Abstract
Bakgrunn
Castrate resistent prostatakreft (CRPC) er en dødelig tilstand hos pasienter som fikk androgen deprivasjon terapi for prostatakreft (PC). Til tross for mange studier som viser uttrykket av HIF1α proteinet som normoxia i PC-cellelinjer, rollen til denne normoksiske HIF1α uttrykk i chemo-motstand og migrasjon har ikke tidligere blitt undersøkt. Som ingen metode er for tiden tilgjengelig for å finne ut hvilke svulster vil utvikle seg til CRPC, ble rollen som HIF1α i PC og dens potensial for å forutsi utviklingen av CRPC også undersøkt.
Metoder
Effekten av HIF1α protein knockdown på chemo-motstand og migrering av PC3-celler ble bestemt ved celletelling og Transwell-analyser, respektivt. Oversettelse effektiviteten av HIF1α mRNA ble bestemt i PC-celler ved hjelp av en HIF1α 5’UTR-luciferase konstruere. Kliniske resultater ble korrelert etter farging av 100 prostatakreft for HIF1α uttrykk.
Resultater
De CRPC-lignende cellelinjer (PC3 og DU145) uttrykte mer HIF1α protein enn en androgen sensitive cellelinje ( LNCaP). Migrasjonsrate og kjemo-motstand var høyere i de PC3-celler og begge ble redusert når HIF1α ekspresjon ble redusert. Økt oversettelse av HIF1α mRNA kan være ansvarlig for HIF1α overekspresjon i PC3 celler. Pasienter med tumorer uttrykt HIF1α hadde signifikant redusert metastase overlevelse og pasientene som var på androgen-deprivasjon terapi hadde sunket CRPC overlevelse på Kaplan-Meier analyse. På multivariat analyse HIF1α var en uavhengig risikofaktor for progresjon til metastatisk PC (Hazard ratio (HR) 9,8, p = 0,017) og utvikling av CRPC (HR 10,0, p = 0,021) hos pasienter på androgen-deprivasjon terapi. Særlig svulster som ikke uttrykker HIF1α ikke metastaserer eller utvikle CRPC.
Konklusjoner
HIF1α er trolig bidra til metastasering og cellegift-motstand av CRPC og målrettet reduksjon av HIF1α kan øke reaksjonsevne av CRPCs til kjemoterapi. Uttrykk for HIF1α kan være et nyttig screening verktøy for utvikling av CRPC
Citation. Ranasinghe WKB, Xiao L, Kovac S, Chang M, Michiels C, Bolton D, et al. (2013) The Role of Hypoksi-induserbar faktor 1α i bestemme egenskapene til Castrate-Resistant prostatakreft. PLoS ONE 8 (1): e54251. doi: 10,1371 /journal.pone.0054251
Redaktør: Irina U. Agoulnik, Florida International University, USA
mottatt: 22 august 2012; Godkjent: 10 desember 2012; Publisert: 16 januar 2013
Copyright: © 2013 Ranasinghe et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd 454322 (GSB), 566555 (GSB, AS) og 628390 (AS, OP, GSB) fra National Health and Medical Research Council of Australia. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft (PC) er den nest vanligste kreftformen hos menn over hele verden og fortsetter å pålegge en betydelig sykdomsbyrde og et voksende globalt helseproblem. Men vår forståelse av mekanismene som bidrar til utvikling av PC fortsatt begrenset [1]. Androgener og androgen reseptor (AR) er viktige regulatorer av stimulering og overlevelse av prostata kreft celler. Androgen deprivasjon (ADT) er bærebjelken i behandling for metastatisk og lokalavansert prostatakreft. Men ADT til slutt ikke klarer å opprettholde prostata kreft undertrykkelse i et flertall av menn med denne tilstanden.
