Abstract
Nyere studier indikerer at den unormale mikromiljøet av svulster kan spille en avgjørende rolle i kreftutvikling, inkludert lungekreft. Vi grundig vurdert antall stromale celler, spesielt immun /betennelsesceller, i lungekreft og evaluert deres infiltrasjon i kreft i ulike stadier, typer og metastatiske egenskaper potensielle. Immunhistokjemisk analyse av lungekreft vev matriser inneholdende normale og lungekreft seksjoner ble utført. Denne analysen ble kombinert med cytomegalovirus /histomorphological vurdering og kvantifisering av celler for å klassifisere /subklassifisere tumorer nøyaktig og for å utføre en høy gjennomstrømning analyse av stromal celleblanding i forskjellige typer av lungekreft. I humane lungekreft seksjoner ble det observert en betydelig høyde /infiltrasjon av total-T-lymfocytter (CD3
+), cytotoksiske-T-celler (CD8
+), T-hjelperceller (CD4
+), B celler (CD20
+), makrofager (CD68
+), mastceller (CD117
+), mononukleære celler (CD11c
+), plasmaceller, aktiverte-T-celler (MUM1
+), B-celler, myeloidceller (PD1
+) og neutrofile granulocytter (myeloperoksidase
+) sammenlignet med friske donorprøver. Vi observerte alle disse immuncellemarkører i ulike typer lungekreft inkludert plateepitelkarsinom, adenokarsinom, adenosquamous cell carcinoma, småcellet karsinom, papillær adenokarsinom, metastatisk adenokarsinom, og bronchioloalveolar karsinom. Tallene for alle tumorassosierte immunceller (unntatt MUM1
+ celler) i stadium III kreftprøver var betydelig større enn de i stadium I prøvene. Vi observerte betydelige scenen avhengig immuncelleinfiltrasjon i humane lungesvulster som tyder på at svulsten mikromiljøet spiller en avgjørende rolle under lunge kreftutvikling. Strategier for terapeutisk interferens med lungekreft mikromiljøet bør vurdere kompleksiteten i sin immun celle sammensetning
Citation:. Banat G-A, Tretyn A, Pullamsetti SS, Wilhelm J, Weigert A, Olesch C, et al. (2015) Immune og provoserende celle sammensetning of Human Lung Cancer Stroma. PLoS ONE 10 (9): e0139073. doi: 10,1371 /journal.pone.0139073
Redaktør: Gernot Zissel, Universitätsklinikum Freiburg, Tyskland
mottatt: 03.02.2015; Godkjent: 09.09.2015; Publisert: 28.09.2015
Copyright: © 2015 Banat et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: Forfatterne meste brukes kommersielt tilgjengelig lungekreft vevet array. LUC1501 inneholder 150 kjerner fra normale /godartet (3 tilfeller) og kreft (70 tilfeller med gradering og TNM staging data), ble dupliseres kjerner per sak kjøpt fra Pantomics, Inc. (Cat ingen LUC 1501;. Richmond, CA, USA). Seks ytterligere prøver av donor lungevev ble tatt fra lungene som ikke ble transplantert. Studien protokoll for vev donasjon ble godkjent av etisk komité ( «Ethik Kommision am Fachbereich Humanmedizin der Justus Liebig Universität Giessen»). Vevet bank komiteen offiser er professor Werner Seeger e-post: [email protected]. De ekstra 6 vevsprøver er tilgjengelig på forespørsel på grunn av etiske restriksjoner
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Verein zur Förderung der Krebsforschung i Gießen eV, og LOEWE universitetene i Giessen og Marburg Lung Senter (UGMLC).
