Abstract
epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) blir i stor grad uttrykt i hode- og halskreft. Imidlertid har EGFR-målrettet terapi bare beskjeden effekt i hode og nakke kreft, gjennom mekanismer som ikke er fullt ut forstått. Her fant vi at hemming av EGFR av erlotinib stimulert fosforylering og aktivering av STAT3 fører til økt BCL2 /BCL-XL uttrykk i hode og nakke kreft celler, noe som kan dempe den terapeutiske effekten av erlotinib mot hode og nakke kreft. Erlotinib-forbedret STAT3 fosforylering resultater, i det minste delvis, fra undertrykkelse av dens fysiologiske fosfatase, PTPMeg2. Spesifikk knockdown av STAT3 av RNA-interferens betydelig sensitivisert hode- og nakkekreftceller som erlotinib behandling. Farmakologisk hemming av STAT3 av niclosamide ikke bare blokkert erlotinib stimulert STAT3 fosforylering men også synergi trykt hode og nakke kreft vekst
in vitro Hotell og
in vivo
. Kombinert hemming av EGFR og STAT3 av erlotinib og niclosamide mer effektivt indusert apoptose i tumorvevet uten toksisitet for normale vev. Basert på våre funn, kan behandling med erlotinib kombineres med niclosamide tilby en effektiv terapeutisk tilnærming for å forbedre prognosen for hode og nakke kreft
Citation. Li R, du S, Hu Z, Chen ZG, Sica GL, Khuri FR, et al. (2013) Hemming av STAT3 av Niclosamide synergizes med Erlotinib mot hode og nakke kreft. PLoS ONE 8 (9): e74670. doi: 10,1371 /journal.pone.0074670
Redaktør: Xiaolin Zi, University of California Irvine, USA
mottatt: May 1, 2013, Godkjent: 05.08.2013; Publisert: 3. september 2013
Copyright: © 2013 Li et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av R01CA136534 (XD), NCI P50 CA128613 (DMS) og R33 CA161873 (ZGC). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
hode og nakke kreft konsekvent rangerer blant de seks hyppigst diagnostisert kreft i verden [1]. Over 90% av hode og nakke kreft er plateepitelkreft karsinomer i øvre aerodigestive kanalen, inkludert munnhulen, svelget, strupehode, og bihuler (1). Plateepitelkarsinom i hode og hals (SCCHN) utgjør anslagsvis 2,5% av kreftdiagnoser i USA, med 41,380 nye tilfeller diagnostisert og anslagsvis 7,890 dødsfall i 2013 [2]. Til tross for fremskritt i konvensjonell behandling, inkludert kirurgi, stråling og kjemoterapi, den totale overlevelsen for SCCHN har ikke blitt betydelig forbedret de siste tiårene. Epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) er allment uttrykt i SCCHN og har vært brukt som et viktig mål for behandling av denne sykdom [3]. Erlotinib, har en EGFR-tyrosinkinase-inhibitor (TKI), blitt brukt til behandling av SCCHN men dens effekt er beskjeden [5]. Mekanismen regnskap for begrenset effekt av erlotinib i hode og nakke kreft terapi er ikke fullt ut forstått. Det er mulig at hemming av EGFR av erlotinib kan indusere aktivering av noen overlevelse signalveien (e) som demper effekten av erlotinib mot SCCHN.
