Abstract
Akt /protein kinase B er en sentral komponent nedstrøms phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) sti, hvis virksomhet regulerer balansen mellom celle overlevelse og apoptose. Fosforylering av Akt skjer på to viktige områder enten på Thr308 området i aktivering loop eller på Ser473 området i den hydrofobe motiv. Den fosforylert form av Akt (Pakt) er aktivert for å fremme celle overlevelse. Mekanismene for Pakt defosforylering og hvordan signaltransduksjon av Akt veien er avsluttet er fortsatt i stor grad ukjent. I denne studien har vi identifisert et nytt protein fosfatase CSTP1 (komplett s transactivated protein 1), som samhandler og dephosphorylates Akt spesielt mot Ser473 stedet
in vivo Hotell og
in vitro
, blokker cellecyklusprogresjonen og fremmer celle apoptose. Effektene av CSTP1 på celleoverlevelse og cellesyklus ble opphevet ved uttømming av fosfatase domenet CSTP1 eller uttrykk for en konstitutivt aktiv form for Akt (S473D), noe som tyder Ser473 stedet Akt som en primær celle mål av CSTP1. Ekspresjon profilanalyse viste at CSTP1 uttrykk er selektivt nedregulert i ikke-invasive blærekreft vev og over-ekspresjon av CSTP1 trykkes størrelsen av svulster i nakne mus. Kaplan-Meier-kurver avslørt at redusert uttrykk for CSTP1 innblandet betydelig redusert tilbakefall overlevelse hos pasienter led av ikke-invasiv blærekreft
Citation. Zhuo DX, Zhang XW, Jin B, Zhang Z, Xie BS, Wu CL, et al. (2013) CSTP1, en Novel Protein Phosphatase, blokker Cell Cycle, fremmer celle apoptose, og Undertrykker Tumor Vekst av blærekreft ved Direkte Dephosphorylating Akt på Ser473 nettstedet. PLoS ONE 8 (6): e65679. doi: 10,1371 /journal.pone.0065679
Redaktør: Ferenc Gallyas, Universitetet i Pecs Medical School, Ungarn
mottatt: 11. desember 2012; Godkjent: 17 april 2013; Publisert: 17 juni 2013
Copyright: © 2013 Zhuo et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Science Foundation of China National bevilger 81272827 og 30971627. de finansiører hadde noen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. forfatterne har erklærte at ingen konkurrerende interesser eksisterer.
Innledning
Blærekreft er den nest vanligste kreftformen i urogenitalsystem, med 350.000 nydiagnostiserte tilfeller og over 145 000 dødsfall hvert år på verdensbasis [1]. Fordi langsiktig overvåkning av pasientene er nødvendig, sammen med eventuelle tilbakefall av tumorer og andre komplikasjoner, behandling av blærekreft vanligvis koster mye penger. Ifølge forskjellene i kliniske utviklingen, patologi og molekylær endring profiler, er blærekreft klassifisert i to typer karsinom: den ikke-muskel invasiv overfladiske, papillær karsinom og muskel invasive karsinomer [2]. Den ikke-muskel invasiv overfladiske, papillær karsinom er vanligvis lav livstruende, men med høy forekomst og høye tilbakefall, mens muskel invasive karsinomer ofte føre til fjernmetastaser og raske dødsfall [3].
Flere signalveier er implisert i initiering og progresjon av kreft i urinblæren, inkludert mutasjoner i PI3K /akt og Ras /MAPK onkogen bane måte komponenter og endringer i tumordempere, slik som p53 og Rb. Det er økende bevis som indikerer at endringer i disse pathway komponenter ikke bare i forbindelse med oppstart av blære kreft, men også sterkt korrelert med tilbakefall av sykdommen, progresjon og overlevelse. For eksempel er forsterkningen av funksjons mutasjoner av Ras, FGFR3, PIK3CA ofte innblandet i den ikke-muskelen invasive overflatiske, papillær karsinom, mens tap av funksjons endringer av p53 og Rb gener finnes oftere i aggressive, muskel invasive karsinomer [4] -. [6]
phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) pathway regulerer balansen mellom celle overlevelse og apoptose, og denne balansen er ofte forstyrret i mange typer kreft hos mennesker, inkludert de menneskelige uroteliale blære kreft [2 ]. Akt er en sentral nedstrøms komponent av PI3K vei, som kan aktiveres ved sekvensiell fosforylering på to steder konserverte i AGC-kinase-familien [7]. For eksempel kan en oppstrøms kinase PDK-1 fosforylere det Thr308 området i aktiveringen løkke av akt1 [8], [9], som utløser autofosforylering av akt1 ved sin C-terminale Ser473 [10], og således fullstendig aktiverer akt1. Akt signalisering kan sies opp av to mekanismer: fjerne den aktive lipid andre messenger som er katalysert av lipid fosfatase PTEN (fosfatase og tensin homolog slettet på kromosom ti) [11], og defosforylering av den aktiverte Akt. Akt kan også være direkte dephosphorylated av PP2A-type fosfataser [12] eller andre protein fosfataser som PHLPP1 (PH domene leucine-rik gjenta protein fosfatase 1) og PHLPP2 [13], [14].
