Abstract
Prosessen med peritoneal metastaser innebærer diapedese av intra Kin-buk ekspandert mage kreftceller gjennom mesothelial cellemonolagene; Men de tilhørende molekylære mekanismene for denne fremgangsmåten er fortsatt uklart. Heterocellular gap-junctional interkommunikasjon (GJIC) mellom magekreftceller og mesothelial celler kan spille en aktiv rolle under diapedese. I denne studien oppdaget vi uttrykk for connexin 43 (Cx43) i grunnskolen mage kreft vev, intraabdominale ekspandert kreftceller, og matchet metastatiske peritoneal vev. Vi fant at uttrykket av Cx43 i grunnskolen mage kreft vev var betydelig redusert; intra-abdominale ekspandert kreftceller og matchet metastatisk peritoneal vev utstilt økende uttrykk sammenlignet med primære mage kreft vev. BGC-823 og SGC-7901 menneskelige mage kreftceller ble konstruert for å uttrykke Cx43 eller Cx43T154A (en mutant protein som bare par gap veikryss, men gir ingen interkommunikasjon) og samtidig var dyrket med menneskelige peritoneal mesothelial celler (HPMCs). Heterocellular GJIC og diapedese gjennom HPMC monolagene på Matrigel-belagte dekkglass ble undersøkt. Vi fant ut at BGC-823 og SGC-7901 magekreftceller uttrykker Cx43 dannet funksjonelle heterocellular gap veikryss med HPMC monolag i løpet av én time. En betydelig økning i diapedese ble observert hos konstruert Cx43-uttrykkende celler, sammenlignet med Cx43T154A og kontrollgruppen celler, som foreslått at den observerte oppregulering av diapedese i Cx43-uttrykkende celler som kreves heterocellular GJIC. Videre studier viste at magekreftceller transmigrated gjennom inter mellomrommet mellom mesothelial celler via en paracellulære rute. Våre resultater tyder på at det unormale uttrykk for Cx43 spiller en avgjørende rolle i peritoneal metastaser og at Cx43-mediert heterocellular GJIC mellom magekreftceller og mesothelial celler kan være en viktig regulerende trinnet under metastasering. Til slutt, vi har observert at diapedese av ekspandert mage kreftceller gjennom mesothelial barrierer er en levedyktig ruten for paracellulære migrasjon
Citation. Tang B, Peng Zh, Yu PW, Yu G, Qian F, Zeng Dz, et al. (2013) Aberrant Uttrykk for Cx43 er knyttet til peritoneal metastasering av magekreft og Cx43-mediert Gap Junction Forbedrer Gastric Cancer Cell diapedese fra Peritoneal Mesothelium. PLoS ONE 8 (9): e74527. doi: 10,1371 /journal.pone.0074527
Redaktør: Johanna M Brandner, Universitetssykehuset Hamburg-Eppendorf, Tyskland
mottatt: 19. januar 2013, Godkjent: 06.08.2013; Publisert: 11.09.2013
Copyright: © 2013 Tang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av bevilgning nr 30801097 og nr 81272366 fra Natural Science Foundation of China National. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
forekomsten av magekreft er fallende, men er fortsatt en viktig årsak til kreft-relaterte dødsfall på verdensbasis. De dominerende trekk ved magekreftceller inkludere deres invasive og metastaserende kapasiteter. Peritoneal metastase er en kritisk funksjon for tumorprogresjon hos avansert magekreft [1]. Under prosessen med peritoneal metastase, gastrisk kreft-celler reagerer intercellularly med flere celletyper, og vekselvirkningen mellom de intra-abdominale ekspandert magekreftceller og de peritoneale mesothelial celler er av særlig betydning. Som