konkurrerende interesser: forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft er en svært aggressiv og utfordrende sykdom og er den ledende årsak til kreftdødelighet i verden. . Til tross for pågående terapeutiske arbeidet, lungekreftpasienter har en dårlig prognose med en gjennomsnittlig 5-års overlevelse på bare 15% [1] [2]. Omtrent 80-85% av alle lungekreftpasienter behandles med ett eller flere alternativer innen et standard regime som involverer kirurgi, strålebehandling og kjemoterapi med sykdommens stadium bestemme den terapeutiske muligheter. Selv om disse behandlingene har gitt lovende resultater som neo-adjuvant og adjuvant strategier for tidlig stadium pasienter og for behandling av lokalavansert og avansert sykdom, er behandlingsresultatene for lungekreft fortsatt som skuffende. Dette skyldes i stor grad en forsinket diagnostisering og manglende kunnskap om tumorprogresjon og tilhørende molekylære endringer [3]. Viktige fremskritt har nylig blitt gjort for å identifisere molekylære determinanter av kreftutvikling, for eksempel genetiske endringer i mange onkogener (
Kras
,
cMyc
,
EGFR
,
ALK
, etc.) og tumor-suppressor gener (
p53
,
RASSF1
,
RB
,
FHIT
) [4, 5] .
i tillegg til denne genetiske kompleksitet, blir det cellulære kompleksiteten av tumoren mikromiljøet mer og mer anerkjent som bidrar direkte til kreft initiering, progresjon og metastase [6, 7]. Svulsten mikromiljøet, avhengig av tumor plassering, er sammensatt av stromale celler innbefattende fibroblaster, immun og inflammatoriske celler, adipocytter, gliale celler, glatte muskelceller og hørende og rekruttert vaskulære celler sammen med den ekstracellulære matriks, vekstfaktorer /cytokiner og andre proteiner som er lokalt og /eller systemisk produsert. Selv om ingen av disse stromale celler er tumorigen, kan de enten stimulere eller inhibere kreftcelleformering /malignitet, avhengig av tumormikromiljøet og de forskjellige interaksjonene de måtte ha med kreftceller [8, 9].
Selv om immun celler skal i prinsippet oppdage og eliminere transformerte celler, deres samspill med kreftceller kan føre til endringer i deres fenotype som faktisk kan resultere i etableringen av en svulst bærende miljø i ulike kreft innstillinger, inkludert lungekreft [10-12]. Således kan en omfattende analyse av befolkningen /sammensetningen av stromale celler og en bedre forståelse av deres innvirkning på prosessen med kreft til slutt føre til forbedrede anticancer behandling [13, 14]. Langs denne linjen, er det nå økende bevis for at visse immunceller infiltrere inn i svulster i humane prøver av lungekreft [12, 15-19]. Men til vår beste kunnskap, identifikasjon og kvantifisering av flere immun celle populasjoner og deres korrelasjon til lungekreft typen, scene og lymfeknutestatus har ikke blitt rapportert. I denne studien anvender vev matriser og immunhistokjemi, vi betydelig utvidet denne karakteristikken for å omfatte flere immuncellepopulasjoner, samt forskjellige lungecancertyper, kreft trinn, og tumorstørrelser, så vel som forskjeller i lymfeknutestatus. Disse teknikkene ble kombinert med cytomegalovirus /histomorphological vurdering og kvantifisering av cellene, til å klassifisere /subklassifisere svulster nøyaktig og høy gjennomstrømning analyse av stromal celle sammensetning i ulike typer lungekreft.
Materialer og Metoder
Lung Prøver
Lungekreft vev array, inneholder LUC1501 150 kjerner fra normale /godartet (3 tilfeller) og kreft (70 tilfeller med gradering og TNM staging data), ble dupliseres kjerner per sak kjøpt fra Pantomics, Inc . (. Cat ingen LUC 1501, Richmond, CA, USA). Alle vevene ble fiksert i 10% nøytral bufret formalin i 24 timer og behandlet ved hjelp av identiske SOP. Snittene ble plukket ut Superfrost Plus eller Startfrost selvklebende lysbilder. Det kan være 5% kjernen tap per lysbilde men kjernen retention rate skal være 90%. De vevsprøver ble presentert i duplikater for internkontroll og for å vurdere svulst heterogenitet. I tillegg er en patolog validert tumorene hos kjernene. Tumorene dekker mellom 50 og 100% av kjernene. Seks ytterligere prøver av donor lungevev ble tatt fra lungene som ikke ble transplantert [20]. Denne donor lungevev ble ikke-transplantert lungevev av transplantasjons donorer. Studien protokoll for vev donasjon ble godkjent av etisk komité ( «Ethik Kommision er Fachbereich Humanmedizin der Justus Liebig Universität Giessen») ved Universitetssykehuset Giessen (Giessen, Tyskland) i samsvar med nasjonal lovgivning og med «Good Clinical Practice /International Conference om harmonisering «retningslinjer. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra hver pasient eller pasientens nærmeste pårørende (AZ 31/93) [20, 21]. Alle prøvene ble analysert under en Hamamatsu NDP lysbilde skanner (Hamamatsu Nanozoomer 2.0HT) og utkikksplattform (NDP.Viewer).
