Abstract
Mål
Utvikling av behandlingsresistens og ugunstig toksisitet forbundet med klassiske kjemoterapeutika streker behovet for sikrere og effektive terapeutiske tilnærminger. Heri, undersøkte vi effekten av en kombinasjonsbehandling regime på 5-fluorouracil (5-FU) og curcumin i tykk- og endetarmskreft (CRC) celler.
Metoder
Ville typen HCT116-celler og HCT116 + CH3-celler (supplert med kromosom 3) ble behandlet med curcumin og 5-FU i en tids- og doseavhengig måte og evaluert ved hjelp av celle proliferasjonsanalyser, DAPI farging, transmisjonselektronmikroskopi, cellesyklusanalyse og immunblotting for nøkkelsignaleringsproteiner.
Resultater
Den enkelte IC
50 av curcumin og 5-FU var omtrent 20 mikrometer og fem mikrometer i HCT116 cellene og 5 mikrometer og en mikrometer i HCT116 + CH3 celler, henholdsvis (
p 0,05
). Forbehandling med curcumin betydelig redusert overlevelse i begge celler; HCT116 + CH3-celler var betydelig mer følsomme for behandling med curcumin og /eller 5-FU enn villtype HCT116-celler. IC
50 verdier for kombinasjonsbehandling var omtrent 5 mikrometer og en mikrometer i HCT116 og 5 mikrometer og 0,1 mikrometer i henholdsvis HCT116 + CH3, (
p 0,05
). Curcumin indusert apoptose i begge celler ved å fremkalle mitokondrie degenerasjon og cytokrom c utgivelse. Cellesyklusanalyse viste at den anti-proliferative effekt av curcumin og /eller 5-FU ble innledet ved akkumulering av CRC-celler i S-fase cellesyklus og induksjon av apoptose. Curcumin forsterkes 5-FU-indusert uttrykk eller spalting av pro-apoptotiske proteiner (caspase-8, -9, -3, PARP og Bax), og nedregulert anti-apoptotiske (BCL-XL) og proliferativ (cyclin D1) proteiner . Selv om 5-FU aktivert NF-kB /PI-3K /Src sti i CRC celler, dette ble nedregulert av curcumin behandling gjennom hemming av IκBα kinase aktivering og IκBα fosforylering.
Konklusjoner
Ved å kombinere curcumin med konvensjonelle kjemoterapeutiske midler slik som 5-FU kan gi mer effektive behandlingsstrategier mot kjemoresistent tykktarmskreftceller. De involverte mekanismer kan være formidlet via NF-kB /PI-3K /src stier og NF-kB regulert genprodukter
Citation. Shakibaei M, Mobasheri A, Lueders C, Busch F, Shayan P, Goel A (2013) Curcumin forsterker effekten av kjemoterapi mot tykktarmskreftceller ved hemming av NF-kB og Src proteinkinase signalveier. PLoS ONE 8 (2): e57218. doi: 10,1371 /journal.pone.0057218
Redaktør: Bharat B. Aggarwal, The University of Texas M. D. Anderson Cancer Center, USA
mottatt: 9 juli 2012; Godkjent: 22 januar 2013; Publisert: 22 februar 2013
Copyright: © 2013 Shakibaei et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP (CRC) er en av de ledende. dødsårsaker hos menn og kvinner, og rangerer blant de tredje mest vanlige kreftformer globalt [1]. Forekomsten av CRC øker fremdeles til tross for vår forbedret forståelse av patogenesen av denne sykdommen, så vel som etablering av forbedrede screening strategier for dette malignitet. Det har blitt rapportert at nesten 50% av pasientene med CRC, vil utvikle tilbakevendende sykdom, noe som indikerer at tiden tilgjengelige behandlingsregimer er ikke i stand til å styre denne dødelige sykdommen, og det er et viktig behov for forbedrede terapier [2]. 5-fluorouracil (5-FU) er en av de klassiske medikamenter som brukes som kjemoterapeutiske middel mot CRC. 5-FU behandling hemmer tumorcellevekst og induserer apoptose ved inkorporering av dens metabolitter i DNA og RNA gjennom tymidylatsyntase. Imidlertid er gevinster gjort av kjemoterapeutiske effekt av 5-FU noe begrenset hos pasienter med kolorektal kreft, primært som følge av ervervet progressiv motstand fra CRC celler til 5-FU og toksisitet til omkringliggende friske celler [3], [4].
