Abstract
Bakgrunn
Til tross for at den vanligste bekken gynekologisk kreft i industrialiserte land, ingen målrettet behandling er tilgjengelig for pasienter med metastatisk livmorkreft. For å forbedre behandlingen, må underliggende molekylære egenskapene til primær og metastatisk sykdom bli utforsket.
metodikk /hovedfunnene
Vi utnyttet massespektrometrisk baserte mutasjonsdeteksjon teknologi OncoMap å definere hvilke typer og hyppigheten av punktsomatiske mutasjoner i livmorkreft. 67 primære svulster, ble 15 metastaser som tilsvarer 7 av de inkluderte primærsvulster og 11 livmorkreft cellelinjer screenes for punktmutasjoner i 28 kjente onkogener. Vi fant at 27 (40,3%) av 67 primære svulster næret en eller flere mutasjoner uten økning i metastatiske lesjoner.
FGFR2
,
KRAS Hotell og
PIK3CA
var konsekvent de mest muterte gener i primære svulster, metastatiske lesjoner og cellelinjer.
Konklusjoner /Betydning
Våre resultater understreker potensialet for målretting
FGFR2
,
KRAS Hotell og
PIK3CA
mutasjoner i livmorkreft for utvikling av nye terapeutiske strategier.
Citation: Krakstad C, Birkeland E, Seidel D, Kusonmano K, Petersen K, Mjøs S, et al. (2012) høy gjennomstrømming Mutasjon Profilering av primære og metastatisk livmorkreft Identifiserer
KRAS
,
FGFR2 Hotell og
PIK3CA
å være hyppig mutert. PLoS ONE 7 (12): e52795. doi: 10,1371 /journal.pone.0052795
Redaktør: Wayne A. Phillips, Peter MacCallum Cancer Centre, Australia
mottatt: 28 september 2012; Godkjent: 21 november 2012; Publisert: 27.12.2012
Copyright: © 2012 Krakstad et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. The Western Norge RHF (tilskudd nummer~~POS=HEADCOMP: 911351 og 911624), Norsk forskningsråd (tilskudd nummer~~POS=HEADCOMP: 193373 og 205404), og Den Norske Kreftforening (tilskudd nummer~~POS=HEADCOMP: 628837). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
til tross for at den vanligste bekken gynekologisk kreft i industrialiserte land, ingen målrettet behandling er tilgjengelig for pasienter med metastatisk livmorkreft. Selv om 75%, behandles i en tidlig fase, 15% til 20% gjenta seg. For pasienter med avansert sykdom ved diagnose eller tilbakevendende sykdom, er utfallet dårlig. For å forbedre behandlingen, må underliggende molekylære egenskapene til primær og metastatisk sykdom bli utforsket. Videre forbedrede verktøy for korrekt stratifisering av pasienter i henhold til risikogruppene og bedre definisjoner av potensielle mål for nye behandlingsformer er av stor betydning, og mye arbeid er gjennomført for å utvikle bedre kriterier for å velge pasienter for individuell terapi [1].
for å vurdere risikoen for tilbakevendende sykdom, tradisjonelt livmorkreft har blitt delt inn i to undergrupper, type i og type II karsinom [2]. Type I livmorkreft er assosiert med god prognose, lav karakter, endometrioid histologi og sjelden metastasere til regionale og fjerne områder [3]. I tillegg skriver jeg livmorkreft er ofte hormonreseptor positiv med
PTEN Hotell og
KRAS
mutasjoner. Type II endometrial carcinoma er assosiert med dårlig prognose, ikke-endometrioid histologi, høy klasse, tap av hormonreseptorer og endret uttrykk av p53 og p16. Likevel, til verdien av denne klassifiseringen forutsi prognose og for behandling stratifisering er begrenset som 20% av type I livmorkreft gjenta seg og 50% av type II kreft ikke [4].
Foreløpig konvensjonelle kjemoterapiregimer og anti-hormonell behandling er basis for adjuvant og systemisk behandling av residiverende eller metastatisk livmorkreft som målrettet terapi er ennå ikke tilgjengelig i klinikken. Imidlertid er mutasjons profiler søkt om valg av målrettet terapi for flere andre kreftformer og også søkt om kliniske studier lagdeling. Vår tidligere screening av et mindre antall livmorkreftpasienter identifisert somatiske mutasjoner i FGFR2, KRAS, PIK3CA, PTEN, PT53 og CTNNB1 [5]. Men denne studien ikke utelukke mulige mutasjoner i andre kjente onkogener som kan være potensielt interessant for målrettet behandling av livmorkreft. Således ble denne studien foretas for å screene for et stort panel av kjente onkogene mutasjoner i en serie av primære og metastatiske lesjoner fra endometriale kreftpasienter ved hjelp av high-throughput-metoden OncoMap [6], [7]. OncoMap gir en unik mulighet til å samtidig avhøre et stort antall kjente mutasjoner i et stort antall gener, og dermed gi mulighet for å karakterisere molekylære undergrupper av livmorkreft med en potensiell relevans for målretting nye behandlingsformer.