Hematoxylin og eosin Farging
Lungekreft vev utvalg ble deparaffinized i xylen etterfulgt av rehydrering i 100%, 90% og 70% etanol og destillert vann. Platene ble deretter inkubert i frisk hematoksylin (Merck, Darmstadt, Tyskland) i 20 minutter og vasket i destillert vann, etterfulgt av inkubering i surgjort eosin-oppløsning (Sigma, Deisenhofen, Tyskland) i 1 minutt og vasking. Til slutt, lysbildene var dehydratisert i 90% og 100% etanol, lufttørket, og er montert [20].
Immunhistokjemi
Immunhistokjemisk farging ble utført ved hjelp av en Autostainer Plus (Dako, Hamburg, Tyskland ) og mus monoklonale antistoffer fra Dako, medac (Hamburg, Tyskland), og Thermo Fisher (Dreieich, Tyskland) ved fortynninger er vist i tabell 1. Et polyklonalt antistoff ble bare brukt for myeloperoksidase (MPO) farging. Vi fulgte den spesifikke standardiserte protokollen som leveres av produsenten. Utelatelse av det primære antistoff tjente som en negativ kontroll. I korthet Glassene ble forbehandlet med Trilogy buffer (medac, 1: 100, 16 min ved 95 ° C), citrat lav-buffer (Thermo Fisher, 1: 100, 26 min ved 98 ° C), eller pronase E (Merck; 0,1% , 10 min ved romtemperatur) etterfulgt av behandling med 3% H
2o
2 til 8 min. Alle antistoffer ble tilført i et volum på 200 ul og inkubert i 30 min. Etter vasking (medac vaskebuffer, 1:20 i aqua dest), ble sekundært antistoff (medac) anvendt i et volum på 200 ul og inkubert i 20 min. Etter vasking ble hver prøve inkubert med polymer (200 ul) i 30 minutter (Merk at det sekundære antistoff og polymeren er komponenter av den fargekodede BrightVision HRP kit fra medac). Objektglassene ble vasket to ganger og inkubert i Bright DAB (medac) i 10 minutter. Platene ble vasket i aqua dest, kontra med hematoksylin i 8 min, og vasket før coverslip [20, 22].
dataanalyse og statistikk
Det totale antall celler og positivt fargede celler ble talt i vevssnitt. I kombinasjon med en immunhistokjemisk flekk, vi også avhengig av en cytomegalovirus-/histomorphological vurdering av cellene av en patolog. H sunt, plateepitelkarsinom, adenokarsinom, adenosquamous karsinom, småcellet karsinom, papillær adenokarsinom, metastatisk adenokarsinom, og bronchioloalveolar karsinom. Alle prøvene ble utsatt for ytterligere histopatologisk analyse.
Representative bilder av menneskelige lunge seksjoner farget med hematoxylin og eosin basert på deres patologi. (A) frisk donor, (B) squamous cell carcinoma, (C) adenokarsinom, (D) adenosquamous karsinom, (E) småcellet karsinom, (F) papillær adenokarsinom, (G) metastatisk adenokarsinom, og (H) bronchioloalveolar karsinom. Scale bar = 250 mikrometer.
Analyse av svulstens mikromiljø i Human Lung Cancer Vev
T-lymfocytter.