de fleste svulster aktivere transkripsjonsfaktor nukleær faktor-kB (NF-kB), mens naturlige chemopreventive agenter undertrykke det, noe som indikerer en sterk sammenheng mellom tumorbiologi og anti-kreft effekter av ulike naturlige forbindelser [5]. I motsetning til friske celler, i de fleste solide og hematopoetiske tumorcellelinjer NF-kB er konstitutivt aktiv [6]. Videre, pro-inflammatoriske cytokiner, kjemoterapeutiske midler og strålebehandling, som induserer apoptose også aktivere NF-kB [7] og kan således formidle chemoresistance og radioresistance av tumorceller [8]. Interessant, inhibering av NF-kB i tumorceller blokker proliferasjon, forårsaker cellesyklus-stans, og fører til apoptose, noe som tyder på en sentral rolle for denne transkripsjonsfaktor i cellevekst og overlevelse [9]. NF-kB spiller en viktig rolle i celleproliferasjon og ondartet transformasjon i forskjellige celler, bindes til DNA-målområder som homo- eller heterodimer å påvirke nedstrøms genekspresjon [10], [11].
CRC antas å forekomme som en konsekvens av trinnvis oppbygging av genetiske endringer i ulike gener som fører til forbedret genomiske ustabilitet. Slike endringer ha direkte innflytelse på metastase-assosierte gener, onkogener og tumorsuppressorgener [12], [13]. Videre er det økt erkjennelse at foruten genetiske hendelser i CRC, kan endringer i genekspresjon være mediert av epigenetiske endringer slik som avvikende metylering av DNA, histonmodifikasjonene og kromatin remodellering [14], [15]. I tillegg er mismatch reparasjon (MMR) system spiller en viktig rolle i korrekturlesing DNA syntese feil under cellereplikasjon. Skader på MMR systemet bevirker genetisk ustabilitet, noe som fører til endringer i celle-fenotype, det gjør cellene mer følsomme for neoplastisk transformasjon og lette utviklingen av kjemoterapeutisk resistens. DNA MMR proteiner, slik som hMSH2, hMSH3, hMSH6, hMLH1, hPMS2 og hMLH3 spiller en viktig rolle i både sporadiske og familiære varianter av human CRC [16], [17], [18], [19]. Faktisk, overfører restaurering av MMR feilen ved å re-uttrykk for hMLH1or hMSH2 av kromosom overføring økt følsomhet for agentene [20], [21].
CRC er en forebygges sykdom, og er sterkt påvirket av miljø , livsstil og kostholdsfaktorer. I denne sammenheng er det en økende mengde litteratur tyder på at flere naturlige forekommende stoffer som kosttilskudd kan redusere risikoen for kreft og har blitt rapportert å ha en sentral rolle i utviklingen av anti-tumor medikamenter [22], [23]. Naturlige produkter med evnen til å inhibere aktivering av den nukleære transkripsjonsfaktor NF-kB kan ha terapeutisk potensial mot tumorutvikling som CRC. Curcumin (diferuloylmethane) er den biologisk aktive phytochemical komponent til stede i krydder gurkemeie (
Curcuma longa
), og er blitt vist å være en potent inhibitor av NF-kB-aktivering i flere celletyper ved ikke-toksiske konsentrasjoner hos mennesker [ ,,,0],24]. Den anti-tumor eiendom curcumin, er delvis på grunn av arrestasjonen av kreftceller i S, G2 /M cellesyklus fase og induksjon av apoptose. Videre hemmer curcumin veksten av DNA MMR-manglende tykktarmskreftceller [25], [26]. Det har også blitt rapportert at curcumin nedregulerer konstitutivt aktivert kinase PI-3K /AKT veier i T-celle leukemiceller, som hemmer proliferasjonen og induserer caspase-avhengig apoptose [27].