Castrate resistent prostatakreft (CRPC) er en dødelig form for PC som kan utvikle seg og spre seg raskt. På utvikling av CRPC, vil mer enn 84% av pasientene har metastaser [2]. Få biomarkører for prediksjon av CRPC har blitt beskrevet [3], [4], og for tiden er det ingen universell enighet om å identifisere hvilke pasienter med PC-en vil utvikle seg til CRPC. Videre mekanismene som fører til utvikling og progresjon av CRPC fortsatt dårlig forstått delvis på grunn av den begrensede tilgjengeligheten av cellelinjer som tett modellerer CRPC. De to mest brukte PC cellelinjer PC3 og DU145 anses ikke som fullt ut representative for CRPC celler siden de ikke var isolert fra prostata kreft som hadde tilbakefall etter androgen deprivasjon terapi, og siden de uttrykker liten [5] hvis noen AR [6], mens AR er ofte over-uttrykt i CRPC tumorer. Men som PC3 og DU145-celler viser noen av de grunnleggende egenskapene til en CRPC tumor inkludert høy migrasjon (metastaser), androgen-uavhengighet og kjemo-motstand lik den CRPC cellelinjen LNCaP c4-2 [7], og også dele lignende molekylære egenskaper , inkludert uttømming /mutasjon av mitokondrisk DNA, som har blitt korrelert med invasivitet og medikamentresistens [8], er disse to cellelinjene som ofte omtales som CRPC celler [9], [10], [11].
Hypoksi er en reduksjon i den normale konsentrasjon av vev oksygen som forekommer i mange sykdommer, inkludert kreft. En hypoksisk mikromiljøet i prostata er postulert å være ansvarlig for markedsføringen av sekundære genetiske forandringer og angiogene stimulering, fører til en mer aggressiv cellefenotyp og ondartet progresjon [12]. Evnen til cellene for å tilpasse seg til hypoksi er avhengig av et sett av hypoksi-induserbare transkripsjonsfaktorer (HIFs) som består av et regulatorisk alfa (HIF1α) og en konstitutiv beta-underenheten (HIF1β). HIFs bindes til kjernen sekvensen 5′-RCGTG-3 «på mål-promotorer og indusere mer enn 200 funksjonelt forskjellige gener som er involvert i celleoverlevelse [13]. Syntesen av HIF1α skjer via oksygen uavhengig mekanismer, men dens degradering er oksygenavhengig og involverer prolylhydroksylase, asparaginyl hydroksylase, Von Hippel-Lindau proteinet og proteasomal system [13].
Selv om HIF1α er over uttrykkes i et antall av humane cancere [14], [15], rolle HIF1α i progresjon av kreft er uklart. Høye konsentrasjoner av HIF1α nyre- og brystkreftcellelinjer ble vist å øke kreft celle overlevelse, mens i eggstokkreft høy HIF konsentrasjoner bidratt til økt apoptose [13]. Dai og medarbeidere rapporterte at akutt hypoksi økt HIF1α uttrykk og motilitet og invasiv kapasitet på tre PC cellelinjer [16]. Imidlertid, til tross for tallrike studier som viser tilstedeværelsen av HIF1α ekspresjon i normoxia, og en rapport som HIF1α signalisering er oppregulert i normoksisk kastrerings-resistente LNCaP c4-2 celler sammenlignet med foreldre LNCaP-celler [17], er rollen til normoksisk HIF1α uttrykk er ikke godt dokumentert, og derfor dannet grunnlaget for vår nåværende studie.
på samme måte, til tross for høy HIF1α uttrykk i PC vev [14], [18], [19], [20], [21], [ ,,,0],22], [23], [24], dens assosiasjon med prognosen er ufullstendig [25], [24], [26], [27]. Men konsensus er at HIF1α er oppregulert i prostatakreft [28], [24] og er en potent tumorindusert skjold mot oksidativt stress eller ødeleggelse av androgen deprivasjon, cellegift eller stråling cytotoksisitet [29]. Foreløpig ingen studier har rapportert forholdet mellom HIF1α uttrykk og utvikling av CRPC. Derfor ønsket vi å undersøke hvilken rolle HIF1α i reguleringen av CRPC og å analysere sitt potensial som en biomarkør for prediksjon av utviklingen av CRPC.
Materialer og metoder
In vitro studier
Cell kultur.
De tre menneskelige prostata kreft cellelinjer (PC3, DU145 og LNCaP) som brukes i denne studien ble sjenerøst donert av A /Prof. Ian Davis, Ludwig Institute for Cancer Research, Melbourne, og hadde blitt kjøpt fra ATCC i 2009. Cellelinjer ble dyrket i RPMI 1640 medium (Invitrogen, Mulgrave, Australia) supplert med 8% FBS og 100 U /ml penicillin. Alle celler ble opprettholdt ved 37 ° C i en fuktet inkubator med 95% luft og 5% CO
2. Den hypoksi-behandlede celler ble dyrket på samme måte som kontrollene, bortsett fra at gassfase inneholdt 94% nitrogen (N
2), 5% CO
2 og 1% O
2, med oksygenkonsentrasjoner overvåkes og justeres automatisk av en elektronisk oksygen regulator (ProOx Model 110, Biospherix, Redfield, New York).