Infiltrasjon av T-lymfocytter i human lungevev ble vurdert ved immunhistokjemisk analyse ved hjelp av CD3 antistoff. Vi observerte en økning i antall CD3
+ T celler i lungekreft [mener, 118 celler /per 1000 celler; 95% CI, 105-133; her etter nevnt som 118 (105 … 133)] sammenlignet med friske donor lungene [28 (14 … 57); Figur 2A]. Infiltrasjon av CD3
+ T-lymfocytter som var uavhengig av krefttype (Fig 2B og 2F), men antall celler som var høyere infiltrere i senere stadier av lungekreft [173 (151 … 199) stadium III vs. 61 (33 … 114) trinn I lungekreft, figur 2C]. Antallet CD3
+ T celler i tumorprøver var uavhengig av tumorstørrelse [T2: 119 (104 … 136] vs T3: 88 (52 … 149)] og lymfeknutestatus [N0: 123 (106 … 143) vs. N1 + 2:.. 101 (79 … 130), fig 2D og 2E] basert på TNM staging
Menneskelig lungekreft vevet matrise ble farget med CD3 antistoff for å påvise T-lymfocytter (A) Kvantifisering av CD3
+ celler i lungecancer lignet med friske donorprøver. (B-E) Kvantifisering av CD3
+ celler basert på (B) sin patologi, (C) kreft stadium, (D) tumorstørrelse, og (E ) lymfeknutestatus. Cell tallene er gitt som CD3-positive celler per 1000 celler. (F) Representative bilder av menneskelige lunge seksjoner farget med CD3 antistoff basert på deres patologi. Scale bar = 25 mikrometer.
for ytterligere å vurdere fordelingen av T-lymfocytt-subpopulasjoner ble snittene analysert ved farging for utbredelsen av T hjelper (CD4
+) og cytotoksiske (CD8
+) T-celler. Som vist i figur 3A, antall CD4
+ celler ble betydelig økt i svulstvev sammenlignet med frisk donor vev [62 (52 … 72) vs. 12 (4 … 32)]. Forekomsten av T-hjelperceller var uavhengig av krefttype (figur 3B og 3F), men antallet av infiltrerende celler var høyere i stadium III kreft sammenlignet med stadium I [113 (102 … 125) g 22 (12 … 42), fig 3C]. Antallet CD4
+ T-lymfocytter i tumorprøver var uavhengig av tumorstørrelse [T2: 62 (52 … 75] vs T3: 60 (32 … 114)] og lymfeknutestatus [N0: 63 (51 … 77) vs. N1 + 2. 60 (43 … 83), figur 3D og 3E] Lignende resultater ble oppnådd for infiltrering av cytotoksiske T-lymfocytter, med et høyere antall CD8
+ celler i tumorvev sammenlignet med friske kontroller [80 ( 69 … 93) vs. 17 (7 … 41)] og høyere CD8
+ celleinfiltrasjon i fase III vs. stadium i lungekreft [132 (114 … 154) vs. 51 (27 … 98), fig 4A og 4C]. det var ingen sammenheng mellom utbredelsen av cytotoksiske T-celler og krefttype, tumorstørrelse eller lymfeknutestatus (fig 4B, 4D og 4E).
Menneskelig lungekreft vevet matrise ble farget med CD4 antistoff for å påvise T-hjelperceller. (A) Kvantifisering av CD4
+ celler i lungecancer lignet med friske donorprøver. (B-E) Kvantifisering av CD4
+ celler basert på (B) sin patologi, (C) kreft stadium , (D) tumorstørrelse, og (E) lymfeknutestatus. Cell tall er gitt som CD4-positive celler per 1000 celler. (F) Representative bilder av humane lungeseksjoner farget med CD4-antistoff basert på deres patologi. Scale bar = 25 mikrometer.
Menneske lungekreft vevet matrise ble farget med CD8 antistoff for å påvise cytotoksiske T-lymfocytter. (A) Kvantifisering av CD8
+ celler i lungekreft vs. friske donorprøver. (B-E) Kvantifisering av CD8
+ celler basert på (B) sin patologi, (C) kreft stadium, (D) tumorstørrelse, og (E) lymfeknutestatus. Celle tall er gitt som CD8-positive celler per 1000 celler. (F) Representative bilder av menneskelige lunge seksjoner farget med CD8 antistoff basert på deres patologi. Scale bar = 25 mikrometer.
makrofager og mastceller.