Gitt at pasienter med kolorektal kreft med DNA mismatch reparasjon mangel ikke dra nytte av 5-FU basert kjemoterapi, brukte vi et par av isogene cellelinjer, HCT116 (MMR-mangelfull, skyldes hypermethylation av MLH1 genet) og HCT116 + CH3 (MMR-dyktig, på grunn av stabil overføring av kromosom 3 bærende villtype kopi av MLH1 genet). Hensikten med denne studien var å undersøke chemosensitization potensialet av curcumin i 5-FU-basert kjemoterapi i MMR-mangelfulle og -proficient CRC celler.
Materialer og metoder
Antistoffer
Antistoffer mot MMP-9 (MAB 911) og aktiv caspase-3 (AF835) ble oppnådd fra R . 1C ). Den enkelte IC
50 av curcumin og 5-FU var omtrent 20 mikrometer og fem mikrometer i HCT116 cellene og 5 mikrometer og en mikrometer i HCT116 + CH3 celler, henholdsvis (
p
0,05). Disse resultatene tyder på at curcumin og 5-FU har potent anti-proliferative effekter i CRC-celler, og at disse effekter er mer uttalt i HCT116 + CH3 enn i HCT116-celler
A.: HCT116-celler behandlet med forskjellige konsentrasjoner av curcumin eller 5-FU (0, 1, 5, 10, 20, 40 og 80 uM) i 24 timer og cellenes levedyktighet ble målt ved anvendelse av MTT-metoden. Konsentrasjoner av curcumin og 5-FU som resulterer i 50% veksthemming ble angitt som enkelte IC
50 verdier. B: HCT116-celler ble forbehandlet med curcumin (5 uM i 4 timer) og deretter eksponert for 5-FU i forskjellige konsentrasjoner (0, 0,1, 1, 2, 3, 4 og 5 um) i 24 timer og bedømt ved MTT-assay. IC
50 for 5-FU i kombinasjonsbehandling ble bestemt ved 50% vekstinhibering av HCT116-celler. De samme forsøk som er vist i (A) og (B) ble utført på HCT116 + CH3-celler. IC
50 Verdiene for enkelt (C) og kombinasjonsbehandling (D) ble beregnet på basis av MTT målinger. Resultatene er gitt som middelverdier med standardavvik fra minst tre uavhengige eksperimenter. Verdier ble sammenlignet med kontrollgruppen og statistisk signifikante verdier med p. 0,05
For å undersøke effekten av en kombinert behandling av curcumin og 5-FU, HCT116 eller HCT116 + CH3 celler ble forbehandlet med 5 mikrometer curcumin i 4 timer og deretter co-behandlet med forskjellige konsentrasjoner av 5-FU (0, 0,1, 1, 2, 3, 4 og 5 uM) i 24 timer (figur 1B . 1 D). MTT-analyse ble utført og IC
50-verdier ble bestemt. Interessant, forbehandling med fem mikrometer curcumin redusert IC
50-verdier for 5-FU til en mikrometer i HCT116 og 0,1 mikrometer i HCT116 + CH3 (
p
0,05) celler. Disse resultatene indikerer at cellene forbehandlet med curcumin var mer følsomme for 5-FU enn celler behandlet med 5-FU alene og innføring av kromosom 3 i HCT116-celler viste en økt sensitivitet av cellene til behandling med 5-FU og /eller curcumin sammenlignet med HCT116 villtype.