Metoder
Etikk uttalelse
Alle deler av studiet er godkjent i henhold til norsk lovgivning og internasjonale krav til etisk vurdering. Studien ble godkjent av norske Datatilsynet, Norsk samfunnsvitenskapelig datatjeneste, og den vestlige Regional komité for medisinsk og helsefaglig forskningsetikk, REC West (NSD15501; REK 052,01). Pasientene ble inkludert i studien etter skriftlig informert samtykke godkjent av etisk komité (REK Vest).
Prøver
Vi har studert totalt 69 pasienter for mutasjoner i 28 kjente onkogener (tabell 1 ). 23 av de inkluderte pasientene hadde tidligere blitt undersøkt for færre onkogene mutasjoner av en annen metode [5]. Pasientene ble rekruttert fra en populasjon basert pasient serie av 701 pasienter med livmorkreft prospektivt samlet på Haukeland Universitetssykehus, Norge. Alder ved diagnose, FIGO stadium, histologisk subtype og grad, behandling og oppfølging ble registrert som tidligere rapportert [8]. Fordeling av klinisk-patologisk variabel for de 69 undersøkte tilfeller var ikke signifikant forskjellig fra den større (n = 701) uselektert pasient kohort (tabell 2). Vev var tilgjengelig fra 67 primærsvulster og 15 metastatiske lesjoner fra 9 pasienter som hadde 7, tilsvarende vev fra primær lesjoner tilgjengelig for sammenligning. Flertallet av utvalgte lesjoner ble bekreftet av frosne snitt til å inneholde 80% ondartet epitel komponent med et minimum avskåret for inkludering av 50% renhet
Cellelinjer
Endometriekreft cellelinjer Hec1A, Hec1B, KLE, RL95-2, ECC1 ble kjøpt fra ATCC-LGC Standards, London, UK, MFE-280, MFE-296, MFE3-19, EFE-184, AN3-CA var fra DSMZ Tyskland og Ishikawa fra Sigma-Aldrich, St.Louis, MO. Alle cellene ble opprettholdt i medium som anbefalt av leverandør, supplert med penicillin /streptomycin (Sigma-Aldrich, St.Louis, MO).
OncoMap og DNA-sekvensering
DNA fra grunnskolen og metastatisk lesjoner ble hentet fra ferske frosne biopsier. DNA ble isolert ved fordøyelse over natten ved 65 ° C i lyseringsbuffer inneholdende proteinase K, fulgt av en standard etanolutfelling. DNA fra 11 endometrial cancer-cellelinjer ble ekstrahert ved bruk av Qiagen DNA Tissue Kit som angitt i produsenter protokoll. DNA-mengde ble målt ved bruk av Quant-iT ™ PICOGREEN® Assay (Invitrogen) og høy kvalitet av DNA sikret på en 0,7% agarosegel før genomisk DNA ble amplifisert ved hjelp av Repli-g Midi Kit (Qiagen, Tyskland) i henhold til produsentene « bruksanvisning. Amplifisert DNA ble fortynnet 1:10 i 1xTE buffer (pH 8,0) og etter hydrering i 24 timer ved romtemperatur, ytterligere fortynnet til en arbeidskonsentrasjon på 5 ng /mL i vann. Mutasjoner ble påvist i genom-DNA amplifisert ved anvendelse av en massespektrometri basert enkelt base forlengelse teknikk (Sequenom, Inc.) som tidligere beskrevet [7]. Primere for ytterligere analyser for å påvise mutasjoner er beskrevet i flere studier av kreft siden 2008 [9], [10], [11], [12], [13] ble utformet med Sequenom analysen Design Software. Etter forsterkning og mutasjon språk spesifikk probe forlengelses analytter ble oppdaget på SpectroCHIPs I og massene oppdaget ved hjelp av en Bruker matrise-assistert laser desorpsjon /ionisering-time of flight massespektrometer (Sequenom). Spektra ble manuelt anmeldt bruker Typer 4.0-programvaren (Sequenom). En liste over de mutasjonene som inngår i OncoMap og de tilsvarende aminosyre endringer er gitt i tabell S1.
