Abstract
Warburg effekten og svulsten hypoksi til grunn en unik kreft metabolsk fenotype preget av glukose avhengighet og aerobic gjæring. Vi viste tidligere at to ikke-giftige metabolske terapier – ketogen diett med samtidig hyperbar oksygen (KD + HBOT) og kosttilskudd keton kosttilskudd – kan øke overlevelsestiden i VM-M3 musemodell for metastatisk kreft. Vi antok at kombinere disse terapier kan gi en enda større terapeutisk fordel i denne modellen. Mus som fikk kombinasjonsterapi viste en markert reduksjon i tumorvekst og metastatisk spredning, og levde dobbelt så lenge som kontrolldyrene. For ytterligere å forstå effektene av disse metabolske terapier, preget vi virkningene av høy glukose (kontroll), lavt blodsukker (LG), keton kosttilskudd (βHB), hyperbar oksygen (HBOT), eller kombinasjonsbehandling (LG + βHB + HBOT) på VM-M3 celler. Individuelt og kombinert, disse metabolske terapier betydelig redusert VM-M3 celleproliferasjon og levedyktighet. HBOT, alene eller i kombinasjon med LG og βHB, økt produksjon ROS i VM-M3-celler. Denne studien støtter sterkt videre etterforskning i denne metabolsk terapi som en potensiell giftfri behandling for sent stadium metastatisk kreft
Citation. Poff AM, Ward N, Seyfried TN, Arnold P, D’Agostino DP (2015 ) Non-Toxic Metabolsk Forvaltning av metastatisk kreft i VM Mus: Novel kombinasjon av ketogen diett, Ketone Tilskudd og hyperbar oksygenbehandling. PLoS ONE 10 (6): e0127407. doi: 10,1371 /journal.pone.0127407
Academic Redaktør: Dhyan Chandra, Roswell Park Cancer Institute, USA
mottatt: 04.06.2014; Godkjent: 14 april 2015; Publisert: 10 juni 2015
Copyright: © 2015 Poff et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. patent 12B152PRWO; University of South Florida; DP D’Agostino, A. Poff, P. Arnold, «Targeting kreft med metabolsk terapi og hyperbar oksygen.» P. Arnold (Savind Inc.) har mottatt økonomisk støtte (ONR N000140910244) fra D. D’Agostino (USF) til syntetisere keton estere. de øvrige forfatterne har ingen interessekonflikter. Midler til dette prosjektet ble støttet delvis av en veldedig bidrag fra Scivation, Inc .; men gjorde selskapet ikke påvirke studiedesign, datainnsamling, analyse, eller tolkning av resultater . de bevilgende myndighet hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. patent 12B152PRWO, University of South Florida, DP D’Agostino, A. Poff , P. Arnold, «Targeting kreft med metabolsk terapi og hyperbar oksygen.» P. Arnold (Savind Inc.) har mottatt økonomisk støtte (ONR N000140910244) fra D. D’Agostino (USF) for å syntetisere keton estere. De øvrige forfatterne har ingen interessekonflikter. Forfatter (P. Arnold) bevisninger med Savind Inc. og finansiell støtte fra Scivation, betyr Inc. ikke endre forfatternes tilslutning til PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Kreft oppviser en feilregulert metabolic fenotype, karakterisert ved laktat fermentering i nærvær av oksygen, et fenomen kjent som Warburg virkning [1]. Interessen for kreft metabolisme har økt det siste tiåret, med forskere som tyder på en rekke årsaker og konsekvenser av Warburg effekten, og undersøker nye terapeutiske strategier for å utnytte det [1-5]. Glukose avhengighet og laktat produksjon, to viktigste funksjonene i Warburg effekten korrelerer sterkt med aggressiv kapasitet og invasiv potensial [3, 4, 6, 7]. Metastase eller spredning av kreftceller fra en primær nettsted til distale vev, er ansvarlig for over 90 prosent av kreftrelaterte dødsfall. Det er ingen kreftbehandling tilgjengelige som effektivt kan håndtere systemisk metastasering. Siden Warburg effekten er en fremtredende fenotype i metastatiske celler, metabolske terapier som utnytter dette fenomenet kan tilby nye behandlingsalternativer for pasienter med aggressiv eller sent stadium kreft.