kombinasjonen effekten av curcumin og 5-FU på apoptose i HCT116 og HCT116 + CH3 cellene
for å finne ut om den hemmende effekten av curcumin og 5-FU på celleviabilitet og cellevekst er relatert til induksjon av apoptose, HCT116 og HCT116 + CH3-celler ble farget med Hoechst 33258 (DAPI). Dette fluorescens-basert fargemetode avslører apoptotiske legemer som inneholder atom fragmentering og kromatin kondens i apoptotiske celler. HCT116 og HCT116 + CH3-celler ble eksponert for forskjellige konsentrasjoner av curcumin eller 5-FU (0, 1, 5, 10 og 20 uM), eller til en kombinasjon av curcumin (5 uM) og 5-FU (0,1, 1, 2 og 3 mm). Anvendt konsentrasjonene ble beregnet fra IC
50-verdier av curcumin og 5-FU bestemt ved MTT-analyser. Som vist på fig. 2, antallet av apoptotiske kjerner ble markert øket i celler av kombinasjonsbehandlingsgruppen. Dette bekreftet resultatene i fig. 1B 1D og avslørte at curcumin sensitizes HCT116 kolon kreftceller til 5-FU-indusert apoptose. Videre er gjenopprettelsen av hMLH1 aktivitet i HCT116-celler, ved innføring av kromosom 3, ble forbundet med en økt sensitivitet for 5-FU og 5-FU-indusert apoptose.
HCT116 og HCT116 + CH3-celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av curcumin eller 5-FU (0, 1, 5, 10 og 20 uM) eller en kombinasjon av curcumin (5 uM) og 5-FU (0,1, 1, 2 og 3 uM) i 24 timer. Monolagskulturer ble farget med Hoechst 33258 (DAPI) for å avsløre apoptotiske endringer i cellekjerner.
Curcumin forbedrer 5-FU-indusert mitokondrie endringer og apoptose i HCT116 og HCT116 + CH3 celler
Som vist i fig. 3, HCT116 tykktarmskreftceller ble behandlet med curcumin (20 uM), 5-FU (5 uM) eller en kombinasjon av begge (curcumin 5 uM og 5-FU 1 uM) for 12, 24, 36, 48, 60 og 72 h, respektivt. Levedyktighet og morfologiske forandringer av cellene ble bestemt ved ultra undersøkelse med transmisjonselektronmikroskopi. HCT116 tykktarm kreft celler i kontrollkulturer viste en avrundet /sfærisk morfologi med små cytoplasmatiske prosesser, store kjerner (for det meste euchromatic) med tydelig nucleoli og et velorganisert cytoplasma under hele behandlingsvarighet (figur 3, Control:. A-F). Behandling av HCT116 kulturer med curcumin eller 5-FU alene opp til 36 timer resulterte i degenerative forandringer, som for eksempel utseendet på flere vakuoler, hevelse i mitokondrier og grov ER og degenerasjon av andre cellulære organeller (Fig. 3, 5-FU, Cur : A-C). Lengre inkubasjonsperioder med curcumin eller 5-FU (60 og 72 timer) resulterte i mer cellulær degenerasjon. Dette inkluderte områder av kondensert heterochromatin i cellekjerner og flere, autophagic cytoplasmatiske vakuoler; cellene ble apoptotiske (figur 3, 5-FU.: F, Cur: E-F). Forbehandling av HCT116 kulturer med curcumin (5 uM) i 4 timer, etterfulgt av samtidig behandling med 5-FU (1 uM) over den samme tidsperioden viste en sterk virkning. Omfattende morfologiske degenerative funksjoner, mitokondrie hevelse og apoptose ble funnet så tidlig som 36 timer i HCT116 cellene og fortsatte å samle inntil 72 timer (figur 3, Cur + 5-FU HCT116. C). I forhold til HCT116-celler, ble også undersøkelser utført på HCT116 + CH3-celler behandlet med en kombinasjon av 5 uM curcumin og 0,1 uM 5-FU. Her er disse effektene var enda mer fremtredende og apoptotiske celler ble allerede detektert etter 12 timers behandling (figur 3, Cur + 5-FU HCT116 + CH3:. A). Disse resultatene bekreftet at følsomheten til 5-FU ble forbedret ved forbehandling med curcumin og at dette ble forverret i HCT116 + CH3-celler.