Her rapporterte vi en roman protein fosfatase, betegnes den fullstendige s transactivated protein 1 (CSTP1) [15], som uttrykk ble selektivt redusert i ikke-muskel invasiv blærekreft. For å gjøre en ytterligere forståelse av betydningen av CSTP1 i blæren karsinogenese, i denne studien, vil vi gå dypt innblikk i. virkningene av CSTP1 for blærekreft cellesyklus, apoptose og tumordannelse in vivo, og de understrekede molekylære mekanismer; ii. de molekylære mekanismene gjennom hvilke CSTP1 utøver sin biologiske funksjon; iii. betydningen av redusert uttrykk for CSTP1 på tilbakefall og prognose av ikke-invasiv blærekreft.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Denne studien ble godkjent av etikkomiteer av Peking University Først Hospital (Permit Number: 2008 [96]), og skriftlig informert samtykke ble innhentet fra hvert fag. Alle dyreforsøk ble utført i henhold til anbefalingene i Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr i Health Science Center of Peking University. Protokollen ble godkjent av etikkomiteen av dyreforsøk ved Peking University Først Hospital (Permit Number: J201112).
Pasienter
Åtti-seks blærekreftpasienter som nylig ble diagnostisert i Institute of Urology, ble Peking University innrullert i denne studien. Blant dem, 62 tilfeller hadde ikke-invasiv blærekreft og gjennomgikk organ bevar etter transuretral reseksjon av blæren svulster (TURBT). Mediet alder (± SD) av de 62 pasientene var 65,3 ± 11,5 år (40 menn og 22 kvinner).
Cell Culture
RT4, SV-HUC1, EJ, og T24 celler ble dyrket i RPMI 1640 medium supplert med 10% FBS, 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin. Hela og 293T-celler ble dyrket i DMEM medium supplementert med 10% FBS og 100 U /ml penicillin. Sf9 celler ble opprettholdt i Sf-900 II SF medium som inneholder penicillin /streptomycin ved endelig konsentrasjon (50 enheter /ml penicillin, 50 ug /ml streptomycin) ved 27 oC.
Real Time PCR
Total RNA ble ekstrahert ved hjelp av TRIzol reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) i henhold til produsentens protokoll. Den første tråd cDNA ble syntetisert ved anvendelse av Superscript TMIII første trådsett (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). GAPDH ble anvendt som en intern kontroll. CSTP1_RT og GAPDH_RT primere som brukes i denne undersøkelsen er angitt i tabell 1. Forskjellen i ekspresjon av CSTP1 mRNA ble beregnet ved bruk av 2-ΔCt fremgangsmåten beskrevet av Schmittgen [16].
dyreforsøk
Seks til åtte uker gammelt hårløse mus med BALB /c bakgrunn ble kjøpt fra Peking University. Den 5 x 106 av EJ-celler overuttrykkende CSTP1 eller CSTP1 ΔPP2Ac og kontrollceller ble injisert subkutant i mus. Størrelsen av svulster ble målt en gang i uken med en skyvelære, og svulstvolum ble beregnet ved hjelp av formelen π /6 × lengde × bredde2. Hvert punkt representerer gjennomsnitt ± S.D. for forskjellige dyre målinger (n = 6).