Western blot-analyse.
Cellene ble vasket en gang med iskald fosfat-bufret saltvann ( PBS) og lysert med 0,1-0,2 ml ferdigkokt natriumdodecylsulfat (SDS) lysebuffer. Proteiner ble separert ved hjelp av SDS-polyakrylamid-gel-elektroforese og overført til en Hybond-C Extra nitrocellulosemembran (GE Healthcare, Rydalmere, Australia). HIF1α protein ble detektert med et monoklonalt muse anti-humant HIF1α antistoff (1:1000, BD Biosciences, North Ryde, Australia) etterfulgt av en sekundær geit anti-mus pepperrot-peroksidase-konjugert antistoff (1:5000, Bio-Rad). Som et lastekontroll, ble blottene inkubert med et pepperrot peroksidase (HRP) -konjugert kanin-anti-GAPDH-antistoff (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Bånd ble visualisert i en LAS 3000 Bilde Reader (Fujifilm, Brookvale, Australia), med en ECL Advance Western blotting Detection Kit (GE Healthcare). Densitometrisk analyse av proteinbåndene ble utført med MultiGauge programvare (Fujifilm).
proliferasjonsanalyse.
For måling av basale nivåer av proliferasjon, 2 x 10
5-celler ble dyrket i en 6 godt petriskål i kulturmedium supplert med FBS. Cellene ble vasket med PBS i 24 timer og dyrket i ytterligere 48 timer i serumfritt medium. Cellene som skulle motta behandling ble platet som ovenfor, og mediet ble fjernet etter 24 timer og supplert med FBS-fritt medium før behandling med hydrogenperoksyd (H
2o
2), kobolt-klorid, 5-fluorouracil (5-FU) eller hypoksi (1% O
2) i 48 timer. Cellene ble tellet ved bruk av et automatisert celleteller (Countess®, Invitrogen).
Migrasjon /invasjons Assays (Transwell-analyse)
prostatakreft-celler ble sådd ut ved en tetthet på 2 x 10
5-celler i 250 ul per brønn av serumfritt dyrkningsmedium på den øvre kammer av polyetylentereftalat-filtermembraner belagt med fibronektin. Forkamrene ble innsatt i vev-kultur brønnene og 750 ul serumfritt kulturmedium ble tilsatt til det nedre kammer. Etter inkubering over natten ved 37 ° C, ble ikke-migrerende celler på overflaten av den øvre membranen fjernes med en bomullsdott, og cellene som hadde migrert gjennom membranporene og invaderte undersiden av membranen ble fiksert med 90% metanol og farget med hematoxylin og eosin. For kvantitativ vurdering, ble antall farget, trekkende cellene deretter telles under et mikroskop. Fem laveffekts felt per filter ble telt ved tre anledninger i tre uavhengige eksperimenter.
Stall HIF1α slå ned i PC3 cellene.
plasmider som koder human HIF1α shRNA (Mission® klone tall TRCN0000003810 og TRCN0000010819, som koder for en hårnål-type siRNA) og en negativ kontroll plasmid (SHC002) ble innkjøpt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). -Celler ble transfektert med enten en HIF1α shRNA plasmid eller den negative kontroll-plasmidet ved hjelp av Neon® transfeksjonsmetoden (Invitrogen). I korthet, en x 10
6-celler ble trypsinert, vasket med PBS og pelletert før resuspensjon i 100 pl Neon resuspensjon buffer. HIF1α eller kontroll shRNA plasmid (5 ug) ble tilsatt og blandet godt inn i cellesuspensjonen før transfeksjon. De transfekterte celler ble sådd i fullstendig medium og valgt med 1,0 ug /ml puromycin (Sigma-Aldrich) i 7 dager før ytterligere analyser. Knockdown av HIF1α protein ble påvist ved Western blotting, og ved måling av dets nedstrøms produkt, vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF), ved hjelp av enzymbundet immunosorbent assay (ELISA).