kontinuerlig menneskelig peritoneal mesothelial celle (HPMC) monolayers fungere som en barriere mot peritoneal metastaser, når diapedese av ekspandert mage kreftceller gjennom mesothelial cellemono skjer, vil rikelig blodtilførsel i matrisen under mesothelium tilby et komfortabelt miljø for metastatisk adenokarsinom kreftceller og fremme deres kolonisering. Derfor diapedese av ekspandert mage kreftceller gjennom mesothelial cellemonolaget er et viktig skritt i løpet av peritoneal metastasering. Samspillet mellom disse cellene er ledsaget av intercellulær kommunikasjon (IC), som hovedsakelig skjer ved celle-celle-gap junctions [2]. Gap junctions er dannet av plasmamembran connexins, som hver består av seks connexins (CXS) [3]. Hittil har 20 forskjellige connexin isoformer blitt identifisert hos mennesker. Cx43 er en generell isoform uttrykt i de fleste epitelvev. Tidligere studier [4-6] indikerte at Cx43 uttrykk redusert i tumorigenesis og ble derfor klassifisert som en tumor suppressor. Men det er en økende mengde bevis som connexins kan være involvert i intravasation og bloduttredelse av kreftceller og spille en positiv rolle i prosessen med metastase [7,8]. Hvorvidt Cx43 mediert gap junction spiller en viktig rolle i diapedese av magecancerceller inn i peritoneal mesothelial barrieren er fortsatt uklar. For å møte den hypotesen vi undersøkte uttrykk for Cx43 i grunnskolen mage kreft vev, skrubbet mage kreftceller, og peritoneal metastatisk vev. Vi konstruerte en Cx43-uttrykke vektor og en Cx43T154A nettstedet mutasjon vektor. Deretter brukte vi to menneskelige mage kreft cellelinjer (BGC-823 og SGC-7901) som er GJIC mangelfull og ikke uttrykker noen kjente connexins [9]. Fordi mesothelial celler klink uttrykker Cx43, konstruerte vi magecancerceller for å uttrykke enten villtype Cx43 eller en setespesifikk mutant for å bestemme hvorvidt den potensielle av magekreftceller «diapedese gjennom mesothelium ville endre seg i henhold til begge eller den ene av disse tilstander. I denne studien viser vi at Cx43 uttrykk oppregulerer tumorcelle diapedese via en GJIC avhengig mekanisme
Materialer og metoder
2.1:. Reagenser og Antistoffer
Anti-connexin 43 polyklonale antistoff (Zymed, San Diego, CA, USA), Matrigel (Becton-Dickenson, Bedford, MA, USA), 1, 1′-diocta-decyl-3, 3, 3 «, 3»-tetramethylindocarbocyanine percholate (Dil, molekylær sonder, Eugene, OR, USA), Calcein-AM (Dojindo, Kumamoto, Japan), og FITC-konjugert phalloidin ble kjøpt fra Sigma (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA).
2,2 : Vevsprøver og cytologisk undersøkelse
Alle deltakere gitt skriftlig informert samtykke (fra sine foresatte der det er nødvendig). Denne studien ble utført i samsvar med prinsippene i Helsinkideklarasjonen med endringer og ble godkjent av etisk komité av South sykehus, The Third Military Medical University. Studiepopulasjonen besto av 42 pasienter som ble klassifisert som stadium IV i henhold til den syvende utgaven av UICC TNM klassifisering av ondartede svulster. Clinicopathologic variabler er oppført i tabell 1. Alle pasienter som deltok i studien gjennomgikk palliativ eller utforskende kirurgi. Primærtumor og metastatisk peritoneal vev ble samlet inn før slutten av kirurgi, og skrubbet magekreftceller ble høstet ved sentrifugering av ascites eller peritoneal lavage væske (hvis ascites ikke eksisterte). De kjerne celle laget ble smurt på et objektglass og farget med hematoxylin og eosin (HE). To erfarne cytopathologists utførte cytologiske evalueringer. CEA ble anvendt som en biomarkør for å bidra til å identifisere adenokarsinomceller ved immunofluorescens med positiv farging. Tilfeller ble ekskludert fra studien når resultatene av begge cytopathologists ikke var enige