Antistoff Fremstilling
Anti-CSTP1 polyklonalt antistoff fremstilt ved immunisering av kaniner med 20-mer peptid, IDEDDDYYFNLSKSTRKKLA, og antiserum ble renset ved affinitetskromatografi .
plasmid Konstruksjon
den kodende region av CSTP1 ble oppnådd fra normale blære endotel-cDNA ved anvendelse av primere CSTP1_MYC_F og CSTP1_MYC_R, og klonet inn i pcDNA3.1 myc /sin C-vektor for å danne rekombinant plasmid pcDNA3 0,1 myc /hans C -CSTP1. Alle primere brukt i denne undersøkelsen er angitt i tabell 1. For å generere GFP fusjonskonstruksjon, ble hele den kodende regionen til CSTP1 amplifisert ved anvendelse av primere CSTP1_GFP_F og CSTP1_GFP_R, og subklonet inn i pEGFP-N1 ekspresjonsvektor som pEGFP-CSTP1. Den lentivirus uttrykk plasmid pZsG-CSTP1 ble konstruert gjennom innsetting PCR produkt forsterket av CSTP1_ZsG_F og CSTP1_ZsG_R inn pZsG plasmid. pZsG-CSTP1 ΔPP2Ac ble oppnådd ved anvendelse av primere CSTP1ΔPP2Ac_F og CSTP1ΔPP2Ac_R og produktene ble ligert på nytt ved anvendelse av T4 DNA-ligase. Den kodende region av akt1 ble amplifisert med primerne Akt_Tag_F og Akt_Tag_R og klonet inn i pCMV Tag-2B plasmid. For bygging av Akt (S473D) phosphomimetic mutant, ble villtype akt1 først klonet inn pZsG plasmid ved hjelp av PCR (primere Akt_ZsG_F og Akt_ZsG_R er gitt i tabell 1). Punktmutasjon i akt1 (Ser473) som konverterer Ser til Asp ble generert ved hjelp av QuikChange seterettet mutagenese kit (Stratagene, La Jolla, CA, USA) etter produsentens instruksjoner med følgende primere (Akt_Mut_F og Akt_Mut_R, tabell 1). For bakteriell uttrykk for CSTP1 protein, ble CSTP1 cDNA klonet inn i Dyre 42a vektor med primere (CSTP1_pET_F og CSTP1_ pET_R, tabell 1).
RNA interferens
Den menneskelige CSTP1 siRNA målsekvenser (CSTP1_siRNA_target , Tabell 1) står i forhold til det første nukleotidet til startkodonet av den humane CSTP1 kodende sekvens. En ikke-beslektet, ble egge siRNA anvendt som den negative kontroll (CSTP1_siRNA_neg, tabell 1). SiRNA ble syntetisert ved Shanghai Genechem Co., Ltd, Kina. CSTP1 knockdown ble utført ved transfeksjon av siRNA i MCF celler ved hjelp Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) i henhold til produsentens instruksjoner.
Northern Blot analyse
Total RNA ble ekstrahert fra tumor cellelinjer ved hjelp TRIzol regent (Invitrogen, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. Tyve mikrogram av total RNA prøver ble denaturert, størrelse fraksjonert ved elektroforese i 1,2% agarose-formaldehyd-geler og overført til magna nylon overføringsmembran (Osmonics Inc i Minnetonka, MN, USA). For påvisning av endogene CSTP1 mRNA, ble ORF av CSTP1 skåret ut fra pcDNA3.1 myc /sin C-CSTP1 plasmid, merket med [α-32P] dCTP ved bruk av Prime-a-Gene etikettsystemet (Promega, Madison, WI, USA) . Intern kontroll av GAPDH ble oppnådd ved PCR-metoden med primere (GAPDH_NB_F og GAPDH_NB_R, tabell 1) og er merket som ovenfor. Hybridisering ble utført i ExpressHyb hybridisering løsning (Clontech, Mountain View, CA, USA) i henhold til produsentens anvisninger.
In vitro fosfatase analyse
293T celler ble transfektert med pcDNA3.1 myc /hans C-CSTP1 plasmidet ved hjelp av kalsiumfosfat-transfeksjon metode. Etter 48 timer ble cellene lysert i fosfatase-lagringsbuffer. Fusjonsproteinet CSTP1-His ble renset ved EZview Red HIS-Select HC Nickel Affinity Gel (Sigma, Ronkonkoma, NY, USA). Proteiner ble brukt for fosfatase analyse ved hjelp Serine /Threonine fosfatase analyse System (Promega, Madison, WI, USA) i henhold til produsentens instruksjoner.
For å undersøke hvorvidt renset CSTP1 kunne dephosphorylate Akt, CSTP1 ble uttrykt som en GST fusjonsprotein i BL21 (DE3) bakteriell og renset med glutation-sefarose. De Defosforylering reaksjoner ble utført som beskrevet av Tianyan Gao [13].