nyttig effektivitet.
for å avgjøre om 5’UTR av HIF1α mRNA har noen rolle i HIF1α overekspresjon i prostataceller en reporter plasmid ble konstruert der hele 5’UTR og 238 bp av HIF1α promotersekvensen ble klonet oppstrøms
Firefly
luciferase-kodende sekvenser i pGL4.10 reporter plasmid. Reporteren konstruksjon ble transfektert inn LNCaP og PC3 celler og Firefly luciferase aktivitet drevet av HIF1-UTR reporter vektor og
Renilla
luciferase (pTK-Renilla kontroll reporter vektor) ble bestemt etter 24 timers inkubering. Totalt mRNA ble ekstrahert fra de transfekterte cellene, og antallet av luciferase-mRNA ble bestemt ved anvendelse av Real Time PCR. Luciferase mRNA i cellene transfektert med den tomme vektoren pGL4 ble anvendt som basal kontroll. Oversettelse effektivitet ble beregnet ved å dividere
Firefly
luciferase aktivitet (proporsjonal med luciferase protein) av konsentrasjonen av
Firefly
luciferase mRNA. Dette forholdet ble videre korrigert for transfeksjon effektivitet ved å ta hensyn til
Renilla
luciferase aktivitet.
Kliniske utfallet studier
Menneske vevsprøver.
For vurderingen av assosiasjoner mellom HIF1α uttrykk og kliniske utfall, ble 100 mennesker prostatakreft fra pasienter som hadde gitt informert skriftlig samtykke ble innhentet følgende radikal prostatektomi eller transuretral reseksjon av prostata (TURP) ved vår institusjon mellom 2000 og 2011. Alle prøver hentet fra Victorian Cancer Biobank og eller Institutt for Anatomisk patologi ved Austin Hospital, Victoria, Australia. Godkjenning for bruk av biologiske prøver og avidentifiserte pasientdata for denne studien ble innhentet fra Austin Helse menneskelige forskningsetiske komité.
Immunohistochemistry.
Parafin-vevssnitt ble de-vokset i histolene og hydrert med synkende etanolkonsentrasjoner. Platene ble skyllet i Tris-bufret saltvann /Tween 20 (TBST), og antigenene som ble hentet ved oppvarming i sitronsyrebuffer (pH 6,0) i en mikrobølgeovn i 2 minutter på middels høy og 13 minutter på middels lav. Platene ble tillatt å avkjøles og endogene peroksidaser i prøvene ble blokkert ved behandling med 3% hydrogenperoksid i 10 minutter i mørket. Platene ble vasket i vann, ekvilibrert i TBST-buffer, blokkert med Ultra (Thermo Fisher Scientific) i 10 minutter og farget for HIF1α ved hjelp av en HIF1α polyklonalt antistoff (1:100, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) ved 4 ° C over natten . Etter antistoff inkubering ble objektglass behandlet med et HRP-konjugert sekundært antistoff (Dako) i mørke ved romtemperatur i 1 time. Lysbilder ble vasket med TBST følgende fem minutter inkubasjon med 3,3′-diaminobenzidin (DAB) kromogen (en dråpe /ml substrat buffer, Dako) for å fullfargeutvikling. Til slutt, lysbilder ble kontra med hematoxylin i 1 minutt, vasket i rennende vann og Scotts vann fra springen i 1 minutt hver, dehydrert og dekke glapp. Etterforskerne ble blindet til status for individuelle prøver, og svulster ble delt i henhold til tilstedeværelse eller fravær av HIF1α snarere enn svak eller sterk farging for å redusere inter-observatør variasjon.
Resultater.
Distant metastaser ble definert av unormalt dokumentert på bein-scan eller computertomografi. CRPC ble definert som 2 påfølgende stiger av prostataspesifikt antigen (PSA) fra Ptil nadir. Tiden for utvikling av fjernmetastaser ble målt fra kirurgi, mens tiden for utvikling av CRPC, chemo-motstand og PC-spesifikk død ble målt fra starten av androgen deprivasjon. Pre-intervensjons PSA ble definert som PSA umiddelbart før skaffe vevsprøve, og T3 og T4 iscenesettelse ble definert som lokalavansert prostatakreft som i 2002 amerikanske Joint Commission on Cancer staging system [30].