For å validere hvor stor andel av de mest muterte onkogener oppdaget av OncoMap, ble genomisk DNA ekstrahert fra ferskt frosset primær svulstvev fra 199 ekstra pasienter. Totalt 264 pasienter ble screenet for punktmutasjoner i
KRAS plakater (ekson 2) og
PIK3CA plakater (ekson 9 og 20) som beskrevet [14]. Detaljer om primere og betingelser er tilgjengelig på forespørsel. Sekvenseringsreaksjoner ble analysert på en ABI Prism 3100 genetisk analysator bruker Sekvense Analysis programvare, versjon 3.7.
oligonukleotid DNA mikromatriseanalyser
En microarray datasett som tilsvarer de 69 primærtumorprøver inkludert i OncoMap skjermen ble generert. RNA ble ekstrahert ved hjelp av RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) og hybridisert til Agilent Hele menneskelige genom Mikromatriser 44k (Art.nr. G4112F), i henhold til produsentens instruksjoner. Arrays ble skannet med Agilent microarray Scanner Bundle og data ble importert og analysert i J-Express-programvaren (Molmine, Norge). Median sted signal ble anvendt som mål intensitet. Expression data ble normalisert ved hjelp quantile normalisering. Microarraydata har blitt deponert i ArrayExpress Arkiv database, https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/(ArrayExpress tiltredelse: E-mtab-1358).
En SAM (Betydningen Analyse av Mikromatrise) analyse mellom klasse i-II og klasse III ble utført for å identifisere vesentlig forskjellig uttrykte gener i henhold til histologisk grad. 306 gener ble signifikant forskjellig uttrykt (FDR 0,01) mellom de to gruppene. Hierarkisk clustering ble utført på denne listen av gener ved hjelp av vektet gjennomsnitt hydraulikk og Pearson korrelasjon som likhet tiltak. Klinisk-patologisk data og mutasjonsstatus ble kartlagt manuelt til cluster-treet for å visualisere fordelingen av mutasjonen over pasientpopulasjonen.
Resultater
OncoMap skjermen for 387 onkogene mutasjoner i 28 ofte mutert gener i kreft (Tabell S1) ble påført i 67 primære og metastatiske 15 endometrial carcinoma lesjoner så vel som 11 endometrial carcinoma cellelinjer og detektert mutasjoner i 7 av de undersøkte gener. Vi fant at 27 pasienter (40,3%) hadde punktmutasjoner i ett enkelt gen, mens 4 pasienter (6,0%) hadde mutasjoner i 2 gener. Blant de sju gener med påviste somatiske mutasjoner i grunnskolen og metastatiske lesjoner,
KRAS plakater (17,9%),
PIK3CA plakater (14,6%) og
FGFR2 plakater (10,4%) var den hyppigst muterte, mens mutasjoner i
BRAF plakater (1,5%),
EGFR plakater (1,5%),
HRAS plakater (1,5%) og
NRAS
(1,5%) var sjeldne. Frekvensen av
KRAS Hotell og
PIK3CA
mutasjoner ble validert ved hjelp av DNA-sekvensering i 264 primære tumorer (Tabell 3).
FGFR2
mutasjonsfrekvens hadde blitt validert tidligere [5]. Den vanligste enkelt mutasjon funnet av OncoMap screening var
FGFR2
aaS252W (9,0%), men den hyppigst muterte genet var
KRAS plakater (17,4%) (tabell 3). Den OncoMap skjermen av de 11 etablerte livmorkreft cellelinjer som er identifisert som forventet
KRAS
G12D og
PIK3CA
G1049R mutasjoner i både Hec1A og Hec1B, mens
FGFR2
mutasjon S252W ble funnet i MFE280 og MFE319. I tillegg ble to PIK3CA mutasjoner identifisert i MFE280 og MFE296 (E545K og P539R, henholdsvis). Vi fant ikke noen av cellelinjene for å ha mutasjoner i noen av de andre gener som inngår i OncoMap panelet.