STAT3, et medlem av STAT familien av transkripsjonsfaktorer, er aktivert i flere kreftformer, og har nylig blitt godkjent som en attraktiv terapeutisk mål i kreftbehandling, inkludert hode og nakke kreft [6-10]. I tillegg SCCHN prøvene har også høyere nivåer av STAT3 enn normalt vev [11]. Latent cytoplasmatiske STAT3 blir aktivert ved fosforylering på rest Tyr705 ved Janus assosiert kinase (JAK) eller vekstfaktor-reseptor-assosiert tyrosin kinase (SRC) [12]. Fosforylert STAT3 dimerizes gjennom en gjensidig Src-homologi 2-fosfo-tyrosin-interaksjon og akkumuleres i kjernen, hvor den aktiverer transkripsjon av en rekke gener, inkludert BCL2 /Bcl-XL, cyclin D1, c-Myc, etc [13, 14]. I tillegg til å STAT3 kinaser (dvs. JAK), er STAT3 fosforylering også strengt regulert ved en prosess av defosforylering, som blir mediert av protein tyrosin fosfatase PTPMeg2 [15]. PTPMeg2 har nylig blitt identifisert som en ny fysiologisk STAT3 fosfatase som direkte dephosphorylates STAT3 ved Tyr705 rest [15]. Intratumoral administrasjon av STAT3 decoy hemmet veksten av SCCHN xenografttumorer
in vivo product: [16], noe som tyder på at STAT3 er en potensiell terapeutisk mål for SCCHN. Til tross for løftet om en rekke rasjonelle tilnærminger for å målrette STAT3 funksjon, vises det ikke lite molekyl STAT3 inhibitor for å være klar for klinisk utvikling så langt [17].
Niclosamide har nylig blitt rapportert som en potent STAT3 inhibitor mot kreft celler [18]. I denne rapporten viser vi at erlotinib forbedrer STAT3 fosforylering ved nedregulering av sin fosfatase PTPMeg2 fører til forhøyede nivåer av BCL2 /BCL-XL, noe som reduserer følsomheten SCCHN som erlotinib behandling. Niclosamide, som STAT3 inhibitor, kan blokkere erlotinib-indusert fosforylering av STAT3 fører til synergistisk undertrykkelse av hode og nakke kreft.
Materialer og metoder
Material
Niclosamide ble kjøpt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA). Erlotinib ble oppnådd fra LC Laboratories (Woburn, MA). Fosfor-EGFR (Tyr1068), fosfor-STAT3 (Tyr705), fosfor-JAK2 (Tyr1007 /1008), aktiv caspase 3 og Survivin antistoffer ble kjøpt fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA). β-aktin og Mcl-1-antistoffer, PTPMeg2 shRNA og dens kontroll shRNA ble kjøpt fra Santa Cruz Bioteknologi (Santa Cruz, California). PTPMeg2 antistoff ble erholdt fra R for human BCL-XL: fremover, 5’ATA GTT CCA CAA AGG CAT CC -3 «og omvendt, 5’TGG GAT GTC AGG TCA CTG AA-3»; og for β-aktin: fremover, 5’TCA GGA TCC ACG TGC TTG TCA -3 «; revers, 5’TAC CCT TGG ACC CAG AGG TTC TTT GA -3 «. Relative genekspresjon kvantifisering ble utført i henhold til sammenlignings Ct-metoden ved hjelp av β-aktin som en intern standard. Kvantifisering av genuttrykk ble analysert med 7500 v 2.0.5 program og kvantifisert ved 2-ΔΔCt metoden. Data representerer gjennomsnitt ± SD av tre uavhengige eksperimenter.
RNA interferens
Lentiviral pSIH1-puro-STAT3 shRNA og pSIH1-puro-kontroll shRNA ble hentet fra Addgene (Cambridge, MA). Kontrollen shRNA plasmid-A koder for et omkastet shRNA sekvens som ikke vil føre til at den spesifikke nedbrytning av enhver cellulær beskjed. Kontroll shRNA hårnål sekvens: CCT AAG GTT AAG TCG CCC TCG CTC GAG CGA GGG CGA CTT AAC CTT AGG. STAT3 shRNA hårnål sekvens: GAT CCG CAT CTG CCT AGA TCG GCT ATT CAA GAG ATA GCC GAT CTA GGC AGA TGT TTT TTG. PTPMeg2 shRNA og dens kontroll shRNA ble kjøpt fra Santa Cruz Bioteknologi (Santa Cruz, California). For pseudovirus produksjon, ble STAT3 shRNA eller PTPMeg2 shRNA kotransfektert inn 293ft celler med lentivector emballasje plasmid blanding (System biovitenskap, CA) ved hjelp NanoJuice transfeksjon kit (EMD Chemical, Inc.) som beskrevet [23]. Etter 48 timer, ble virusinneholdende medium høstet ved sentrifugering ved 20.000 x g. Celler ble infisert med virus som inneholder media i nærvær av polybren (8 ug /ml) i 24 timer etter som stabile positive kloner ble valgt ved hjelp av 1 ug /ml puromycin.