gruppe
Antall
prosent (%)
Sex male2764.0 female1536.0Age (år) 501740,4 ≥502559.6Tumor plassering Antral2150.0 Body1228.6 Fundic911.4Pathological typen Vel differentiated24.7 Moderat differentiated49.5 Dårlig differentiated3685.8Bormann skrive I00 II12.4 III1228.5 IV2969.1Ascites Yes1535.7 No2764.3Surgical tilnærming palliativ gastrectomy2457.1 utforsk + biopsy1842.9Table 1. Kliniske og patologisk karakteristikk av 42 tilfeller av pasienter med magekreft
CSV ned CSV
2.3:. Immunohistochemistry
Parafin vevsprøver av primære svulster og metastatisk peritoneal vev ble serielt seksjonert og HE farging bekreftet eksistensen av magekreft. Påfølgende seksjoner ble deparaffinized, dehydrert, og utsatt for antigen gjenfinning i rekkefølge. Snittene ble inkubert med et kanin polyklonalt anti-Cx43-antistoff i 24 timer ved 4 ° C. Bindingsseter ble visualisert med 3, 3′-diamino-benzidin (DAB) i en 5-minutters reaksjon. Seksjonene ble kontra med Mayers hematoksylin, dehydrert, ryddet og montert. Utelatelse av det primære antistoff ble anvendt som en negativ kontroll. Immunhistokjemisk farging ble evaluert ved å tilordne en poengsum ut fra størrelsen og intensiteten av immunoreaktivitet. Farging grad ble evaluert semikvantitativt i cytoplasma og membranen som negativ (0, mindre enn 5% celler farget), positive 1 + (6-25%) celler farget, positivt 2 + (26-50% celler farget) eller positiv (3 + 50% celler farget). Den fargeintensitet ble scoret som 0 (ingen flekker), en (svak farging, gul brun), 2 (moderat farging, gul brun), eller 3 (sterk farging, brunt). . Farging resultater ble scoret som summen av omfanget og intensiteten av immunoreaktivitets, vurderer en poengsum ≥3 positiv og en poengsum 3 negative
2.4: immunfluorescens
Cx43 uttrykk i intra-abdominale ekspandert mage kreftceller ble vurdert ved hjelp av immunfluorescens. Førtito tilfeller ble registrert i vår studie. Cellene utflytende på dekkglass ble fiksert med 4% paraformaldehyd og vasket med PBS inneholdende 0,5% BSA (skylle-buffer). Cellene ble deretter inkubert i 24 timer ved 4 ° C med et anti-Cx43-antistoff (1: 150). Objektglassene ble vasket og inkubert med FITC-konjugert geit anti-kanin sekundært antistoff. Kjernene ble farget med 10 mikrogram /ml DAPI (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Objektglassene ble fotografert ved hjelp av et fluorescens mikroskop (Siemens, Tyskland). De (primære antistoffer ble erstattet av PBS) kontroller var negative for alle forsøkene (data ikke vist)
2,5. Cellekultur og Stabil uttrykk for Cx43 og Cx43 mutanter
nonmalignant menneskelig udødelig mesothelial celler Met-5A, ble innhentet fra ATCC. Disse cellene ble opprettholdt og formert i Medium 199 inneholdende 1,5 g /l natriumbikarbonat, 10% føtalt bovint serum, 3,3 nM epidermal vekstfaktor (EGF), 400 nM hydrokortison, 870 nM sink-fri bovint insulin, 20 mM HEPES, og 3,87 ug /L selenious syre (H2SeO3).