Statistisk analyse.
statistisk analyse ble utført under ledelse av den statistiske rådgivningstjeneste, Universitetet i Melbourne, Australia. Pearsons Chi-kvadrat analyse og Fishers eksakte tester ble utført ved bruk av to-for-to tabeller (Gleason score, HIF1α positivitet, tumor stadium og antallet pasienter startet på androgen deprivasjon terapi) på SigmaStat programvare (Jandel Scientific, San Rafael, CA) til teste sammenhengen mellom pasientkarakteristikker og HIF1α uttrykk. Univariat og multivariat analyse ble utført ved hjelp av Cox regresjonsmodeller for alle variabler. For å overvinne den ikke-konvergens av Cox regresjonsmodellen når analysere for HIF1α positivitet og Gleason score (som var det ingen resultater i HIF1α negative gruppen og de lave Gleason score), disse univariat og multivariat analyse ble beregnet ved Cox regresjon med Firth er straffet maximum likelihood metoden bruker R programvare, (R grunnlaget for Statistiske Computing versjon 2.14.0). Overlevelse ble beregnet for hvert utfall ved hjelp av Kaplan-Meier-kurver med log rank test på SPSS statistisk pakke (IBM SPSS versjon 17). Diagnostisk test evalueringer med sensitivitet og spesifisitet analyser ble utført ved hjelp av MedCalc statistisk programvare (MedCalc Software, Belgia https://www.medcalc.org/).
In vitro
data blir presentert som middel ± SEM. Statistisk signifikans for enkelt sammenligninger av normalfordelte data ble bestemt av Students t test eller for data som ikke var normalfordelte med Mann-Whitney Rank Sum test. For flere sammenligninger enveis ANOVAs fulgt av Bonferronikorreksjon ble utført. All statistikk ble analysert med programmet SigmaStat (Jandel Scientific).
Resultater
HIF1α Expression korrelerer med migrasjonsrate i PC-Cells
HIF1α protein uttrykk ble analysert i androgen-sensitive (LNCaP) og androgen-insensitive (PC3 og DU145) CRPC-lignende celler. Basal HIF1α til uttrykk under normoxia var høyere med 12 ± 6 ganger og 10 ± 4 ganger henholdsvis i CRPC lignende cellelinjer PC3 og DU145 i forhold til androgen-sensitive LNCaP celler (Figur 1a). Interessant den observasjon at den basale veksthastighet av LNCaP-celler i serumfrie betingelser var mye høyere enn PC3-celler som uttrykker mer HIF1α indikerer at økt ekspresjon av HIF1α ikke nødvendigvis føre til økt proliferasjon (figur 1B). For å undersøke den metastatiske potensiale for PC cellelinjer, ble migrering av CRPC cellelinjer PC3 og DU145 i forhold til androgen-følsomme LNCaP-celler ved hjelp av en Transwell-analyse. Den observasjon at migrering av PC3 og DU145 cellene var 177 ± 6% og 215 ± 17% henholdsvis av verdien for LNCaP-celler (100%) (figur 1C) indikerte at overekspresjon av HIF1α er assosiert med økt migrasjon.
A) Basal HIF1α proteinkonsentrasjoner i de menneskelige PC cellelinjene LNCaP, DU145 og PC3 henhold normoksisk forholdene ble analysert ved Western blot. (B) Proliferasjon ble analysert ved celletelling etter 24 og 48 timer. (C) Migrasjon /invasjons priser ble målt ved Transwell analyser på 24 timer. Verdier i (A) og (C) er uttrykt som gangers økning i forhold til LNCaP-celler, mens verdiene i (B) er uttrykt som en prosentandel av tiden 0-verdi. Alle verdier er gjennomsnitt ± SEM fra minst tre separate behandlinger. (D) Overlevelse av PC celler eksponert for cytotoksiske forhold. Overlevelsen av PC3-celler (som har høyere basal HIF1α protein) når den utsettes for oksidativt stress med hydrogenperoksyd (H
2o
2) eller chemotoxicity med 5-fluorouracil (5-FU) ble sammenlignet med overlevelse av LNCaP -celler (som har lavere HIF1α uttrykk). Overlevelse ble bedømt ved å telle antall celler ved 24 timer. Verdier er uttrykt som en prosent av den ubehandlede kontroll, og er gjennomsnittet ± SEM fra minst tre separate behandlinger. #, P . 0,05 versus behandlet LNCaP celler
Greater HIF1α Expression korrelerer med økt celle Survival
En av karakteristikkene av CRPC er dens motstand mot kjemoterapi og radioterapi. For å undersøke om HIF1α er ansvarlig for den økte overlevelsen av CRPC-lignende celler
in vitro
, celle overlevelse etter behandling av PC3 eller LNCaP celler med to cytotoksiske midler, H
2o
2 (en kilde av oksidativt stress) og 5-fluorouracil (5-FU, et kjemoterapeutisk medikament) ble målt. Celleproliferasjon analyser (figur 1D) viste at overlevelse på 60 ± 14% og 42 ± 8% for PC3 celler etter behandling med 100 mikrometer H
2o
2 eller henholdsvis 15 um 5-FU, var signifikant større enn de respektive overlevelse av 17 ± 4% og 3 ± 1,6% i androgen-sensitive LNCaP celler.