Sulforhodamine B (SRB) assay
den hemmende effekten av erlotinib og niclosamide på cellevekst ble vurdert ved hjelp av sulforhodamin B (SRB) analyse som beskrevet [24]. Celler ble dyrket i triplikate brønner ved bruk av 96-brønners plater. Etter vekst over natten, ble cellene behandlet med erlotinib, niclosamide eller en kombinasjon i 48 timer. Den overlevende cellefraksjonen ble bestemt som beskrevet [24].
hode- og halskreft xenografter og behandlinger
Den institusjonelle Animal Care og bruk komité Emory University godkjent protokollen for dyreforsøk. Seks uker gamle nu /nu nakne mus ble innkjøpt fra Harlan og holdt under patogenfrie forhold i mikroisolatorbur. Xenotransplantater ble reist ved å injisere 5 × 10
6 av Tu212 celler i en balansert saltoppløsning inn i underhudsvevet over flanken regionen nakne mus. Svulster fikk lov til å vokse til en gjennomsnittlig volum på 250 mm
3 før behandlingsstart som beskrevet [25]. Tumor-bærende mus ble tilfeldig delt inn i fire behandlingsgrupper (n = 8 per gruppe) som følger: (1) bærerkontroll (0,5% DMSO, 100 ul /d i.p.); (2) erlotinib (40 mg /kg /dag i.p.); (3) niclosamide (20 mg /kg /dag i.p.); (4) erlotinib (40 mg /kg /d) + niclosamide (20 mg /kg /d). Tumor volum ble vurdert ved kalibermålinger gang annenhver dag, og beregnes med formelen: V = (LxB
2) /2 (L: lengde; W: bredde) som beskrevet [26]. Etter 14 dager med behandling ble musene avlivet ved inhalert CO
2. Høstet tumorer ble anvendt for videre analyse.
Immunhistokjemi (IHC) analyse
IHC-farging av tumorvev ved hjelp av kanin-anti-human aktiv caspase-3 antistoff ble utført som beskrevet [25]. Kort fortalt ble høstet svulster i parafin og kuttet i 4-mikrometer seksjoner. Farging ble utført ved hjelp av R.T.U. Vectastain sensoren ved å følge produsentens standard protokoll (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Vevet Platene ble blokkert med 2,5% normalt hesteserum i 10 min. Prøvene ble deretter inkubert med kanin anti-humant aktiv caspase-3 antistoff (1:50 fortynning), over natten ved 4 ° C. Etter vasking ble vevet glir inkubert med anti-kanin-IgG-HRP-sekundært antistoff i 10 minutter. Platene ble farget med 3,3′-diaminobenzidin (DAB) (Vector Laboratories) og motfarget med hematoksylin (Vector Laboratories), tørket, behandlet med xylen og montert. Alle lysbildene ble undersøkt og representative bildene ble tatt med et Olympus BX41 mikroskop (Olympus, Amerika, Melville, New York). Aktive caspase-positive celler i tumorvev ble scoret på 400 × forstørrelse. Gjennomsnittlig antall positive celler per 0,0625 mm
2 området ble bestemt ut fra tre separate felt i hver av tre uavhengige tumorprøver som beskrevet [25].