HCT116-celler behandlet med curcumin (20 uM), 5-FU (5 pM) eller en kombinasjon av begge deler (5 uM curcumin og 1 pM 5-FU) for 12, 24, 36, 48, 60 og 72 timer. Ved hjelp av en annen metode HCT116 + CH3-celler ble behandlet med en kombinasjon av 5 uM curcumin og 0,1 uM 5-FU for 12, 24, 36, 48, 60 og 72 timer. Ultratynne snitt ble fremstilt og undersøkt ved transmisjonselektronmikroskopi. Mikrografer som vises er representative for alle kulturer evaluert. Tidligst tidspunkt da apoptose ble først oppdaget bildene er markerte piler. Mitokondrie endringer (pilspisser) er vist. Forstørrelse: x5000, bar = 1 mikrometer
Kvantifisering og statistisk evaluering av de ultra data klart fremhevet den tidsavhengige effekter av curcumin og /eller 5-FU behandling på mitokondrie forandringer (MC) og apoptose. i HCT116 og HCT116 + CH3 celler. Som vist på fig. 4A B, mer enn 50% av cellene viste MC eller apoptotiske egenskaper ved 24 timers inkubasjonstid i kombinasjons eksperimenter med HCT116-celler, og etter 12 timer i kombinasjon forsøkene med HCT116 + CH3-celler (
p
0.05) . Igjen dette tyder på at curcumin sensitizes HCT116 og HCT116 + CH3 celler til 5-FU-indusert apoptose. Resultatene indikerer at en meget lav mengde av 5-FU (0,1 pM) er nødvendig for å undertrykke cellelevedyktighet når de kombineres til en moderat dose av curcumin (5 uM). Videre har disse funnene bekrefter at innføringen av kromosom 3 i HCT116-celler signifikant øker sensitiviteten av cellene til behandling med 5-FU og /eller curcumin i forhold til de HCT116-celler.
For å kvantifisere de ultra funnene, HCT116 (A) og HCT116 + CH3 (B) kulturer behandlet som beskrevet i fig. 3 ble undersøkt for apoptotiske og mitokondrielle endringer (MC) ved å telle 100 celler fra 20 mikroskopiske felt. Undersøkelsen ble utført i tre eksemplarer, og resultatene er gitt som middelverdier med standardavvik SD (
p
0,05). Fra tre uavhengige eksperimenter
Effekter av curcumin og /eller 5-FU på cellesyklus og apoptose i HCT116 og HCT116 + CH3 cellene
for å undersøke mekanismer som curcumin og /eller 5-FU hemmer spredning av HCT116 og HCT116 + CH3 celler, vi undersøkt og sammenlignet deres effekt på graden av veksthemming og nivåene av apoptose. Derfor bestemmes vi oppførselen til disse to CRC-celler i de ulike faser av cellesyklusen ved flowcytometrisk analyse (Fig. 5A /B). HCT116-celler behandlet med 20 uM curcumin eller 5 uM 5-FU eller deres kombinasjon (5 uM curcumin og 1 pM 5-FU) for 12 og 24 timer. I et uavhengig forsøk ble HCT116 + CH3-celler ble behandlet med 5 uM curcumin eller 1 uM 5-FU eller deres kombinasjon (5 uM curcumin og 0,1 uM 5-FU) for 12 og 24 timer. Behandlede celler ble høstet og bearbeidet for flowcytometrisk analyse. Den mest betydningsfulle effekt i både enkelt- og kombinasjonsbehandlingen var en tids- og konsentrasjonsavhengig reduksjon av celler i G1-fase og akkumulering av celler i S-fasen av cellesyklusen. Denne effekten ble enda mer uttalt i HCT116 + CH3 celler enn i HCT116 cellene. Etter 12 timers behandling, noe som ble oppnådd allerede etter vi undersøkt effekten av curcumin og /eller 5-FU på cellesyklusen var allerede meget tydelig. I tillegg til endringene i G1 og S-fasefordeling, ble antallet celler som gjennomgår apoptose markert forhøyet med behandling. Interessant, effekten av kombinasjonsbehandlingen tydelig overskredet de av de enkelte behandlinger.