Baculovirus Vector Construction, Virus Emballasje
For å få Hans merket akt1, full lengde kodende område for akt1 ble først klonet inn pcDNA3.1Myc /His C-plasmidet ved hjelp av PCR med primere Akt_His_F og Akt_His_R (tabell 1), og deretter, akt1-His-kodende sekvensen ble fremstilt ved PCR med primere Akt_Bac_F og Akt_Bac_R (tabell 1) med pcDNA3.1Myc /His C-akt1 plasmid som mal. Produktet ble subklonet inn i BamHI og Xhol områder av pFastBacTM baculovirus shuttle vektor (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Det rekombinante pFastBacTM donor plasmid er forvandlet til DH10BacTM for de innarbeides i bacmid. Hvite kolonier inneholde rekombinant bacmid de ble valgt for isolering av rekombinant bacmid DNA. For å generere viral partikkel, ble Sf9-celler i 6-brønners plater transfektert med det rekombinante CSTP1 bacmid-DNA i CellfectinTM (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Fem dager senere ble mediet samlet og supernatanten ble reservert som P1 viral lager.
Flow Cytometry Analyse
For apoptose-analysen ble cellene behandlet med 10
-8 mol /l gemcitabin eller 2 mg /ml cisplatin respektivt. 48 timer senere ble cellene innhentet og dobbel farget med Annexin V-FITC og PI (keygen, Nanjing, Kina). Celle apoptose ble analysert ved flow-cytometri (BD Biosciences, San Jose, CA, USA).
For cellesyklusanalyse, ble cellene dyrket i standard RPMI1640 med 10% FBS til omtrent 40% confluencey, og dyrket med 2 mM tymidin i 19 timer. Celler ble tappet for tymidin og inkubert i 9 timer inntil 2 mM tymidin ble tilsatt for andre gang, og cellene ble dyrket i ytterligere 16 timer. Etter fjerning av tymidin igjen, tymidin-synkroniserte celler ble dyrket i fullstendig medium, og oppsamlet ved forskjellige tider for cellesyklusanalyse. Generelt ble cellene vasket to ganger med PBS-oppløsning og fiksert med avkjølt 70% alkohol ved -20 ° C i 24 timer. Celle sedimentet ble oppsamlet ved sentrifugering, vasket to ganger med PBS-oppløsning, inkubert med 20 ul RNase A (20 mg /ml) i 30 minutter ved 37 ° C, og farget med 25 ug /ml PI i 30 minutter ved romtemperatur. Cellesyklus distribusjon ble deretter evaluert ved hjelp av flowcytometri (BD Biosciences, USA).
Immunohistochemistry Analyse
Fire-mikrometer seksjoner fra formalinfiksert parafin-embedded vev ble montert på poly-L-lysin -belagte lysbilder og deretter deparaffinized i xylen og rehydrert gjennom alkohol til destillert vann. Endogen peroksidaseaktivitet ble blokkert med 3% hydrogenperoksid i 15 minutter ved romtemperatur. Etter at trykket koking lysbildene i 10 mM EDTA (pH 8,0) i 3 minutter ble snittene inkubert over natten ved 4 ° C med kanin-anti-CSTP1 antistoff (1:200). Primære antistoffer ble detektert ved anvendelse av en to-trinns EnVision System (Dako, Danmark). Positive og negative kontroller ble immunhistokjemi rutinemessig anvendt. For negative kontroller ble det primære antistoff erstattet med ikke-immun kaninserum for å bekrefte dets spesifisitet.
Evaluering av CSTP1 farging ble i hovedsak i henhold til scoring kriterier som tidligere er beskrevet [17]. Immunhistokjemisk kvantitativ referanseskala som strekker seg fra 0 til 3 avhengig av intensiteten av CSTP1 proteinekspresjon. Den relative mengden av kreftceller som farget positivt for CSTP1 (0-100%) i forbindelse med vurdering av fargeintensitet, resulterte i en farge poengsum mellom 0 og 100.
Statistical Analysis
Tilbakefall overlevelse ble evaluert av Kaplan-Meier-kurver. Forskjeller mellom gruppene ble evaluert av log rank test. Sykdomsfri overlevelse ble definert som tidsrommet mellom kirurgi og registrering av innledende lokalt tilbakefall. Alle analyser ble utført av statistisk programvare SPSS 12.0 og P-verdi mindre enn 0,05 ble ansett som statistisk signifikant.