For å utforske en mulig sammenheng mellom type mutasjoner og genuttrykksmønster i primære svulster, en hierarkisk klyngeanalyse av 306 gener signifikant forskjellig uttrykt (SAM analyse, FDR 0,01) i henhold til histologisk grad ble utført. Vi fant at det var ingen signifikant sammenheng mellom spesifikke onkogene mutasjoner og pasientgrupper basert på transkripsjonelle signaturer (figur 1). Dette funnet ser ut til å være i tråd med vår forrige rapport om et mindre datasett å bruke en tidligere generasjon av mRNA genearrays, uten berikelse for PIK3CA mutasjoner i pasientens klyngen fange aggressiv fenotype [15].
En hierarkisk clustering av 306 signifikant forskjellig uttrykt gener mellom klasse i-II og klasse III ble kartlagt med klinisk-patologisk data og mutasjonsstatus for å visualisere fordelingen av mutasjonen over pasientpopulasjonen. Grønn firkant farge indikerer god prognose grupper (Grade I-II, FIGO I-II, endometrioid type, ERα positivitet) og ingen påvist mutasjon i angitte genet, røde firkanten farge indikerer dårlig prognose grupper (grad III, FIGO III-IV, ikke- endometrioid typer, ERα negativitet) og oppdaget mutasjon i angitte genet. Svart firkant. Data mangler
For ytterligere å undersøke om mutasjon mønsteret endret seg i løpet av sykdomsprogresjon, 15 metastaselesjoner fra 9 pasienter som syv hadde primære svulster tilgjengelig for sammenligning, ble analysert for mutasjoner.
KRAS
,
PIK3CA Hotell og
FGFR2
ble funnet å være de mest muterte gener også i metastatiske lesjoner, med ingen signifikant økning i mutasjonsfrekvens (tabell 4). I to tilfeller ble mutasjoner påvist i de metastatiske lesjoner, men ikke i den primære lesjon, mens ett tilfelle med mutasjon i den primære lesjonen hadde ingen påvisbar mutasjon i den metastatiske lesjoner. Den lille prøven satt tilgjengelig for denne analysen, tumor heterogenitet og forskjeller i stromal kontaminering bør ringe for forsiktighet i konklusjonene.
Diskusjoner
aktiverende mutasjoner i spesifikke proto-onkogener kan gi onkogen -avhengighet. Slike mutasjoner er blitt identifisert i flere gener og kan drive ondartet sykdomsprogresjon. Denne rektor for onkogen-avhengighet kan utnyttes til å utvikle nye og mer målrettede terapier [16]. Foreløpig er mutasjons profiler søkt om valg av målrettet terapi for f.eks BRAF-hemmere i malignt melanom [17] og BRAF og EGFR målretting i lunge- og kolorektal kreft [18], [19]. For endometrial cancer, ingen av de nye målrettet terapi er tilgjengelig i klinikken i dag. Men flere pågående kliniske studier tar sikte på å utnytte mål støttes av fersk omfattende molekylær profilering av primær endometrial carcinoma lesjon [1], dominert av studier rettet mot phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) /AKT /mammalian target of rapamycin (mTOR) eller FGFR2. Men til vår kunnskap, har ingen tidligere studie rapportert som omfattende mutasjonsdata for et stort panel av onkogener i livmorkreft inkludert metastatiske lesjoner.
Et stort antall onkogene mutasjoner har blitt identifisert til å være viktig i kreftutvikling. Nylig har flere papirer rapportert nytten av high-throughput genotyping plattform OncoMap for å screene for mutasjoner i et stort panel av kjente kreft onkogener [6], [20], [21], [22]. Den høye graden av samsvar mellom våre funn ved hjelp OncoMap for de undersøkte genene og validert frekvens i denne studien, samt tidligere publiserte mutasjon frekvenser i endometriekreft prøver basert på tradisjonell sekvensering, er sikre. Bruke OncoMap vi fant at 40,3% av de analyserte endometriekreft prøver næret minst en mutasjon. Av de 28 onkogener inkludert, ble mutasjoner bare funnet ved høy frekvens ( 10%) i
KRAS
,
PIK3CA Hotell og
FGFR2
. Disse genene har vært knyttet til livmorkreft tidligere, både av oss [5], [15] og andre [23], [24].