Tumor-forbundet makrofager ble vurdert basert på uttrykk for CD68. Vi observerte en økning i antall CD68
+ celler i lungekreft [39 (30 … 49)] sammenlignet med friske donor lungene [5 (1 … 34); Fig 5A]. Antall tumor-assosierte makrofager også korrelert med kreft stadium [stadium III: 75 (62 … 92) vs. trinn I: 9 (2 … 41), figur 5C] og var uavhengig av type kreft, tumorstørrelsen og lymfeknutestatus (fig 5B og 5D-5F).
Menneskelig lungekreft vevet matrise ble farget med CD68 antistoff til å oppdage makrofager. (A) Kvantifisering av CD68
+ celler i lungekreft vs. friske donorprøver. (B-E) Kvantifisering av CD68
+ celler basert på (B) sin patologi, (C) kreft stadium, (D) tumorstørrelse, og (E) lymfeknutestatus. Celle tall er gitt som CD68-positive celler per 1000 celler. (F) Representative bilder av menneskelige lunge seksjoner farget med CD68 antistoff basert på deres patologi. Scale bar = 25 mikrometer.
Deretter vurderes vi antall mastceller i svulstvev basert på CD117 (cKit) immundeteksjon. Som vist i figur 6A, antall mastceller var høyere i tumorvev sammenlignet med friske donorvevet [103 (88 … 122) g 11 (2 … 48)] og ble vesentlig forhøyet i stadium III kreft sammenlignet med stadium I [183 (157 … 213) vs. 61 (30 … 124), fig 6C]. Vi har ikke funnet noen forskjeller mellom prøvene i henhold til type kreft, tumorstørrelse eller lymfeknutestatus (fig 6B og 6D-6F).
Menneskelig lungekreft vevet matrise ble farget med CD117 (cKit) antistoff for å påvise mastceller . (A) Kvantifisering av CD117
+ celler i lungekreft vs. friske donorprøver. (B-E) Kvantifisering av CD117
+ celler basert på (B) sin patologi, (C) kreft stadium, (D) tumorstørrelse, og (E) lymfeknutestatus. Celle tall er gitt som CD117-positive celler per 1000 celler. (F) Representative bilder av menneskelige lunge seksjoner farget med CD117 antistoff basert på deres patologi. Scale bar = 25 mikrometer.
Granulocytter.
Antall infiltrere nøytrofile granulocytter ble fastsatt basert på MPO immunoreaktivitets. I likhet med tidligere resultater, fant vi forhøyede antall nøytrofile i kreftvev sammenlignet med friske donor lungene [74 (62 … 88) vs. 8 (2 … 34), Fig 7A] og i de senere stadier av kreft [stadium III : 125 (107 … 145) vs. stadium I: 37 (17 … 78), figur 7C]. Likeledes var det ingen korrelasjon mellom nøytrofile antall og type kreft, tumorstørrelse eller lymfeknutestatus (figur 7B og 7D-7F).
human lungekreft vevet matrise ble farget med MPO-antistoff for å påvise nøytrofile granulocytter. (A) Kvantifisering av MPO
+ celler i lungekreft vs. friske donorprøver. (B-E) Kvantifisering av MPO
+ celler basert på (B) sin patologi, (C) kreft stadium, (D) tumorstørrelse, og (E) lymfeknutestatus. Celle tall er gitt som MPO-positive celler per 1000 celler. (F) Representative bilder av menneskelige lunge seksjoner farget med MPO antistoff basert på deres patologi. Scale bar = 25 mikrometer.
B-celler og dendrittiske celler.