Resultater
CSTP1 mRNA uttrykk i Normal og Tumor vev og cellelinjer
CSTP1
genet ble først identifisert av Bai GQ i 2005 [15], som ble transactived ved fullstendig S-proteinet av hepatitt B-virus, og vi skal det kan være forbundet med humane kreftformer. Vi først undersøkte
CSTP1
mRNA uttrykk nivå i flere typer kreft hos mennesker, inkludert lever, bukspyttkjertel, mage, tykktarm, blære og nyrekreft. Til vår overraskelse,
CSTP1
mRNA ble redusert i betydelig grad (med 40% ~90%) i 80% (8 av 10) av blærekreft vev i forhold til paret tilstøtende ikke-cancervev, mens ekspresjonen av
CSTP1
mRNA i leveren, bukspyttkjertelen, magesekk, tykktarm og nyrekreft vev ikke endres vesentlig (fig. 1a). Deretter bestemmes ekspresjonsnivået av CSTP1 mRNA ved Northern blot i blærecancercellelinjer og SV-HUC1, en ikke-transformerte urotelialceller. Resultater av Northern blot vist en moderat uttrykk nivå av
CSTP1
mRNA i SV-HUC1 celler, men i RT4, EJ og T24 blære kreftceller,
CSTP1
mRNA kan neppe bli oppdaget (Fig. 1B). Videre to sett med microarray datasett hentet fra Oncomine avslørte også at CSTP1 mRNA uttrykk redusert i blærekreft, med p-verdier på 0,005 (opp) og-fire 2.62E (ned) henholdsvis (Fig. 1C).
(A) real-time PCR-analyse av
CSTP1
mRNA nivåer i seks typer humane kreftvevet.
CSTP1
mRNA var selektivt nedregulert i blærecancer vev sammenlignet med tilstøtende ikke-cancervev. (B) Northern blot analyse av CSTP1 mRNA i blæren kreft cellelinjer.
CSTP1
mRNA ble uttrykt på et moderat nivå i SV-HUC1 celler, men kunne knapt påvist i RT4, EJ og T24 blærekreftcellelinjer, ble GAPDH brukt som intern kontroll. (C) CSTP1 mRNA uttrykk analyse på Oncomine. Redusert CSTP1 mRNA uttrykk i blærekreft i to sett av datasettet, med p-verdier på 0,005 (opp) og henholdsvis 2.62E-4 (ned) (1, blære slimhinnen,. 2, infiltrere blære urothelial karsinom, 3, overfladisk blærekreft ).
Karakterisering av CSTP1
Bioinformatikk analyse viste at CSTP1 mRNA er 6156 bp i lengde, som koder for et protein av 314 aminosyrer (fig. 2A). Den forutsagte molekylvekt til dette proteinet er 36 kDa med den teoretiske isoelektriske punktet til 5,99. Den tilsvarende genet ble kartlagt til kromosom 16p13.12, bestående av fire eksoner og introner tre. Sekvensanalyse av det antatte proteinet viste at CSTP1 protein inneholder en PP2Ac (proteinfosfatase 2A katalytisk enhet) domene fra aminosyre 50 til 250 (fig. 2B). Fylogenetisk analyse indikerte at CSTP1 genet er konservert blant sjimpanser, hund, ku, mus, rotte, kylling, sebrafisk, og P.falciparum (Fig. 2C).
(A) nukleotidsekvensen
CSTP1
åpne leseramme og den utledede aminosyresekvens. Nukleotidsekvensen er vist i 5 «til 3» retning. Den forutsagte aminosyresekvens er vist under nukleotidsekvensen. Aminosyrerestene som svarer til det phosphorase 2A katalytiske enhet domene (PP2Ac) er i røde bokstaver. (B) Bioinformatikk analyse indikerte at CSTP1 protein inneholdt en konservert PP2Ac domene mellom 50 til 250 aminosyrer. (C) fylogenetisk analyse viste at CSTP1 protein er konservert i sjimpanse, hund, ku, mus, rotte, kylling, sebrafisk, og P.falciparum. (D) Western blot-analyse av CSTP1 ekspresjon i HeLa-celler. HeLa-celler ble transfektert med pcDNA3.1 Myc /His C-CSTP1 plasmid, 48 timer senere, ble nivået av CSTP1-Myc-fusjonsprotein testet med anti-myc antistoff. Aktin ble benyttet som intern kontroll. (E) CSTP1 vises en PP2B-lignende protein fosfatase aktivitet
in vitro
. 293T-celler ble transfektert med pcDNA3.1Myc /His C-CSTP1, 48 timer senere, ble den CSTP1-His fusjonsprotein renset for fosfatase analyse. Frigjøringen av Pi ble bestemt i nærvær av 1 mM EGTA, 50 mM MgCl
2, 5 mM NiCl
2 og 250 ug /ml calmodulin. 200 nM trifluoroperazine eller 0,5 umol okadasyre ble også lagt til oppheve fosfatase aktiviteten PP2B eller PP2A.