glycolytic-avhengighet knyttet til Warburg effekten har ført forskere å undersøke kosten behandlinger som reduserer glukosetilgjengelighet til svulsten. Ketogen diett (KD) er et høyt fett, tilstrekkelig protein, meget lav karbohydrat diett som har vært benyttet i prekliniske og kliniske studier for å forsinke progresjon av kreft [8-21]. KD tvinger en fysiologisk skifte til energiomsetningen, lowing blodsukker, undertrykke insulin, og heve blod ketonnivå ved å stimulere ketogenese fra kosten og lagret fett. Selv om anti-kreft effekt av KD er i stor grad tilskrives en reduksjon i den glykolytiske substrater og insulinsignaleringen som brensel kreft metabolisme, nye bevis antyder at ketoner ha et terapeutisk potensial av sine egne [17, 22, 23]. Mens friske celler lett tilpasse seg ketoner som en effektiv energi substrat, mange kreftformer er ikke i stand til å gjøre denne tilpasningen [24, 25].
uttrykk for ketone utnyttelsesgrad enzymer er ofte redusert i ondartet kreft i forhold til sin normale vev motstykker [26, 27]. Faktisk, i motsetning til hos friske nerveceller, ketoner mislykkes i å redde glioma celler fra glukose mangel-fremkalt død [28]. Vi har nylig beskrevet dette fenomenet og undersøkt den potensielle bruken av kosttilskudd keton kosttilskudd i en musemodell for metastatisk kreft [22]. Vår studie viste at eksogene keton kosttilskudd utøver potente anti-kreft effekt
in vivo
, selv når det gis med en høy karbohydrat diett, med tilsvarende effekt på kreftceller i nærvær av høye blodsukker media
in vitro
[22].
Cellular energiomsetningen er intrikat knyttet til oksygene status i vevet [29, 30]. Når oksygen er lett tilgjengelig, normale celler produsere opp til 90 prosent av sin ATP fra mitokondrisk åndedrett. Når oksygentilgangen blir begrenset, slik som i utøvelsen muskel, celler konvertere til ved hjelp av anaerob fermentering for å opprettholde ATP-produksjon. Denne metabolske bryteren opprett cellulær funksjon og fremmer overlevelse i møte med forbigående hypoksi, og dens mekanisme er i stor grad drevet av HIF-1 transkripsjonsfaktor [30, 31]. HIF-1 øker ekspresjon av mer enn 60 gener, hvorav mange er involvert i glykolysen og gjæring, angiogenese, vekst og overlevelse [30, 32]. Den avvikende signale som driver tumor angiogenese skaper umodne og lekk blodårene som er ute av stand til å tilstrekkelig perfuse hele svulsten [33]. Dette fører til dannelse av hypoksiske områder inne i svulsten som øker Warburg effekt og fremme progresjon av kreft, invasjon og metastase [33-35]. Tumor hypoksi og HIF-1 signale er begge sterkt korrelert med aggressiv kapasitet og dårlig prognose [36]. Tumor hypoksi er også kjent å formidle noen kjemo- og radio–motstand [37-40]. Fordi disse behandlinger fungerer i stor grad ved å stimulere overproduksjon av reaktive oksygenforbindelser (ROS) i svulsten, begrenset oksygen tilgjengelighet reduserer deres effekt [41, 42].
Hyperbar oksygenbehandling (HBOT) er administrasjonen av 100% oksygen ved forhøyet trykk.
In vivo
, metter HBOT blodplasma med oksygen, slik at det å spre videre inn i vev og oksygenat hypoksiske tumor regioner [43-45]. Tilsvarende øker HBOT oksygen diffusjon inn i celler i kultur og dermed dens virkninger kan lett evalueres i
in vitro
miljø. HBOT har vist seg å inhibere angiogenese og tumorvekst og øke overlevelsestiden som en frittstående eller adjuvant terapi for å standardbehandling i en rekke celle, dyr, og studier på mennesker [46-52]. Vi viste tidligere at ketogen diett med samtidig hyperbar oksygenbehandling var en effektiv kombinasjonsbehandling mot metastatisk kreft [9].
ketogen diett, keton kosttilskudd, og HBOT mål overlappende metabolske veier som er spesielt fremtredende i metastatiske celler . Vi antok at å kombinere disse tre metabolske terapi kan gi en sikker, kostnadseffektiv adjuvant behandling for metastatisk kreft. Vi testet denne hypotesen
in vivo Hotell og
in vitro
med VM-M3 musemodell for metastatisk kreft [9, 22, 53].