Neste, basert på uttrykk for CD20 og CD11c, vurdert vi antall tumor-infiltrerende B-celler og av dendrittiske celler (sammen med monocytter, makrofager og nøytrofiler) henholdsvis. Vi har funnet en økning i CD20
+ B-celler i tumorvevet sammenlignet med friske prøvene [39 (30 … 49) g 5 (1 … 34), figur 8A]. Antallet CD20
+ celler ble også forhøyet i stadium III vs stadium I kreftprøver [75 (62 … 92) vs. 9 (2 … 41), figur 8C]. Numrene på fra CD20
+ B-celler i kreftvevet var uavhengig av krefttype og tumorstørrelse (figur 8B, 8D og 8F). En vesentlig høyere antall infiltrere B-celler ble påvist i N0 tumorprøver, sammenlignet med N1 + 2 prøver [45 (34 … 59) vs. 29 (18 … 49] (fig 8E). Tilsvarende antallet dendrittiske celler var i det vesentlige forhøyede i tumorvevet som bestemt ved CD11c immunfarging [28 (24 … 32) g 6 (3 … 16), figur 9A]. Videre kan antallet CD11c
+ celler i tumorvevet var uavhengig av krefttype ( fig 9B og 9F), selv om antallet av infiltrerende celler var forhøyet i senere stadier av lungekreft [47 (40 … 56) stadium III sammenlignet med 11 (4 … 28) trinn i lungekreft, figur 9C]. antallet CD11c
+ dendrittiske celler i tumorprøver var uavhengig av tumorstørrelse og lymfeknutestatus (fig 9D og 9E).
Menneskelig lungekreft vevet matrise ble farget med CD20 antistoff for å påvise B-celler. (A) Kvantifisering av CD20
+ celler i lungecancer lignet med friske donorprøver. (B-E) Kvantifisering av CD20
+ celler basert på (B) sin patologi, (C) kreft stadium, (D) tumorstørrelse, og ( E) lymfeknutestatus. Cell tall er gitt som CD20-positive celler per 1000 celler. (F) Representative bilder av humane lungeseksjoner farget med CD20-antistoff basert på deres patologi. Scale bar = 25 mikrometer.
Menneske lungekreft vevet matrise ble farget med CD11c antistoff for å påvise dendrittiske celler. (A) Kvantifisering av CD11c
+ celler i lungekreft vs. friske donorprøver. (B-E) Kvantifisering av CD11c
+ celler basert på (B) sin patologi, (C) kreft stadium, (D) tumorstørrelse, og (E) lymfeknutestatus. Celle tall er gitt som CD11c-positive celler per 1000 celler. (F) Representative bilder av menneskelige lunge seksjoner farget med CD11c antistoff basert på deres patologi. Scale bar = 25 mikrometer.
MUM1- og PD1-positive celler.
Vi evaluerte uttrykket nivåer av to ekstra immun markører. MUM1 etiketter plasmaceller og aktiverte T-celler, mens PD1 etiketter aktiverte T-celler, B-celler, myeloidceller og en undergruppe av thymocyttene. Begge MUM1-positive celler og PD1-positive celler ble forhøyet i kreftvev sammenlignet med kontroll lungene [MUM1
+ celler: 65 (52 … 81) mot 6 (1 … 50), PD1
+ celler: 26 (21 … 32) g 9 (3 … 24), figurene 10A og 11A]. Forekomsten av MUM1-positive celler var uavhengig av krefttype, scene, tumorstørrelse og lymfeknutestatus (fig 10B-10F). Antallet PD1
+ celler korrelerte med kreft stadium [stadium III: 49 (41 … 58) vs trinn I: 5 (1 … 22), figur 11C], men det var ingen korrelasjon med hensyn til krefttype , tumorstørrelse eller lymfeknutestatus (fig 11B og 11D-11F).
Menneskelig lungekreft vevet matrise ble farget med MUM1 antistoff for å påvise plasmaceller og aktiverte T-celler. (A) Kvantifisering av MUM1
+ celler i lungekreft vs. friske donorprøver. (B-E) Kvantifisering av MUM1
+ celler basert på (B) sin patologi, (C) kreft stadium, (D) tumorstørrelse, og (E) lymfeknutestatus. Celle tall er gitt som MUM1-positive celler per 1000 celler. (F) Representative bilder av menneskelige lunge seksjoner farget med MUM1 antistoff basert på deres patologi. Målestokk = 25 um.
human lungekreft vevet matrise ble farget med PD1-antistoff for å påvise aktiverte T-celler, B-celler, myeloidceller, og en undergruppe av thymocyttene. (A) Kvantifisering av PD1
+ celler i lungekreft vs. friske donorprøver. (B-E) Kvantifisering av PD1
+ celler basert på (B) sin patologi, (C) kreft stadium, (D) tumorstørrelse, og (E) lymfeknutestatus. Celle tall er gitt som PD1-positive celler per 1000 celler. (F) Representative bilder av menneskelige lunge seksjoner farget med PD1 antistoff basert på deres patologi. Scale bar = 25 mikrometer.