den menneskelige adenokarsinom cellelinjer BGC-823 og SGC-7901 ble innhentet fra Shanghai Institute cellen bank, Chinese Academy of Science. Cx43- og Cx43T154A-uttrykker vektorer ble konstruert ved hjelp lentiviral infeksjon. PTA2-Cx43, som inkluderte en human Cx43-kodende sekvens, ble konstruert i vårt laboratorium. Den Cx43T154A området mutasjonen vektorkonstruksjon ble oppnådd ved anvendelse av overlappende ekstensjon PCR, som kodet for et protein som har fungert som et gap junction uten IC som tidligere beskrevet [10]. CDNA av Cx43 og Cx43T154A ble innsatt i lenti-GFP vektor og transfisert inn i 293T pakkecellelinje. Den lentiviral supernatanten ble samlet opp etter 48 timer, filtrert gjennom et 0,45 mikrometer filter-og anvendt for å infisere BGC-823 og SGC-7901-celler. Mediet ble erstattet med RPMI1640 24 timer etter infeksjon, og cellene ble dyrket rutinemessig. Mer enn 90% av tumorcellene uttrykt Cx43 eller Cx43T154A etter tre runder med viral infeksjon; de lykkes infiserte celler ble samlet ved flowcytometri
2,6. Protein utvinning og Western blot analyse
De utviklet Cx43- og Cx43T154A-uttrykke BGC-823 og SGC-7901 mage kreft celler ble lysert . Protein (50 ug) fra hver celletype ble separert i en 12% SDS-polyakrylamid-gel og overført til nitrocellulosemembraner. Nitrocellulosemembraner ble blokkert med 5% fettfri tørrmelk og ble deretter probet for Cx43 proteinet ved hjelp av et polyklonalt anti-Cx43-antistoff (1: 500). Immunoblotter ble analysert med riktige pepperrotperoksidase-konjugert sekundære antistoffer (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) på et 1: 10.000 fortynning. Proteinene ble visualisert ved hjelp av en Supersignal West Pico Chemiluminescent substrat (Pierce Chemical Co.) og immunoblot ble utsatt for Hyperfilm Amersham (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA) i 30 s
2,7.: Tumor Cell /mesothelial celleadhesjonsanalyse
mesothelial celler ble dyrket til konfluens monolag på dekkglass i 24-brønners plater. Den konstruerte Cx43- og Cx43T154A-uttrykkende gastrisk kreft celler ble merket med 10 ug /ml Dil-løsning i 15 min ved 37 ° C. Dil er en vanlig brukt sonde fluorescens som viser en orange-rød fluorescens i membraner, og ble anvendt i vårt studium for å merke magekreftceller. Disse merkede celler ble deretter tilsatt til mesothelial cellemonolagene og inkubert i 1 time ved 37 ° C. Ikke-adherente celler ble fjernet ved vasking og cellene som var festet til mesothelial cellemonolagene ble fiksert med 4% paraformaldehyd. Kultur lysbilder ble montert i Mowiol (Calbiochem) og undersøkt med fluorescens mikroskopi (Leica MPS 60)
2,8. Tumor Cell /mesothelial Cell GJIC analysen
konstruert Cx43- og Cx43T154A-uttrykke BGC-823 og SGC-7901 magecancerceller ble merket i 15 minutter ved 37 ° C med 2 ml Opti-MEM inneholdende 10 ug /ml Calcein-AM og 10 ug /ml Dil. Calcein-AM er et fluorescerende substrat som spaltes i levedyktige celler til en membran-ugjennomtrengelig form at de kan passere gjennom funksjonelle gap veikryss, men ikke andre plasmamembrankanaler. Mesothelial cellemonolagene ble forbehandlet i 4 timer med 150 tim carbenoxolone (CBX) for å blokkere homotypisk GJIC og ble deretter behandlet i 15 minutter med 10 ug /ml Calcein-AM (Molecular Probes) i en Opti-MEM løsning. De velpreparerte merket magekreftceller ble lagt til Met-5A monolag på Matrigel, og heterotypic GJIC mellom magekreftceller og mesothelial cellene ble oppdaget. Fluorescens utvinning i bleket cellene vil bare skje hvis fargestoff passerer gjennom gap veikryss