Deretter fikk vi bekreftet den antatte molekylvekt CSTP1 protein. Den pcDNA3.1Myc /Hans C-CSTP1 plasmider ble transfektert inn i HeLa-celler og CSTP1-Myc-fusjonsprotein ble bestemt ved western blot med anti-myc antistoff. Som vist på fig. 2D, det rekombinante plasmid uttrykte et protein med den forventede molekylvekt på 36 kDa.
Til slutt bestemmes vi hvis CSTP1 protein viste en serin /treonin fosfatase-aktivitet in vitro. 293T celler ble transfektert med pcDNA3.1myc /hans C-CSTP1 plasmider og CSTP1-His fusjonsprotein ble renset for fosfatase analyse. Den enzymatiske aktivitet ble bestemt ved å måle frigivelse av Pi fra den kommersielle syntetiske peptid-substrat inneholdende en fosfotreoninmimetikumet rest [RRA (pT) VA]. Som vist på fig. 2E, CSTP1 protein katalysert Pi løslatt fra RRA (PT) VA peptider videre PP2B spesifikk hemmer, trifluoroperazine avskaffet nesten sin fosfatase aktivitet, mens PP2A spesifikk hemmer okadasyre ikke påvirke CSTP1 aktivitet.
subcellulære lokalisering av CSTP1
for å få et innblikk i den biologiske funksjonen til CSTP1 protein, vi først analysert sin subcellulære lokalisering. GFP-merket CSTP1 ekspresjonsplasmider ble transfektert inn i HeLa-celler, og fluorescensen ble visualisert under fluorescensmikroskop. Celler transfektert med tom vektor pEGFP vist diffus fluorescens gjennom subcellulære avdelinger i cellene, mens CSTP1-GFP hovedsakelig lokalisert til cytoplasma (fig. 3), noe som tyder på at CSTP1 kan utøve sin funksjon gjennom lokalisering til cellecytoplasmaet.
HeLa-celler ble transfektert med pEGFPN1 og pEGFPN1-CSTP1 plasmid henholdsvis 48 timer senere ble cellene fiksert med 4% paraformaldehyd og visualisert ved fluorescens konfokal mikroskopi. 4, 6-diamidino-2-fenylindol-dihydroklorid farging ble brukt for å indikere cellekjernen. Resultatene var representative for tre uavhengige eksperimenter.
CSTP1 Over utfoldelse Undertrykker blærekreft celleproliferasjon og Colony Formation, men ikke Invasion
Gitt den observasjon at CSTP1 mRNA ble redusert i blærekreft vev, det antas at CSTP1 kan fungere som en tumor suppressor i blærekreft. For å undersøke rollen til CSTP1 i cellefunksjonen, vi først analysert virkningen av CSTP1 overekspresjon på celleproliferasjon. CSTP1 ble stabilt overuttrykt i EJ blærekreftceller via lentiviral infeksjon og celle proliferasjon ble bedømt ved MTT-metoden. Overekspresjon av CSTP1 inhiberte proliferasjonen av EJ-celler med 50% etter en 5-dagers kultur (fig. 4A), mens, uttømming av PP2Ac domene nedsatt vekst-inhibering evne CSTP1 på EJ-celler med 80% (Fig. 4A) . I samsvar med resultatene av MTT-analysen, overekspresjon av CSTP1 reduserte kolonidannelse kapasitet på EJ celler, og uttømming av PP2Ac domene reddet kolonidannelse evne til EJ celler (Fig. 4B). Lignende resultater ble oppnådd i en annen blærekreft cellelinje T24 (data ikke vist).