Diskusjoner
I denne studien ansette vev arrays og immunhistokjemi, vi grundig analysert stromal celle sammensetning i ulike humane lungekrefttyper, klasse og scene. I kombinasjon med en immunhistokjemisk analyse, vi også anvendes et cytomegalovirus /histomorphological vurdering av celler. Denne kombinasjonen tillatt oss å klassifisere /subklassifisere svulster nøyaktig og til å utføre en høy gjennomstrømning analyse av stromal celle sammensetning i tumortyper med inter-individuell variasjon. Viktigere, observerte vi omfattende immun og inflammatorisk celleinfiltrasjon i humane lungekreft prøver. Vi grundig karakterisert og kvantifisert T-lymfocytter (CD3 +), cytotoksiske-T-celler (CD8 +), T-hjelper-celler (CD4 +), B-celler (CD20 +), makrofager (CD68 +), mastceller (CD117 +), mononukleære celler (CD11c +), plasmaceller og aktiverte-T-celler (MUM1 +), aktivert-T-celler, B-celler, og myeloide celler (PD1 +), og neutrofile granulocytter (myeloperoksidase +) i forskjellige lungecancertyper, kreft scener, og knutestatus.
Etter avtale med studier av Ruffini
et al
. [16], har vi funnet en økning i antall CD3
+ lymfocytter i lungekreft vevet sammenlignet med friske donor lungene. Imidlertid analyse av hvordan T-celler påvirke kliniske resultatet har ofte gitt motstridende resultater. Kilic
et al
. [18] rapporterte at høyere nivåer av tumor-infiltrerende lymfocytter innenfor store lungesvulster korrelerer med en redusert risiko for tilbakefall av sykdommen, mens Kawai
et al
. rapporterte ingen sammenheng mellom antall tumor-infiltrerende lymfocytter og pasient overlevelse [17]. I vår studie, i tillegg til generell analyse av tumor-infiltrerende lymfocytter, analyse av spesifikke T-celleundergrupper viser en signifikant økning i tumor infiltrerende T-hjelperceller (CD4
+) så vel som cytotoksiske T-celler (CD8
+) sammenlignet med friske donor lungene. Tumor-infiltrerende lymfocytter antas å spille en viktig rolle i anticancer immunosurveillance [17]. CD8
+ T-celler gjenkjenne og ødelegge kreftceller, mens CD4
+ celler hjelpe CD8
+ T-celler i tumor avvisning. Derfor kan deres antall og lokalisering i tumorvev påvirke tumorgenisitet [26]. Selv om høye i antall, CD8
+ T-celler som infiltrerer lungesvulster kan være dysfunksjonell skyldes tumor microenvironmental faktorer som senere kan føre til redusert antall effektor CD8
+ T-celler [27]. Disse endret CD8
+ T-celler kan også frigi stoffer som fremmer tumorprogresjon. Dermed vil en dypere forståelse og disseksjon av bidrag fra ulike CD4
+ og CD8
+ T-celle subpopulasjoner (f.eks Th1, Th2, Th17, TC9, Tc17) er nødvendig.