av tilstøtende ubleket mage kreftceller. Individuelle mesothelial celler i tilknytning til magekreftceller ble bleket i ca. 30 s ved hjelp av et Zeiss laser scanning konfokalmikroskop og en argon laser på 33% effekt i hver eksperimentell tilstand. Enkelt mesothelial celler som ikke kunne etablere GJIC ble valgt til å gjennomgå blenching som kontroller. Ubehandlede celler ble brukt som bakgrunnsmodifiserende celler. Gjennomsnittlig fluorescensintensitet av bleket /ubleket celler ble målt over tid ved hjelp av Scion bildebehandlingsprogrammer, og fluorescens utvinningsgraden ble beregnet i tillegg (Kt = (Ib-Ib0) /Iu × 100%, KT: fluorescens utvinningsgrad på tidspunktet t; Ib: fluorescensintensiteten i den blekede cellen ved tidspunktet t; Ib0: fluorescensintensiteten i den blekede cellen ved tiden t = 0; Iu:. fluorescensstyrke i det tilstøtende ublekede cellen ved tidspunktet t) [11]
2.9: transmesothelial migrasjon analysen
transmesothelial migrasjon analysen ble utført som beskrevet tidligere [12]. I korthet, en x 10
5 Met-5A mesothelial celler ble sådd ut på 12 mm dekkglass som var belagt med Matrigel (Becton-Dickenson, USA). Monolag nådd samløpet som bestemmes ved hjelp av lysmikroskopi. Dekkglass ble overført til en 24-brønners plate og dyrket i 48 timer i EGM. Gastric kreftceller ble delt tom vektor gruppe, Cx43-uttrykke gruppe, Cx43T154A-uttrykke gruppe og CBX forbehandlet gruppe (Cx43-uttrykker mage kreftceller ble forbehandlet i 4 timer med 150 tim carbenoxolone (CBX) for å blokkere homotypisk GJIC) og merket med Dil . Omtrent 1 x 10
5-celler ble tilsatt til mesothelial cellemonolagene med et forhold på 1:10 (tumorcelle: mesothelial celle). Cellene ble ko-dyrket i forskjellige tidsrom (1, 4 eller 7 h) før leve observasjon eller fiksering og farging. Blindet søkere kvantifisert diapedese ved hjelp av LSM, som beskrevet tidligere [7]. Kort fortalt ble co-kulturene fiksert og farget for F-aktin. Diapedese ble kvantifisert som antall tumorceller som var i kontakt med mesothelium og klassifisert i tre trinn i henhold til deres posisjon i forhold til mesothelium: 1) avrundet – tumorceller med en sfærisk form på den apikale overflate av mesothelium; 2) migrerende – tumorceller hadde trengt igjennom mesothelial cellemonolagene ved mesothelial celle veikryss med en del av cellelegemet ovenfor mesothelium og en del av cellelegemet spredt på Matrigel under mesothelial celle F-aktin stress-fibre; og 3) på undersiden – hele tumorcellekroppen var under planet i mesothelial cellespennings fibre. Migrering og under celler ble klassifisert som transmigrating. Omtrent 100 mesothelium heft celler ble registrert og talt per dekkglass, og alle forsøk ble gjentatt tre ganger med tredoble Dekk
2,10. Statistisk analyse
All statistisk analyse ble utført ved hjelp av SPSS programvare ( versjon 13.0). Sannsynlighetene for P 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
3,1. Cx43 uttrykk i primærsvulster og matchet metastatisk peritoneal vev
Førti-to normal epitel (100%) uttrykte Cx43 med typiske membranøs og cytoplasmatisk farging (figur 1A). Elleve av 42 primære svulster (26,2%) var positiv for Cx43, som ble betydelig redusert sammenlignet med tilstøtende normalt epitel (p 0,05). Cx43 uttrykk var heterogen i ulike vevsprøver: I godt differensierte mage kreft vev, Cx43 uttrykk viste en stor blandet (cytoplasma og membran) farging (figur 1B); moderat differensierte mage kreft vev hadde bare cytoplasma Cx43 uttrykk (figur 1C); og Cx43 ble knapt uttrykt i dårlig differensierte mage kreft vev (figur 1D). I motsetning til dette ble Cx43 ekspresjon signifikant økning i 29 av de 42 metastatiske peritoneale vev (69,0%) og oppviste typisk cytoplasmisk og membran farging (p 0,05). (Figur 1E) (tabell 2)