HIF1α knockdown Reduserer Cell Survival og migrasjon av PC3 celler
for å bekrefte at den økte overlevelsen og migrasjon av PC3 celler skyldes større HIF1α protein uttrykk, var uttrykk for HIF1α i PC3 cellene slått ned ved hjelp shRNA vektorer. Transfeksjon av PC3-celler med en vektor som uttrykker HIF1α shRNA redusert HIF1α proteinekspresjon til 12 ± 3% i klon 1 og 16 ± 3% i klon 2 sammenlignet med vill-type-PC3-celler (100%) (figur 2A). VEGF, et nedstrøms produkt av HIF1α, ble også redusert i HIF1α knockdown kloner, noe som bekrefter den reduksjon i HIF1α aktivitet (data ikke vist). Observasjonen om at det ikke var noen forskjell i den basale formeringshastigheten mellom HIF1α shRNA-uttrykk PC3-celler og PC3-celler transfektert med en kryptert kontrollvektor er konsistent med det funn at det ikke var noen korrelasjon mellom større HIF1α ekspresjon og formeringshastigheten (figur 1B). Etter H
2o
2 behandling bare 22,5 ± 3% av HIF1α knockdown PC3 celler (shRNA klone en) overlevde sammenlignet med 58,5 ± 10% overlevelse i egge kontroll vektor-transfekterte PC3 celler (figur 2B). Tilsvarende 5-FU redusert celleoverlevelse til 27 ± 2% i de HIF1α knockdown-celler, sammenlignet med 62 ± 9% celleoverlevelse i PC3-celler transfektert med et kodet styrevektor. Det var ingen signifikant endring i ekspresjonen av HIF1α fulgt behandlingen av PC3-celler transfektert med kontroll shRNA med 100 pM H
2o
2 eller 15 uM 5-FU sammenlignet med ubehandlede PC3-celler (figur 2C). Men det var 2,3 ± 0,2 ganger og 6,6 ± 1-fold økning i uttrykket av HIF1α etter behandlingen av PC3 celler med 1% O
2 eller 300 mikrometer CoCl
2, henholdsvis (figur 2C). Som vist i figur 2A basal ekspresjon av HIF1α i HIF1α shRNA uttrykk PC3-celler er umulig å oppdage, og derfor er det ikke mulig å bestemme effekten av behandling med 100 pM H
2o
2 eller 15 uM 5-FU på HIF1α shRNA-uttrykke PC3 kloner.