I denne studien, den S252W mutasjon i
FGFR2
ble identifisert som den mest hyppige enkelt mutasjon (9%) i endometrial cancer. Den somatiske
FGFR2
mutasjoner inkluderer S252W og P253R alleler, hvor autosomal dominant mutasjoner er forbundet med medfødt utviklingsforstyrrelse Apert syndrom [25]. Vi, og andre [26], har tidligere knyttet disse mutasjonene til livmorkreft, gjennom økt svulst celle overlevelse og forankring uavhengig vekst i livmorkreft cellelinjer, og antydet muligheten for FGFR2 hemmere i muterte cellelinjer [5]. Det har også blitt rapportert at FGFR2 hemmere indusere celledød i livmorkreftceller til tross for
PTEN
inaktive mutasjoner [27]. Hyppigheten av
FGFR2
mutasjoner påvises i dag OncoMap skjerm på 10,4% er i samsvar med våre tidligere funn fra 122 livmorkreftpasienter fra samme region, finne
FGFR2
å bli mutert i 12,3 % [5]. Nylig har en frekvens i dette området på 10,3% ble også publisert av andre [23]
Flere av
PIK3CA
mutasjoner ble oppdaget ved relativt lave frekvenser ( 3%)., Men den totale hyppigheten av noen oppdaget
PIK3CA
mutasjoner var 13,4%. Vi har validert denne frekvensen av punktmutasjoner i
PIK3CA plakater (ekson 9 og 20) i 14,6% i en kohort av 264 endometrial kreftpasienter. Dette er konsistent med den rapporterte mutasjonsfrekvens på
PIK3CA
i livmorkreft i COSMIC database for
PIK3CA
mutasjoner testet for i OncoMap [28]. En potensiell relevans for målretting terapi hos pasienter som
PIK3CA
mutasjoner ble nylig støttet i en studie som viser høyere svarprosent på PI3K /AKT /mTOR-hemmere til pasienter med muterte sammenlignet med villtype
PIK3CA
i bryst og gynekologiske maligniteter [29].
KRAS
mutasjoner ble funnet i 17,9% av tilfellene, med høy frekvens av punktmutasjoner i ekson 2 (G12A, G12C, G12D og G13D), validert i 264 livmorkreftpasienter (14,7%, [14]) og også i tråd med tidligere studier (18% [30]).
KRAS
mutasjoner er blitt assosiert med lav karakter, og endometrioid histologisk subtype, men ikke med prognose [31], [32]. Interessant,
KRAS Hotell og
FGFR2
mutasjoner ble funnet å være gjensidig utelukkende, i tråd med en tidligere rapport [23]. I form av terapi KRAS mutasjonsstatus har vært knyttet til EGFR-hemmer motstand ved kolorektalkreft [33], men videre studier er nødvendig i livmorkreft for å utforske slike potensielle link.
I tråd med denne studien har vi tidligere rapporterte en lav frekvens (2%) av mutasjoner i
BRAF
i livmorkreft [30]. Interessant, med unntak av noen få mutasjoner i
NRAS
,
HRAS
,
EGFR Hotell og
BRAF plakater (1,5%), ingen andre varm- stikk mutasjoner ble identifisert i de resterende 21 onkogener screenet for, verken i primære svulster eller i metastaselesjoner.
Den nåværende arbeid brukes en versjon av OncoMap dekker 387 mutasjoner i totalt 28 forskjellige onkogener. I endometrial karsinom, de onkogener
CTNNB1 Hotell og tumorsuppressorgener
PTEN Hotell og
P53
har også blitt rapportert å være hyppig mutert [34], [35] men var ikke inkludert i den nåværende sceen og kan derfor ikke gjøres rede for. Blant de inkluderte gener og mutasjoner, har vi identifisert og validert
KRAS
,
PIK3CA Hotell og
FGFR2
å være den hyppigst muterte onkogener i livmorkreft. Selv transkripsjonen signatur mønster i henhold til histologisk grad ikke identifisere noen distinkte undergrupper knytte noen av mutasjonene til fenotype,
PIK3CA
,
KRAS Hotell og
FGFR2
mutasjoner kan likevel være av relevans for målretting nye behandlingsformer i livmorkreft. Likevel vil mer kunnskap om funksjonelle aspekter av forskjellige mutasjoner og deres implikasjoner for tiltakene mot narkotika være viktig å veilede ytterligere utvalg av pasienter for molekylært basert kliniske studier.
Hjelpemiddel Informasjon
Tabell S1.
onkogen mutasjoner og nukleotid endringer inkludert i OncoMap.
doi: 10,1371 /journal.pone.0052795.s001 plakater (docx)
Takk
Forfatterne takker Britt Edvardsen, Ingjerd Bergo, Gerd Lillian Hallseth, Bendik Nordanger, Beth Johannessen og Hua Min Hoang for teknisk assistanse. Roman Thomas takkes for å gi lab støtte og anlegg for å kjøre Oncomap skjermen.