Materialer og metoder
Cell Kultur
VM-M3 /Fluc celler (VM-M3) ble kjøpt som en gave fra T. Seyfried av Boston College hvor de ble hentet fra en spontan hjernesvulst i et VM /Dk innavlet mus, innrettet til cellekultur, og transdusert med en vektor som inneholder lentivirus ildflue luciferase under kontroll av cytomegalovirus-promoteren, som tidligere beskrevet [53]. VM-M3-celler ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (Gibco, Life Technologies) med 5 mM L-glutamin (ATCC), 10% føtalt bovint serum (Invitrogen), 1% penicillin-streptomycin (Invitrogen), 10 mM HEPES-buffer (Gibco, life Technologies) og høy glukose (25 mm D-glukose, Fisher Scientific). Celler ble opprettholdt i en fuktet inkubator ved 37 ° C i 95% luft og 5% CO
2.
Mus
Breeding par av VM /Dk innavlet musestamme ble mottatt som en gave fra T. Seyfried fra Boston College, og ble brukt til å etablere og spre en mus koloni i University of South Florida Morsani College of Medicine Vivarium i henhold til standard drifta protokollen. Hann-mus (8-20 uker gamle) ble anvendt i den beskrevne studien. Alle prosedyrer ble godkjent av University of South Florida Institutional Animal Care og bruk Committee (USF IACUC; Protocol Antall R4137) og utført under streng overholdelse av Guide NIH for omsorg og bruk av forsøksdyr
er VM. M3 Cell Implantasjon
Om lag 1 million VM-M3 celler i 300 mL sterilt PBS ble implantert subkutant i den laterale mage flanken av VM /Dk mus bruker en 27g nål som tidligere beskrevet [9]. VM-M3 celle inokulasjon Fra dette nettstedet fører til hurtig og systemisk metastase [9].
Kost Administration
Dyr ble randomisert til en studie gruppe og begynte å motta sine respektive dietter på dagen svulst inokulering for å maksimalisere den terapeutiske vinduet i den svært aggressive VM-M3-modellen. Før den første dagen av studien ble alle musene fastet over natten for å oppmuntre hurtig samsvar med kosten protokollen. Kontrolldyrene fikk standard gnager chow (2018 Teklad Global 18% Protein Rodent Diet, Harlan)
ad libitum
for varigheten av studien. KD + HBOT mus fikk KD-USF, en tilpasset ketogen diett utviklet av forfatterne og produsert av Harlan Laboratories, matet
ad libitum
. KD + KE og KD + KE + HBOT mus mottok KD-USF blandet med KE ved 10 volum-% med 1% sakkarin for aksepterbarhet. KE ble syntetisert i samarbeid med Patrick Arnold (Savind Inc., Seymour, IL) som tidligere beskrevet [54]. Den makronæringsstoff profil og kaloritetthet av SD, KD-USF, og KE er vist i tabell 1. Alle dietter ble overvåket kontinuerlig og byttet ut to ganger i uken eller etter behov for å opprettholde friskheten i løpet av studien.
hyperbar oksygenbehandling
KD + KE + HBOT mus fikk 90 minutters hyperbar oksygen økter av 100% O
2 til 2,5 ATA (1,5 ATM gauge) tre ganger i uken (M, W, F) i en standard hyperbarisk kammer (modell 1300B, Sechrist Industries) for varigheten av undersøkelsen. KD + KE + HBOT fått sin første HBOT sesjon 24 timer etter tumorcelle vaksinasjonen.
blod og vektmålinger
Blood (ca. 10 mL) ble samlet en gang i uken fra halen ved hjelp IACUC-godkjent metoder. Blodsukker og β-hydroksybutyrat (βHB) ble målt ved hjelp av Precision Xtra blodsukker Ketone Monitoring System (Abbott Laboratories). Musene ble veid i midten av ettermiddagen, to ganger ukentlig for varigheten av studien ved hjelp av AWS-1KG Portable Digital Scale (AWS).