(A) Cx43 ble uttrykt i normal epitel med typiske membran og cytoplasmisk farging. (B) Cx43 uttrykk i godt differensierte mage kreft vev, kreftceller viste en positiv membran og cytoplasmatisk fargemønster. (C) Cx43 viste en betydelig positiv farging i cytoplasma i moderat differensierte mage kreft vev (D) Cx43 uttrykk i dårlig differensierte mage kreft vev, kreftceller viser en negativ fargemønster. (E) Cx43 uttrykk i metastatisk peritoneal vev viste en positiv fargemønster. (F) Intraabdominale ekspandert mage kreft celler ble bestemt av Hematoxylin og eosin (H og E) farging. (G, H, I) Uttrykket av Cx43 i intraabdominale ekspandert mage kreftceller ble åpnet av immunfluorescens. Original forstørrelse: (AF, × 400)
Connexin 43
Primær magekreft (tilfeller) (%)
tilknytning normalt vev (tilfeller) (%)
Metastatisk peritoneal vev (tilfeller. ) (%)
Negative (poengsum 3) 31 (73,8%) 0 (0) 13 (31,0%) Positiv (score≥3) 11 (26,2%) * 42 (100%) 29 (69,0%) . † Tabell 2. immunhistokjemi resultater for Connexin 43 uttrykk i grunnskolen mage kreft vev, ved normal mage vev og peritoneal metastatisk vev (N = 42) product: * Sammenlignet med tilstøtende normalt vev, uttrykk for connexin 43 sunket betraktelig (p 0,05); † I forhold til primær mage kreft vev, uttrykk for connexin 43 i metastatisk peritoneal vev økte signifikant (p 0,05). CSV Last ned CSV
3.2: Cx43 uttrykk i intraabdominale ekspandert magekreftceller
De fleste intraabdominale ekspandert mage kreftceller eksisterer som flercellede kuler (figur 1F). Positiv Cx43 farging ble observert i 35 av de 42 tilfellene av intraabdominale ekspandert kreftceller med blandet cytoplasma og membran flekker, og den positive rate er 83,3% (figur 1 G, H og I).
3,3 : uttrykk for eksogene Cx43 i BGC-823 og SGC-7901 magekreftceller
gastric kreftceller ble konstruert for å uttrykke funksjonell Cx43, Cx43T154A og en tom lentiviral vektor som en kontroll for å undersøke effektene av Cx43 uttrykk på biologiske oppførsel av disse cellene. Cx43 uttrykk var fraværende i den tomme vektor-gruppen, men de to andre konstruerte grupper ble funnet å uttrykke enten Cx43 eller Cx43T154A (figur 2A).
(A) Cx43 og Cx43T154A uttrykk for BGC-823 og SGC-7901 mage kreftceller etter transfeksjon. (B, C) Effekter av Cx43 på in vitro vedheft av BGC-823 og SGC-7901 magekreftceller til mesothelial celler. Adherente tumorceller ble opptalt (forstørrelse: x 200), viste resultatene at adhesjon av celler transfektert med Cx43 eller Cx43T154A var signifikant økt sammenlignet med den i celler transfektert med tom vektor (* P 0,05). Data er presentert som gjennomsnitt ± SEM
3,4. Vedheft av Gastric kreftceller til å mesothelial celler
Effekten av Cx43 på vedheft av mage kreftceller til mesothelial celler Det ble også undersøkt. Konstruerte magekreftceller som uttrykker enten villtype eller Cx43 Cx43T154A oppviste en betydelig økning i adhesjon til mesothelial celler, sammenlignet med tom vektorgruppe (P 0,05). Det ble ikke observert noen signifikante forskjeller i heft evne mellom Cx43- og Cx43T154A-uttrykker grupper (P 0,05). Dette tyder på at Cx43 fremmer magekreft celle adhesjon, som er uavhengig av GJIC (figur 2B)
1.photobleaching mesothelial celler; 2.adjacent mage kreftceller. A, før bleking; B, C, D, E, F representerer bilder i 0, 1, 2, 3, 4 min etter fotobleking, henholdsvis.