Blant fagocytter og granulocytter, observerte vi at et høyere antall infiltrere makrofager, mastceller og neutrofiler positivt korrelert med tumorstadium i humane lungekreftpasienter. Tettheten av makrofager i tumor holmer og forholdet mellom makrofager som ligger i disse øyer til stromale makrofager er positive prognostiske faktorer for pasientoverlevelse [17, 28]. I kontrast, har andre studier antydet at både M1 og M2 makrofager favorisere kreftutvikling [29] og deres tall innen kreft kan være negative prognostiske faktorer [30]. Vi observerte at makrofag infiltrasjon positivt korrelert med tumorstadium og lymfeknutestatus /metastasering i humane lungekreftpasienter som tyder på et viktig bidrag til disse tumorassosierte makrofager i lungekreft progresjon og metastasering. For å bekrefte betydningen av makrofager, bør fremtidige studier adressere subtyper av makrofager til stede i mikromiljøet av lunge svulst siden nyere studier tyder på at i løpet av kreftutvikling, kan makrofager polarisere til M1 (anti-tumorigen) og M2 (bidra til kreftutvikling) subtyper og dermed kan utøve forskjellige effekter [31]. Videre må vi forstå hvordan toveis krysstale mellom makrofager og kreftceller påvirker disse cellene samt dissekere de underliggende molekylære mekanismene [32]. Vi har nylig gitt bevis for at makrofag og kreftcelle krysstale via CCR2 og CX3CR1, en grunnleggende mekanisme kjører lungekreft [12]. Disse funnene antyder at den terapeutiske strategi med å blokkere CCR2 og CX3CR1 kan vise seg å være gunstig for å stanse lungekreft progresjon.
Når det gjelder mastceller, Welsh og medarbeidere [28] har vist at en øket holme /stromal mastcelle-forholdet er en fordel uavhengig prognostisk faktor, mens Kawai
et al
. [17] fant ingen sammenheng med klinisk utfall. Her har vi vist at mastcelleantall var høyere i tumorvev sammenlignet med friske donorer og ble vesentlig forhøyet i stadium III kreft sammenlignet med stadiet I.
nøytrofile granulocytter har fått økt oppmerksomhet som en ny type av tumor- infiltrerende immunceller som spiller en rolle i tumorvekst. Men lite er kjent om deres rolle i lungekreft. Det har blitt foreslått at et økt antall neutrofile har blitt observert i den bronkoalveolare vaskevæske fra pasienter med bronchioloalveolar karsinom, og fungerer som en uavhengig prediktor for klinisk resultat [33]. Her vises en forhøyet antall neutrofiler i lungecancerprøver, sammenlignet med frisk lunge og en sterk sammenheng med avanserte stadier av lungekreft.
Dendrittceller er et potent, heterogen gruppe av antigen-presenterende celler som er viktige for primær immunresponser mot karsinom. Vi har funnet en signifikant økning i CD11c-positive celler i tumormassen i avansert stadium kreftprøvene sammenlignet med friske donorer. Vi spekulerer i at de aller fleste av disse cellene svarer til dendrittiske celler, men vi kan ikke utelukke at en del kan være monocytter, makrofager eller nøytrofile, som også uttrykker CD11c [34]. Selv om vi ikke vurdere modenheten av dendrittiske celler, tidligere arbeid [35] antydet at i det minste noen av de tumor-infiltrerende dendrittiske celler viser en umoden fenotype i ikke-småcellet lungekreft, og at dette kan skyldes flere tumor- avledet faktorer.
Blant de andre antigen-presenterende celler, har vi funnet en økt antall CD20-positive B-celler i lungecancerprøver, sammenlignet med frisk donor vev. Som rollen av B-celler i kreft progresjon er heller diskuteres [16, 19, 36], vi i tillegg vurderes antall MUM1-positive plasmaceller i svulsten og sunn menneskelig lungevevet. Plasmaceller stammer fra B-celler på deres møte med en fremmed antigen og er de eneste produsentene av antistoffer [37]. Vi har funnet øket antall av plasmaceller i kreftvevet sammenlignet med donor lunger, et resultat som var uavhengig av kreft stadium, så vel som andre målte parametere. Rollen til plasmaceller i solide svulster har ikke blitt intensivt undersøkt, og dermed bare noen få rapporter om deres rolle i lungekreft eksisterer. Lohr og kolleger viste at infiltrasjon av modne plasmaceller i svulstvev er assosiert med forlenget overlevelse [38]. En annen studie rapporterte infiltrasjon av IgG4-positive plasmaceller i prøver av stadium I plateepitelkarsinom som ble assosiert med gunstig prognose [39].
PD1 er et immunoglobulin super medlem finnes primært på umoden CD4
-CD8