Bioluminescent Imaging og tumorvekst analyse
Bioluminesens av luciferase-merket VM-M3 celler
in vivo
ble kjøpt ved hjelp av IVIS Lumina avkjølt CCD kamerasystem og Living Bilde programvare (Sylinder LS). Femten minutter før bildebehandling, mus fikk en i.p. injeksjon av 50 mg /kg D-Luciferin (Sylinder LS). Antall dyr bioluminescent signal (fotoner /sekund) ble målt en gang i uken som en indikator på metastatisk tumorstørrelse og spredning. Tumor ta og metastatisk spredning ble bekreftet i alle dyr innen 14 dager etter VM-M3 celle inokulasjon av selvlysende avbildning.
In vivo
bioluminescent signal (fotoner /sek) av viktige metastatiske regioner (hjernen, lungene og leveren) ble målt som en indikator på metastatisk tumorbyrde og spredt på 21 dager etter inokulering i overlevelse studie dyr [43 , 55]. Omfanget av metastatisk spredning ble videre analysert i en egen gruppe av kontroll og kombinasjonsbehandling behandlet dyr med
ex vivo
organ bioluminescent bildebehandling. Dyrene ble inokulert med VM-M3-celler, behandlet i 21 dager, og humant avlivet. Vevene ble høstet og plassert i en petriskål inneholdende 300 ug /ml luciferin i steril PBS i 5 minutter før kjøp av selvlysende signal.
overlevelsesanalyse
Fysiske og atferdsmessige helse av musene var vurderes daglig gjennom hele studien. Mus ble humant avlivet av CO
2 kvelning etter godkjente IACUC retningslinjer ved presentasjon av definerte kriterier knyttet til sykdomsprogresjon (unormal fôring atferd, tumor-assosiert ascites, redusert respons på stimuli, mistrivsel).
Immunhistokjemisk analyse av Tumor vaskularisering
Etter 21 dagers behandling, dyr i den tidligere nevnte tre-ukers behandlingsstudie ble humant avlivet, og lever ble høstet og bevart i 10% nøytral, fosfatbufret formalin. Leveren vev ble parafin-embedded, skåret i 5 mikron seksjoner, og montert på objektglass på USF Morsani College of Medicine Histologi Core. Ett sett med lysbilder ble farget med hematoksylin og eosin og montert med dekkglass for morfologisk analyse. Et annet sett med slides ble probet for endotel-cellemarkør CD31 å visualisere blodkar. Objektglassene ble rehydrert gjennom en serie av xylen og etanolvaskinger og antigen ble hentet av en standard varme-mediert sitratbuffer metode. Lysbilder ble inkubert i 0,3% H
2o
2 i dH
2o å hemme endogen peroxide aktivitet. Immunhistokjemisk analyse av objektglassene ble utført ved å bruke Vectastain Elite ABC kit. Platene ble blokkert i 30 minutter i normal blokkeringsserum, og deretter inkubert i anti-CD31-antistoff (1:25; ab28364, Abcam) i en time ved romtemperatur. Objektglass ble deretter inkubert i biotinylert anti-kanin-sekundært antistoff i normal blokkeringsserum i 30 minutter ved romtemperatur, etterfulgt av Vectastain ABC-reagens inneholdende avidin og biotinylert pepperrot peroksydase-løsning i 30 minutter ved romtemperatur. Lysbilder ble utviklet ved hjelp av vektor NovaRED (HRP) Substrat Kit. Lysbilder ble kontra med hematoksylin, vasket, montert med Dekk, og visualisert med lysmikroskopi. Minst 3 rammer inneholdende tumorvev per prøve ble analysert. Antallet CD31
+ blodkar forbundet med svulster i hver ramme ble tellet og sammenlignet mellom kontroll og behandlede grupper som et mål på tumor vaskularisering.
VM-M3 Cell Proliferation
50000 VM-M3-celler ble sådd ut i 35 mm 6 brønners plater i 1 ml av høy glukosemedium (kontroll; 25 mM) eller lav glukose medium (LG, 3 mM) med eller uten daglig HBO behandlinger (HBOT; 100% O
2 , 90 min, 2,5 ATA). En kombinasjon av behandlingsgruppene fikk lav glukose, ketoner tilskudd (5mM βHB), og daglig HBO behandlinger (LG + βHB + HBOT). Disse studiene ble utført i tandem med arbeid undersøker effekten av keton tilskudd på VM-M3 celleproliferasjon; derfor, 25mm og 3mm glukose spredning kurver som presenteres er de samme som tidligere rapportert [22]. Celler ble dyrket i 24, 48, 72 og 96 timer for å bestemme en vekstkurve. Media ble erstattet i alle behandlinger ved 48 timer, og hvert tidspunkt og behandlingsgruppe ble kjørt i triplikat. Celler ble skrapt og telles ved hjelp av standard trypanblått hemocytometry. Platene ble visuelt inspisert for å sikre at alle cellene ble høstet før telling.