(A) HIF1α konsentrasjoner ble redusert i 2 separate kloner av PC3 celler etter stabil uttrykk for HIF1α shRNA som vurderes av Western blot. Verdier er gjennomsnitt ± SEM fra minst tre separate forsøk, og er uttrykt som en prosentandel av villtype PC3-celler. *, P 0,05 versus villtype PC3 celler. (B) Den overlevelse av PC3-celler etter eksponering for oksidativt stress (hydrogenperoksid (H
2o
2)) eller chemotoxicity (5-fluorouracil (5-FU) i 24 timer ble redusert etter HIF1α knockdown sammenlignet med egge kontroll vektor-transfekterte PC3-celler Verdier er gjennomsnitt ± SEM fra minst tre separate forsøk, og er uttrykt som en prosent av ubehandlet eggekontroll vektor-transfiserte PC3-celler #, P .. 0,05 versus kontroll (C) HIF1α protein ekspresjon i. PC3 celler transfektert med kontroll shRNA etter behandling med 1% O
2, 300 mikrometer CoCl
2, 100 mikrometer H
2o
2, og 15 um 5-FU. Cellelysater ble elektroforese på SDS -polyacrylamide geler og blottet med HIF1α antistoff. GAPDH-ekspresjon ble anvendt som kontroll lasting. The Western blottene er vist er representative for minst tre separate forsøk. Band tettheter ble bestemt ved densitometrisk analyse av HIF1α /GAPDH og er presentert i forhold til verdien for ubehandlede . celler data representerer gjennomsnitt ± SEM; * p 0,05 vs. ubehandlede PC3 celler. (D) Priser migrasjon /invasjon i HIF1α knockdown PC3 celler ble redusert sammenlignet med eggekontrollvektor transfekterte PC3 celler som vurderes av Transwell analysen. Verdier er gjennomsnitt ± SEM fra minst tre separate forsøk, og er uttrykt som en prosent av ubehandlede kontrollegge vektor transfektert PC3-celler. *, P 0,05 versus kontroll. (E) Induksjon av HIF1α i LNCaP celler ved hypoksi (mørk grå søyler) eller med kobolt-klorid (lys grå søyler) økt overlevelse etter eksponering for oksidativt stress med H
2o
2 eller chemotoxicity med 5-FU for 24 timer når sammenlignet med kontroll LNCaP celler (svarte søyler). Verdier er gjennomsnitt ± SEM fra minst tre separate behandlinger og er uttrykt som en prosent av den ubehandlede LNCaP kontroll. #, P 0,05 versus behandlet LNCaP celler. *, P 0,05 versus LNCaP celler behandlet med 1% O
2 og 5-FU. (F) HIF1α protein ekspresjon i LNCaP-celler ble behandlet med 1% O
2 og 300 mM CoCl
2 i kombinasjon med enten 100 uM H
2o
2 eller 15 uM 5-FU. Cellelysater ble elektroforese på SDS-polyakrylamidgeler og utslettet med HIF1α antistoff. GAPDH uttrykket ble brukt som lasting kontroll. The Western blottene er vist er representative for minst tre separate forsøk. Band tettheter ble bestemt ved densitometrisk analyse av HIF1α /GAPDH og er presentert i forhold til verdien for normoksisk celler som gjennomgår samme behandling. Data representerer gjennomsnitt ± SEM; * P. 0,05 vs. ubehandlet kontroll, 100 mikrometer H
2o
2 eller 15 mikrometer 5-FU behandlet LNCaP celler
Tidligere en 1,8 ganger høyere migrasjonsrate ble observert i PC3 celler sammenlignet med androgen-sensitive LNCaP celler. For å avgjøre hvorvidt denne forskjellen ble formidlet av HIF1α ble migrering av HIF1α knockdown og kontroll vektor transfektert-PC3 celler sammenlignet. Knockdown av HIF1α ekspresjon av RNA-interferens redusert PC3 migrering til 37 ± 10% (klon 1) og 14 ± 7% (klon 2), sammenlignet med kontroll vektor transfektert-PC3-celler (100%) (figur 2D).
induksjon av HIF1α i LNCaP celler øker Cell Survival
for å avgjøre om induksjon av HIF1α uttrykk i androgen-sensitive LNCaP celler kan øke deres overlevelse etter behandling med cytostatika, ble HIF1α uttrykk indusert ved hjelp av enten hypoksi (1 % O
2) eller den mimetiske hypoksi koboltklorid (figur 2E). Inkubering av LNCaP-celler med enten 100 uM H
2o
2 eller 15 uM 5-FU redusert overlevelse til 17 ± 4% og 26 ± 2% sammenlignet med ubehandlet kontrollgruppe (100%). Men overlevelse i nærvær av 100 mikrometer H
2o
2 etter behandlingen av LNCaP celler med enten 1% O
2 eller kobolt-klorid økt til 40 ± 8% og 49 ± 11% henholdsvis. Den overlevelse (113 ± 23%) av LNCaP-celler ble behandlet med 300 mM CoCl
2 i kombinasjon med 15 uM 5-FU var signifikant høyere sammenlignet med overlevelse (54 ± 10%) observert i LNCaP-celler behandlet med 1% O
2 i kombinasjon med 15 mikrometer 5-FU. Interessant, 300 mM CoCl
2 i kombinasjon med 15 uM 5-FU indusert en noe høyere 3,3 ± 0,5 ganger økning i HIF1α ekspresjon i LNCaP-celler sammenlignet med 2,1 ± 0,4 gangers økning indusert av 1% O
2 i kombinasjon med 15 mikrometer 5-FU, men forskjellen var ikke statistisk signifikant (figur 2F).