Optiske seksjoner innhentet av laser scanning konfokalmikroskopi på brenn nivåene angitt i ( A, E, i) identifiserte tre viktige faser av diapedese: runde på toppen av (A-D), migrerer gjennom (E-H), eller ligger under (i-L) mesothelium. (B) Gastric kreftceller med en rund form hadde filopodial utvidelser som presenteres i cytoplasma (piler). (H) Gastric kreftceller som ligger i mesothelial celle-celle veikryss hadde lenge spindel og tykke bunter av F-aktin presenteres nær cytoplasma (piler). (K, L) De som fullførte diapedese viste fremtredende stresset fibre fordelt løst i cytoplasma (piler)
3,5. Engineered Cx43-uttrykke BGC-823 og SGC-7901 cellene danner funksjonelle gap junction-kanaler med mesothelial cellemono
Vi samarbeider dyrket konstruert Cx43- og Cx43T154A-uttrykke mage kreftceller med mesothelial cellemono å undersøke muligheten for Cx43-uttrykker celler til å danne gap veikryss og etablere GJIC med mesothelial celler. Resultatene viser at magekreftceller i enten tom vektor-gruppen eller gruppen Cx43T154A mislyktes i å etablere GJIC med tilstøtende peritoneale mesothelial celler etter laser bleking, mens den Cx43-uttrykkende gruppe var i stand til å etablere GJIC med peritoneale mesothelial celler med hell. Den intracellulære fluorescens-intensitet ble detektert før bleking, ved øyeblikket for bleking, og enten 1 min, 2 min, 3 min eller 4 minutter etter bleking. Resultatene viser at, i Cx43-uttrykkende gruppe, den intracellulære fluorescens-intensiteten av bleket mesothelial celle falt raskt etter bleking. Fluorescens intensitet deretter gradvis gjenvunnet grunn til å farge passasje gjennom gap veikryss med tilstøtende ubleket magekreftceller, og gjennomsnittlig fluorescens utvinningsgrad var 35,6 ± 0,9% og 39,4 ± 0,8% ved 4 min etter blenching i BGC-823 og SGC-7901 celler, henholdsvis som var betydelig høyere enn i Cx43T154A og tom Vetor (p 0,05). (figur 3, tabell 3)
Gruppe
Mean fluorescens utvinningsgrad (%,
x
± s ) (t=4min)
BGC-823Cx4335.6±0.9*BGC-823Cx43T154A12.1±0.6BGC-823v13.4±0.7SGC-7901Cx4339.4±0.8†SGC-7901Cx43T154A15.3±0.4SGC-7901v14.7±0.6Table 3. Sammenligning av gjennomsnittlig fluorescens utvinningsgraden etter bleking i BGC-823 og SGC-7901 mage kreftceller (fluorescens intensitet,
x
± s)
CSV ned CSV
3.6. Morfologiske evaluering av tumorceller diapedese
Vi etablerte en
in vitro
system for å avbilde transmesothelial migrering av mage kreftceller til å undersøke mekanismen og ruten for diapedese. Denne analysen etterligner deler av beholderveggen og har blitt brukt tidligere for å analysere leukocytt-diapedese [11]. Dil-merkede tumorceller ble bedømt i henhold til deres morfologi og plassering i forhold til mesothelium. Vi definerte tre forskjellige stadier av migrasjon ved hjelp konfokalmikroskopi: avrundet (figur 4A); migrerer (figur 4E); og under (figur 4I). Tumorceller på toppen av mesothelium før diapedese oppviste en rund eller ovular form, og denne form ble opprettholdt fra den apikale (figur 4B) til den basale overflaten (figur 4C, D). Migrere kreftceller som passerer mellom tilstøtende mesothelial celler endret form fra ovular til en lang spindel med intracellulære F-aktin sammen til aktin filament bunter (figur 4F, G, H). Tumorceller som fullførte diapedese var plassert helt under mesothelium. Celleformen gradvis endret fra den lange spindelen til den rundere form, og de intracellulære F-aktin filamenter gradvis utvidet og var et tynt anordnet mellom filamenter (fig 4J, K, L). Vår studie viste at magekreftceller «diapedese skjedde via en paracellulære rute
3,7. Cx43-mediert GJIC forbedret magekreftceller diapedese
Vi co-kultivert Cx43-, Cx43T154A-uttrykke gasric kreft celler og CBX forbehandlet Cx43-uttrykkende celler med mesothelial celler i 1, 4 og 7 timer for å sammenligne deres effektivitet diapedese [1,2]. Disse cellene ble scoret ved hjelp av de beskrevne kriteriene for migrasjon. Prosentandelen av trekkende Cx43T154A og CBX forbehandlet celler var ikke signifikant forskjellig tomme vektor gruppe celler etter 7 timer med co-kultur (p 0,05), men diapedese effektiviteten av Cx43-uttrykker gruppe celler var betydelig høyere enn andre tre gruppene (p 0,05); (B) Prosent av adherente migrerende celler i SGC-7901 gruppe celler (%), sammenlignet med SGC-7901v (kontroll), en betydelig økning i diapedese av SGC-7901Cx43-celler ble observert ved 1, 4 og 7 h (* p 0,05).
