQGAP1 også delta regulering av kreftcelle spredning som en nedstrøms effektor av RhoC. Disse dataene kan skinne lys på utvikling av terapeutiske tilnærminger for magekreft.
Takk
Vi takker Dr. Gerry Boss og Dr Renate Pilz i University of California, San Diego, CA, USA, for slag gaver av adenovirus konstruksjoner.