(A) EJ celler ble transduced med lentiviruses overekspresjon CSTP1 (Lv-CSTP1), den PP2Ac domenet ditt slettet CSTP1 (Lv-CSTP1 ΔPP2Ac ), eller lenti-vektorkontroll (Lv-CTR). Celleproliferasjon ble påvist ved MTT-analyse. Data ved hvert tidspunkt representerer middelverdien ± SD av 8 prøver. Resultatene var representative for tre uavhengige eksperimenter. (B) De transduserte EJ celler ble dyrket i 14 dager, og kolonier ble farget med krystallfiolett og tellet innenfor en 40 x objektiv. Resultatene var representative for tre uavhengige eksperimenter. (C) Det xenograft tumorvekst i nakne mus ble bemerkelsesverdig undertrykket følgende CSTP1 overekspresjon. Data ved hvert tidspunkt representerer middelverdien ± SD, n = 6. (D) Kammer ble utført med transdusert EJ celler. Resultatene viste at CSTP1 har ingen virkning på celle invasjon. Viste data var gjennomsnittlig antall invadere celler (× 100 felt) ± SD fra tre uavhengige forsøk. **, P. 0,01
For å undersøke hvilken rolle CSTP1 in vivo, vi etablert menneskelige blære xenografttumorer i nude mus ved injeksjon av kontroll EJ celler eller EJ-celler som stabilt uttrykker enten villtype CSTP1 eller CSTP1 ΔPP2Ac. Vekst av de implanterte tumorer ble målt i mus (n = 6 for hver gruppe) i løpet av en periode på 8 uker. Resultatene indikerte at, i atymiske mus som mottok de EJ celler som overuttrykker CSTP1, ble tumorvekst i betydelig grad undertrykkes (~ 50%), men i atymiske mus som mottok EJ celler som overuttrykker CSTP1 ΔPP2Ac, tumorvekst nesten ikke forandring i forhold til kontrollgruppen (fig. 4C). Men CSTP1 overekspresjon hadde ingen effekt på EJ celle invasjon som bestemmes av Transwell analyser (fig. 4D).
CSTP1 Innflytelse på Cellesyklus og apoptose
For å utforske effekten av CSTP1 på cellesyklus ble lentivirus transdusert EJ cellene synkronisert ved G0 /G1 fase ved to runder med tymidin behandling og cellesyklus ble analysert ved FACS ved 0 timer, 2 timer, 4 timer og 8 timer etter frigjøring fra G0 /G1 fase ved tilsetning av fullstendig medium. Som vist på fig. 5A, overekspresjon av CSTP1 significantlly forsinkes progresjonen av cellesyklusen. Sammenlignet med kontrollceller, celler som overuttrykker CSTP1 oppviste en lavere prosentandel av celler i S-fasen i to timer og fire timer etter frigjøring fra G0 /G1 fase. Videre, en lavere prosentandel av G2 /M-fase-celler ved 8 timer etter frigjort fra cellesyklusblokkerings ble også observert i CSTP1-overekspresjon cellene, mens cellene som overuttrykker CSTP1 ΔPP2Ac ikke viste forsinket cellesyklusprogresjon. For å bekrefte effekten av endogent CSTP1 på cellesyklusen, ble CSTP1 protein banket ned av siRNA transfeksjon i SV-HUC1 celler som viste en moderat CSTP1 uttrykk (Fig. 1B). CSTP1 protein var effektivt nedregulert ved spesifikk siRNA transfeksjon (fig. 5B), og den reduserte ekspresjonen av promo CSTP1 celleproliferasjon ved å heve prosentandelen av celler i S-fasen (fig. 5C).
(A) EJ celler som overuttrykker CSTP1 (Lv-CSTP1), CSTP1 ΔPP2Ac (Lv-CSTP1 ΔPP2Ac) og kontrollceller ble behandlet med to runder med 2 mM tymidin. Celle sykluser ble analysert ved FACS etter utgivelsen fra G0 /G1 fase på angitte tidspunkt. Resultatene var representative for tre uavhengige eksperimenter. (B) Immunoblotting av CSTP1 i ekstrakter av SV-HUC1cells 48 timer etter transfeksjon med en kontroll siRNA (Mock) eller en siRNA for CSTP1 (CSTP1 siRNA). (C) Cellesyklus analyse av SV-HUC1 celler etter transfeksjon med kontroll siRNA eller siRNA for CSTP1. *, P 0,05. Resultatene var representative for tre uavhengige eksperimenter.
For å undersøke hvilken rolle CSTP1 på celle apoptose, EJ celler som overuttrykker CSTP1 eller CSTP1Δ PP2Ac og kontrollceller ble dyrket i komplett medium, med eller uten gemcitabin og cisplatin, to brukte kjemoterapi narkotika i blærekreft behandling. FACS Resultatene viser at overekspresjon av CSTP1 alene bare litt indusert EJ celler apoptose, men når cellene ble behandlet med kjemoterapi narkotika, økt dødelighet ble observert i CSTP1-overekspresjon celler, og uttømming av PP2Ac domene dempes dette dødsbringende evne CSTP1 dramatisk (fig. 6).