VM-M3 celleviabilitet
Livskraftig ble vurdert med LIVE /DEAD Livskraftig /Cytotoksisitet Kit (Invitrogen). 50000 VM-M3-celler ble sådd ut i 22 mm 12 brønners plater inneholdende poly-D-lysinbelagte dekkglass (BrainBits) i 1 ml kontrollmedia og tillatt å vokse i 24 timer. På 24 timer ble cellene administrert behandling: høy glukose media (kontroll, 25 mm), lav glukose media (LG, 3 mm), kontroll media (25 mM glukose) med en enkelt sesjon av hyperbar oksygen (HBOT; 100% O
2 , 90 min, 2,5 ATA) eller kombinasjonsbehandling med lav glukose, ketoner tilskudd (5mM βHB), og en enkelt sesjon av hyperbar oksygen (LG + βHB + HBOT). Disse studiene ble utført i tandem med arbeid undersøker effekten av keton tilskudd på VM-M3 celle levedyktighet; Derfor, 25mm og βHB levedyktighet data er de samme som tidligere rapportert, og er vist her for referanse [22]. Etter 48 timer ble cellene renset med D-PBS, og inkubert i 2 um calcein AM (Ex /Em: 495/515) og 4 um EthD-1 (Ex /Em: 525/590) i D-PBS i 30 minutter ved 37 ° C. Dekk ble snudd, montert og forseglet på et objektglass, og cellene ble visualisert med et Nikon TE200E med fluorescens konfokalmikroskopi med FIT-C og Trit-C filtrene til å identifisere levende og døde celler, henholdsvis. Behandlinger ble kjørt i triplikat. Antallet levende og døde celler ble talt opp i 10 bilder per dekkglass ved hjelp av et 10x objektiv for å bestemme prosent levedyktighet.
VM-M3 Cell ROS Detection
50000 VM-M3 celler ble sådd ut i 35 mm Poly-D-lysin belagt glass FluoroDish vev kultur retter (Verdenspresisjonsinstrumenter) i 1 ml kontroll media og lov til å vokse i 24 timer. Ved 24 timer, ble celle administrert behandling: media ble erstattet med høy glukose media (kontroll, 25 mm), lav glukose media (LG, 3 mm), kontroll media med keton tilskudd (βHB; 5mM βHB), kontroll media med en enkelt sesjon hyperbar oksygen (HBOT; 100% O2, 90 min, 2,5 ATA) eller kombinasjonsbehandling (LG + βHB + HBOT). Etter 48 timer ble cellene inkubert i 10 uM DHE (Ex /Em:. I CSF i 30 minutter ved 37 ° C, og superoksyd-produksjon ble målt ved anvendelse av fluorescens konfokal mikroskopi med en Trit-C filter slik som tidligere beskrevet [56] Behandlinger ble utført i replikere. Superoxide produksjon ble målt ved å beregne gjennomsnittet av fluorescens intensitet enheter (EFE) per celle i 10 bilder per prøve å bruke en 10x objektiv.
statistikker
overlevelse ble analysert med Kaplan -Meier og log-rank Mantel-Cox tester for overlevelse fordeling. Cellenes levedyktighet og tumor vaskularisering ble analysert ved uparet t-test. Bioluminescent signal ble analysert ved Mann-Whitney U-test. Cellenes levedyktighet, celleproliferasjon, betyr overlevelse, blodglukose og βHB og prosentvis kroppsvektendring ble analysert ved enveis ANOVA med Tukey multippel sammenligningstest post hoc All statistisk analyse ble utført med GraphPad Prism 6 programvare Resultatene ble betraktet som signifikant når p … .05 dataene for denne studien er tilgjengelig som tilleggsinformasjon (S3 File).