Diskusjoner
Gap veikryss og connexin subenheter er nedregulert i ulike kreft [4,13,1,4]. Men siste rapportene tyder på at connexins «uttrykk er ikke alltid holdes på redusert nivå i løpet av tumor progresjon; omvendt, kan de være til stede i løpet av de senere stadier av carcinogenese, øke spredningsevne av invasive celler [2,15-11,7]. Dette ny fremvekst av connexins er tydelig observert under utviklingen av menneskelig brystkreft, hvor Cx26- og Cx43-negative primære svulster utviklet Cx26- og Cx43-positive metastaser i lymfeknuter [18,1,9]. Lignende resultater er også blitt oppnådd i musehud karsinogenese; Cx26 uttrykk er redusert i løpet av de tidlige stadier av kreftutvikling, men er restaurert i metastatiske lymfeknuter [20]. Disse studiene antyder at connexins spille forskjellige roller under prosessen med kreftutvikling. Vår studie var første gang for å undersøke uttrykket av Cx43 under ulike stadier av magekreft progresjon (primær mage kreft vev, intraabdominale ekspandert mage kreftceller og matchet metastatisk peritoneal vev). Resultatene viser en signifikant reduksjon i Cx43 ekspresjon i primære magekreft vev sammenlignet med de tilstøtende normale gastriske vev (p 0,05). I kontrast, ble Cx43 uttrykk i intraabdominale ekspandert mage kreftceller og metastatisk peritoneal vev betydelig økt. Disse resultatene tyder på at Cx43 spiller mest sannsynlig en viktig rolle i peritoneal metastaser.
For å undersøke om Cx43 uttrykk har en effekt på peritoneal metastaser, ble Cx43 transfektert inn i BGC-823 og SGC-7901 magekreftceller, og en Cx43T154A området mutasjon ble konstruert for å bestemme rollen til gapet junctional kommunikasjon i ferd med peritoneal metastasering. Heft og diapedese av kreftceller til mesothelial cellemonolagene er to viktige skritt for dannelsen av peritoneal metastaser. En
in vitro
celle adhesjon analysen viste at Cx43- og Cx43T154A-uttrykke BGC-823 og SGC-7901 celler utstilt mer effektiv vedheft til mesothelial cellemonolagene enn tomme vektor celler og at vedheft effektiviteten av Cx43T154A-uttrykke tumorceller var lik Cx43-uttrykkende celler. Disse resultater antyder at Cx43 fremmer adhesjonen av magekreftceller til mesothelial celler, som er uavhengig av gap junction kommunikasjon. Med hensyn til dens tilhørende mekanisme, hadde vår tidligere studie viste at Cx43 kan samhandle med celleadhesjon-assosierte proteiner, slik som E-cadherin, som deltar i prosessen med adhesjon [21], som kan foreslå en positiv rolle Cx43 ekspresjon i stigende celle adhesjon.
diapedese av magekreftceller gjennom mesothelial cellemono
in vitro
ble videre undersøkt i våre forsøk. Vår undersøkelse viste at den diapedese av Cx43-uttrykkende gastriske celler, ble betydelig forbedret sammenlignet med Cx43T154A-uttrykkende celler, hvilket antyder at Cx43 uttrykk påvirkes cellulær motilitet, som var i samsvar med flere tidligere rapporter [2, 14, 22, og 23]. Imidlertid er det fortsatt ikke klarlagt hvorvidt Cx43 uttrykket var forbundet med interkommunikasjon. Vi deretter undersøkt om GJIC spiller en sentral rolle i diapedese.