Økt Oversettelse Effektivitet av HIF1α mRNA er ansvarlig for HIF1α Overuttrykte i PC3 celler
selv om regulering av translasjon ved 5’UTR er en viktig mekanisme for post-transkripsjonell regulering av genekspresjon, har oversettelse effektiviteten av HIF1α mRNA i prostataceller ikke vært rapportert tidligere. Som vist i figur 3A forholdet
Firefly
til
Renilla
luciferase-aktivitet etter transfeksjon av HIF1α 5’UTR-LUC reporter og pTK Renilla-styre vektorer var 20 ± 3 ganger og 26 ± 3 ganger i LNCaP og PC3-celler, respektivt, sammenlignet med celler transfektert med den tomme vektoren pGL4. Men luciferase mRNA uttrykk var 33 ± 1,4 ganger i LNCaP og 9 ± 2,1 ganger i PC3 celler sammenlignet med tom pGL4 vektor transfektert celler (Figur 3B). Ytterligere oversettelsen effektiviteten av HIF1α mRNA i PC3 celler var 2,9 ± 0,4 ganger høyere enn LNCaP cellene når evaluert med indeksen av luciferase aktivitet /relativ mRNA innhold (Figur 3C).
(A)
Firefly Hotell og
Renilla
luciferasepreparater aktiviteter i prostatakreftceller etter transfeksjon av en HIF1α 5’UTR-luciferase konstruere og PTK-Renilla kontroll reporter vektor ble bestemt ved hjelp av en dual luciferase assay. (B) Real-time PCR (RT-PCR) analyse av luciferase mRNA i PC-celler transfektert med HIF1α 5’UTR-luciferase konstruere. Etter transfeksjon, ble RNA isolert, og luciferase-mRNA-ekspresjon detektert av sanntids-RT-PCR og normalisert ved 18S mRNA-ekspresjon. (C) translasjonell effektivitet representerer forholdet
Firefly
/
Renilla
luciferaseaktivitet, dividert med den relative luciferase mRNA-konsentrasjon i PC-celler. Den translatoriske effektivitet av luciferase mRNA drevet av 5’UTR region av HIF1α i PC3-celler er høyere enn i LNCaP-celler. Verdier er gjennomsnitt ± SEM fra minst tre separate forsøk. *, P . 0,05 versus behandlet LNCaP celler
HIF1α Protein Expression i Human Prostate Cancer Svulster
Ett hundre mennesker PC prøvene ble delt inn i to grupper etter deres Gleason score (≤ 7 (38) og 7 (62), tabell 1) og HIF1α status. Ekspresjon av HIF1α ble bedømt ved immunhistokjemi (figur 4A). Figur 4A (a) viser en positiv, og 4A (b) viser en negativ, HIF1α farging i to typiske svulster med Gleason scorer 9 (Innfelt boks, X20 visning). Figur 4A (c) viser en positiv, og figur 4A (d) viser en negativ (d), HIF1α farging i to typiske tumorer med Gleason ballen 6. Positiv farging i PC3-celler (figur 4A (e)) og negativ farging i LNCaP -celler (figur 4A (f)) og i HIF1α knockdown PC3-celler (figur 4A (g)) demonstrerte spesifisiteten til HIF1α antistoff. I tillegg HIF1α ble uttrykt i hele tumoren med økt ekspresjon i hovedprostatakjertler (indikert ved pilen i figur 4A (a)) og i lymfeknutemetastaser (indikert ved pilen i figur 4A (h)). I positive prøver HIF1α uttrykk var homogen i hele tumorområdet.
(A) Representative immunhistokjemi resultater som viser uttrykk for HIF1α i prostatakreft prøver og cellelinjer. Positiv (Aa) og negative (Ab) farging for HIF1α ble observert i to typiske svulster med Gleason scorer 9 (Innfelt boks, X20 visning).