Resultater
Metabolsk terapi bremser tumorvekst, hemmer metastatisk spredning og svulst vascularization, og strekker seg overlevelsestiden hos mus med metastatisk kreft
Bioluminescent avbildning viste en trend med redusert tumorvekst og metastatisk spredning i behandlede dyr sammenlignet med kontroller i løpet av undersøkelsen (figurene 1 og 2). Tumor bioluminesens var under påviselig terskel i flere KD + KE + HBOT mus på 3 uker (fig 1). Tumor ta og spredning fra stedet til inokulering ble observert med selvlysende avbildning i alle mus ved dag 14, noe som indikerer at disse metabolske terapi ikke forlenge overlevelsen simpelthen ved å forebygge tumordannelse. Imidlertid tumor bioluminescens ble redusert i de tre behandlings mus sammenlignet med kontroll ved uke 1 og 2, noe som tyder på at det fysiologiske miljø som induseres av vår metabolsk terapi var mindre fremmer tumorvekst, og kan ha redusert vekst av primærtumor, så vel som metastatisk spredt. KD + KE + HBOT behandlet mus viste mindre samlet tumorbyrde målt med total bioluminescent signal enn kontroller i det hele tatt gjeldende tidspunkt (uker 1, 2 og 3, fig 1). KD + KE + HBOT behandlet mus også utstilt mindre samlet tumorbelastning enn KD mus på uker 3 og 5 og KD + KE mus på uker 1, 2, 3 og 5 (fig 1). På 3 uker etter VM-M3 celle inokulasjon, KD + KE + HBOT behandlet mus hadde en betydelig mindre samlet tumorbelastning og mindre metastatisk spredning til hjernen, lunger, lever, nyrer, milt og fettvev i forhold til å styre mus (** * p 0,001, enveis ANOVA, fig 1). KD, KD + KE, og KD + KE + HBOT mus viste signifikant lengre overlevelseskurver i forhold til å kontrollere dyr (p = 0,03, p = 0,009 og p 0,0001, log-rank Mantel-Cox test for å overleve distribusjon, fig 3A) . KD behandling økt bety overlevelse etter ca 14 dager (44,6%), KD + KE behandling av ca 20 dager (65,4%), og KD + KE + HBOT behandling av ca 32 dager (103,2%) sammenlignet med kontroller (* p 0,05; enveis ANOVA; fig 3B). Det var ingen signifikante forskjeller i overlevelse mellom de tre behandlingsgruppene. Morfologisk og immunhistokjemisk analyse av lever fra KD + KE + HBOT behandlede mus viste kun mikrometa lesjoner med liten merkbar vaskularisering sammenlignet med kontroller (fig 4). Blodsukker og kroppsvekt redusert og blod βHB økt hos mus som fikk KD + KE terapi etter dag 7, før utbruddet av betydelige sykdomsutvikling (figur 5).
(A)
In vivo
bioluminesens avbildning av representative dyr fra hver behandlingsgruppe 3 uker etter tumorcelle vaksinasjon. Behandlet mus viste redusert tumorbelastning og metastatisk spredning. (B) Antall dyr bioluminescens (fotoner /sekund) ble sporet over tid som et mål på tumorvekstraten. For å unngå villedende framstilling av tumorbyrden, data for behandlingsgruppene der ≥50% av dyrene hadde bukket under for sykdomsprogresjon er ikke lenger vist. Tumor Bioluminescens var meget varierende, men behandlede dyr viste en merkbar utvikling av lavere tumorveksten sammenlignet med kontroller gjennom hele studien. KD-behandlede mus hadde mindre bioluminesens enn kontroller i uke 2, mens KD + KE + HBOT mus hadde mindre bioluminesens enn kontrolldyrene i uke 1, 2, og 3. KD + KE + HBOT mus hadde også mindre bioluminesens enn KD + KE mus ved uker 1, 2, 3 og 5, og hadde mindre tumor bioluminescens enn KD mus ved uke 3 og 5. Feilstolper representerer ± SEM. Resultatene ble betraktet som signifikant når p. 0,05
(A)
In vivo
bioluminescence sentrale metastatiske regioner 21 dager etter tumorcelle vaksinasjon viste en markert reduksjon i metastatisk tumorbelastning og spredning for behandlede dyr. KD + KE + HBOT mus hadde betydelig mindre metastatisk spredning til hjernen, lungene og leveren sammenlignet med kontroller ved 3 uker. Det var ingen signifikante forskjeller i metastatisk spredning mellom de tre behandlingsgruppene. (B-C) For å gi en mer følsom måling av metastatisk spredning i vår multi-kombinasjonsterapi, ble en separat gruppe av kontroll og KD + KE + HBOT behandlede dyr behandlet i 21 dager etter tumorcelle-inokulering og avlives.