EJ-celler som stabilt over-uttrykker CSTP1 eller CSTP1 ΔPP2Ac og kontrollceller ble dyrket i fullstendig medium med eller uten gemcitabin (10
-8 mol /l) og cisplatin ( 2 ug /ml), 48 timer senere ble cellene dobbel farget med annexin V-FITC og PI, ble celle apoptose analysert ved FACS. Resultatene var representative for tre uavhengige eksperimenter. **, P. 0,01
CSTP1 Samhandler og Dephosphorylates Pakt ved Ser473 Side
For å utforske de understrekede mekanismene som er ansvarlig for den forhøyede apoptose og tilbakestående celle syklus av blære kreft celler mediert av CSTP1, søker vi å finne signalveier nedstrøms CSTP1 overekspresjon. Signalveier som vanligvis er involvert i kreft biologi, ble cellesykluskontroll eller celleproliferasjon undersøkt i CSTP1-overekspresjon EJ celler ved analyse av luciferase aktivitet ved hjelp Cignal Reporter Assay Kit. Resultatene viser at FOXO faktor hadde en mer robust transkripsjonen aktivitet i CSTP1-overuttrykkende celler (Fig. 7A). Økningen av FOXO aktivitet ble ytterligere demonstrert ved reduksjon i fosforyleringstilstanden av FOXO3A ved Thr32 området etter CSTP1 overekspresjon (fig. 7B). Siden Akt kinase er den primære negativ regulator oppstrøms for FOXO faktor, antok vi at Akt kinase-aktivitet kunne redusert i CSTP1-overekspresjon celler. For å bekrefte denne hypotesen, den fosforylert Akt på Thr308 eller Ser473 området, som representerer aktivering staten Akt ble oppdaget. Western blot resultatene vist at overekspresjon av CSTP1 redusert nivået av fosforylert Akt ved Ser473 stedet, men nivået av fosforylert Akt ved Thr308 var uendret (fig. 7B). Siden CSTP1 er nedregulert i blærekreft vev, så vi spurte om tap av CSTP1 uttrykk i urotelialceller kan resultere i aktivering av Akt kinase og inaktivering av FOXO faktor. I samsvar med den CSTP1 overekspresjon analysen, knockdown av CSTP1 i SV-HUC1 økt fosforylering nivå av Akt på Ser473 stedet og FOXO3A på Thr32 området (Fig. 7C). For ytterligere å undersøke effekten av CSTP1 overekspresjon på aktiviteten til Akt, vi også undersøkt fire andre kjente proteiner som er avhengig av Akt for fosforylering, GSK3α, GSK3p, p70S6K, og TSC2. Til vår overraskelse har CSTP1 overekspresjon ikke påvirker fosforylering status av GSK3α, GSK3P, p70S6K, og TSC2 (fig. 7B).
(A) EJ celler som overuttrykker CSTP1 og kontrollceller ble transfektert med en serie av cignal rapportert plasmid, 48 timer senere, luciferaseaktivitet ble målt ved anvendelse av luciferase-analysesystemet med et luminometer. luciferase reporter-baserte signal er normalisert til ekspresjon av en kotransfektert Renilla luciferase kontroll plasmid. (B) Western blot analyse av fosforyleringen nivåer av FOXO3A, Akt, GSK3α, GSK3p, p70S6K og TSC2 i EJ celler som overuttrykker CSTP1. Ufosforylerte FOXO3A, Akt, GSK3α, GSK3p, p70S6K og TSC2 proteiner ble detektert som internkontroll. (C) Western blot analyse av fosforyleringen nivåer av FOXO3A og Akt etter banket ned av CSTP1 i SV-HUC1 celler. (D) CSTP1 samhandler med Akt i 293T celler. 293T celler ble transfektert med pcDNA3.1-CSTP1 og Flag-Akt uttrykke plasmider, samhandling mellom CSTP1 og Akt ble analysert ved co-ip eksperimentere med anti-Flag (up panel) eller anti-CSTP1 antistoff (lav panel). (E) Defosforylering av Akt av renset CSTP1
in vitro
. Pure Hans-Akt ble inkubert med GST-merket CSTP1 eller GST-merket CSTP1ΔPP2Ac i fosfatase buffer. For en negativ kontroll ble CSTP1 protein utelatt fra reaksjonsblandingen (Ctr). (F) EJ celler ble overexpressed CSTP1 (Lv-CSTP1) eller CSTP1 (Lv-CSTP1) pluss fosfor-mimetisk S473D konstruere av Akt (ca-Akt) av lentivirus, ble cellesyklus analysert ved FACS. Alle forsøkene ble utført minst tre ganger.
Deretter testet vi om CSTP1 kan direkte binde seg til og dephosphorylate fosforylert Akt på Ser473. Som vist på fig. Som vist på fig. Som vist på fig.