Ex vivo
bioluminescent avbildning av høstet organer bekreftet en betydelig reduksjon i metastatisk tumorbelastning og spres i kombinasjon behandlede dyr sammenlignet med kontroller. Alle organer testet-hjerne, nyrer, milt, lunger, adipose, og lever-viste signifikant redusert bioluminescent signal sammenlignet med kontroller. Feilfelt representerer ± SEM. Resultatene ble betraktet som signifikant når p. 0,05
(A) Kaplan-Meier overlevelseskurven for studiegrupper. KD, KD + KE, og KD + KE + HBOT behandlet mus viste en lengre overlevelse sammenlignet med kontroller (p = 0,03, p = 0,009 og p 0,0001, henholdsvis log-rank Mantel-Cox test for å overleve distribusjon). Det var en sterk trend med lengre levetid i kombinasjon behandlings mus sammenlignet med KD eller KD + KE, men disse kurvene var ikke signifikant forskjellig fra hverandre (KD vs. KD + KE + HBOT p = 0,0622; KD + KE vs. KD + KE + HBOT p = 0,1924; log-rank Mantel-Cox test). (B) kohort størrelse (N), var gjennomsnittlig overlevelse (dager), og prosent økning i midlere overlevelsestid fra kontroll. KD KD + KE, og KD + KE + HBOT behandlede mus viste en 44,6%, 65,4% og 103,2% økning i midlere overlevelsestid sammenlignet med henholdsvis kontroller, (* p 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001; One-Way ANOVA). I likhet med overlevelseskurven analyse, var det en trend med øket midlere overlevelsestid i kombinasjon behandlede mus sammenlignet med KD KD og KE +, men disse forskjellene var ikke signifikante (KD KD vs + KE + HBOT p = 0,1062; KD + KE vs. KD + KE + HBOT p = 0,2763). Resultatene ble betraktet som signifikant når p. 0,05
Morfologi og vaskularisering av KD + KE + HBOT behandlet leversvulster mus ble analysert ved H E farging og CD31 immunhistokjemi. Svulster fra KD + KE + HBOT-behandlede mus var mindre med mer veldefinerte grenser (A, C) og oppviste en signifikant reduksjon i vaskularisering (B, D, E) fra kontroller (* p 0,05, uparet t-test) . Feilfelt representerer ± SEM.
(AC) KD + KE behandlet mus hadde betydelig redusert blodsukker og kroppsvekt og økt blod βHB i forhold til å styre mus ved dag 7. Blodsukker ble betydelig redusert bare i KD + KE-behandlede mus ved dag 7. Begge KD + KE og KD + KE + HBOT behandlede mus oppviste økt blod βHB sammenlignet med kontroll og KD behandlede mus ved dag 7. Bare KD + KE mus hadde en signifikant reduksjon i kroppsvekten ved dag 7. (D) kun KD + KE mus viste en signifikant og konsekvent reduksjon i kroppsvekt i løpet av studien. Resultatene ble betraktet som signifikant når p 0,05. Feilfelt representerer ± SEM.
Metabolsk terapi reduserer spredning og levedyktighet og øke ROS produksjon i VM-M3 celler
Spredning av VM-M3 celler ble betydelig hemmet ved å redusere glukosekonsentrasjonen av kulturmediet, og ved å administrere HBOT (figur 6A). Vi har tidligere rapportert en lignende respons i VM-M3 celler med βHB tilskudd til variert glukosekonsentrasjon [22]. Kombinere LG, βHB, og HBOT fremkalte potente anti-proliferative effekter
in vitro plakater (figur 6B). Celler mottar denne kombinasjonsbehandlingen deles meget langsomt, med en markert signifikant reduksjon i celletetthet sammenlignet med kontroller ved alle tidspunkter som ble testet (* p 0,05, en-veis ANOVA; Fig 6B). Ved 24 og 48 timer, veksten var betydelig lavere i LG + HBOT celler enn i kontrollcellene. Vekstraten var også betydelig tregere i LG + βHB + HBOT celler enn i LG-celler. Forskjellene i formeringshastigheten mellom gruppene ble mer tydelig med tiden, slik at etter 72 timer, den formeringshastigheten av alle behandlingsgruppene var signifikant forskjellig fra hverandre med unntak av LG versus LG + HBOT, og ved 96 timer, alle grupper forskjellig med unntak av LG versus LG + HBOT. Det var en lignende effekt av metabolsk terapi på VM-M3 cellenes levedyktighet. Levedyktighet var 19% mindre i LG gruppe enn i kontrollgruppen ved 24 timers behandling (* p 0,05, en-veis ANOVA, fig 7). Vi har tidligere rapportert om en lignende effekt i VM-M3 celler behandlet med βHB tilskudd [22]. Selv om HBOT ikke redusere levedyktighet av seg selv, når de administreres sammen med LG og βHB, denne kombinasjonsbehandlingen betydelig redusert levedyktighet med ca 38%. (*** P 0,001, enveis ANOVA, fig 7). VM-M3 celle superoksid produksjonen ble betydelig økt med HBOT, både alene og i kombinasjon med LG + βHB (*** p 0,001, enveis ANOVA, fig 8).
VM-M3 celler ble dyrket i forhold mimicking metabolsk terapi, inkludert kombinasjoner av variert glukosekonsentrasjon (25 mm, 15 mm eller 3 mm) media, keton tilskudd (5mM βHB), og daglig HBOT økter (100% O
2, 2,5 ATA, 90 min). Celletettheten ble målt ved trypan blå hemocytometry for å fremstille en vekstkurve i løpet av 96 timer. (A) spredning av VM-M3-celler ble inhibert med avtagende glukosekonsentrasjon og tilsetning av HBOT. Etter 24 timer, celletetthet på 3mM Glu og 3mM Glu + HBOT cellene var betydelig mindre enn kontroll (25 mM) glukose behandlede celler. Ved 48, 72 og 96 timer ble celletetthet på alle behandlingsgrupper betydelig redusert sammenlignet med kontrollen (* p 0,05, To-veis ANOVA). (B) kombinerer lav glukose, keton kosttilskudd, og HBOT resulterte i en markant nedgang i celleproliferasjon som var betydelig fra kontroll ved alle tidspunkter testet. (P 0,05; enveis ANOVA). Cellene fikk kombinasjonsterapi hadde en signifikant reduksjon i proliferasjon sammenlignet med celler behandlet med LG bare ved 24, 48 og 72 timer, og sammenlignet med βHB bare ved 48, 72 og 96 timer, og oppviste en ikke-signifikant utviklingen av redusert proliferasjon sammenlignet med LG + HBOT behandlede celler for varigheten av vekstkurven. Resultatene ble betraktet som signifikant når p 0,05. Feilfelt representerer ± SEM
VM-M3-celler ble behandlet med høy (kontroll, 25 mm). Eller lav (LG, 3 mm) glukose i 24 timer, med eller uten 5mM βHB eller en sesjon HBOT . Levedyktighet ble målt med calcein AM og Ethd-en fluorescens mikroskopi. (A-B) βHB, redusert LG, LG og + βHB + HBOT behandling levedyktighet sammenlignet med kontroll og HBOT behandlede celler. LG + βHB + HBOT celleviabiliteten ble betydelig redusert i forhold til βHB men ikke LG behandlede celler. Resultatene ble betraktet som signifikant når p 0,05. Feilfelt representerer ± SEM
(A-B) VM-M3 celler ble behandlet i 24 timer med individuelle eller kombinerte metabolske terapier:. LG, βHB, HBOT eller LG + βHB + HBOT. Superoksydproduksjon ble målt med DHE fluorescens mikroskopi og ble betydelig øket med HBOT alene eller i kombinasjon med LG + βHB. Resultatene ble betraktet som signifikant når p 0,05. Feilfelt representerer ± SEM.
Diskusjoner
metastaser er fortsatt den største hindringen i å identifisere effektive behandlinger for den langsiktige forvaltningen av kreft. Mangel på dyremodeller som reflekterer metastatisk fenotype hindrer store forbedringer i pasientbehandlingen.