Quantum dot-basert immunohisto fl uorescence (QD-IHF) og dens signal kvantifisering
QD-IHF for måling av protein-ekspresjon i tumorvevet ble utført som beskrevet tidligere [27-29]. Kort fortalt ble høstet svulster i parafin og kuttet i 4-mikrometer seksjoner. Etter deparaffinization og rehydratisering, ble antigen gjenfinning utføres ved å oppvarme med citrat buffer (10 mmol /l, pH 6,0) i en mikrobølgeovn i 10 min. Vevet Platene ble blokkert med 2,5% normalt hesteserum i 10 minutter før det primære antistoff inkubering. Kanin-anti-human pEGFR og mus anti-human p-STAT3 antistoffer ble blandet ved 1:50 fortynning i 1 x PBS inneholdende 2,5% hesteserum. Normal kanin-IgG ble anvendt som en negativ kontroll. Vevssnitt ble inkubert med en blandet oppløsning av p-EGFR og p-STAT3 antistoff over natten ved 4 ° C. Etter vasking med 1 x PBS tre ganger, QD705 geit-anti-mus-IgG-konjugat (grønn) og QD605 geit-anti-kanin-IgG-konjugat (rød) sekundære antistoffer ble tilsatt til objektglassene med ytterligere inkubering i 1 time ved 37 ° C. Platene ble vasket tre ganger med 1 x PBS, kontra med DAPI, montert og lagret ved 4
oC under mørke forhold. QD bildebehandling og kvantifisering prosedyrer ble utført som tidligere beskrevet [29]. Den Nyanse
TM fluorescens mikroskop system (CRi konsolidert med Sylinder, et PerkinElmer firma, Hopkinton, MA) ble anvendt for kvantifisering av QD-IHF signaler. Alle cubed bildefiler ble hentet fra svulstvev lysbilder på bølgelengde intervaller 10 nm 420-720 nm, med en automatisk eksponeringstiden per bølgelengde intervallet 200 ~ 400x forstørrelse. Tar kube med en lang bølgelengde band pass filter tillatt overføring av alle utslippsbølgelengder over 420 nm. Både skilt og kombinert QD bilder ble oppnådd ved unmixing bildet kuben basert på etablering av QD spektral biblioteket. For hvert vev lysbilde, ble 10 kuber tatt. Bakgrunnen signal ble fjernet for nøyaktig kvantifisering av QD signaler. Gjennomsnittet av hver QD signal ble oppnådd ved å velge tumorområdene på hver kube for kvantifisering av nyanse bildebehandling (Sylinder /PerkinElmer). En gjennomsnittlig lesing fra 10 kuber ble oppnådd som en samlet gjennomsnittlig signal telling av hver vev lysbilde for både pEGFR og pSTAT3 signaler.
Mus blod analyse
Fullblod (250 uJ) ble samlet i EDTA -belagte rør via hjertestans punktering av bedøvet mus for hematologi studier. Prøvene ble analysert for hvite blodceller (WBC), røde blodceller (RBC), blodplater (PLT), alaninaminotransferase (ALAT), aspartataminotransferase (ASAT) og blod urea nitrogen (BUN) i klinisk patologi laboratorium ved Universitetet i Georgia (Athens, Georgia)
Statistisk analyse
Vesentlige forskjeller mellom to gruppene ble analysert ved hjelp av to-sidig uparet t-test og p-verdi 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Statistisk analyse ble utført med Graphpad INSTAT 3 programvare (San Diego, California) [30].
Analyse av kombinasjonen indeks (CI) verdi
CI verdi for stoffet synergi ble beregnet ved hjelp av CompuSyn programvare (Combo-Syn, Inc., Paramus, NJ) som beskrevet [31].
Resultater
Hemming av EGFR av erlotinib nedregulerer PTPMeg2 fører til økt STAT3 fosforylering
Det har nylig rapportert at hemming av EGFR av erlotinib aktiverer STAT3 /BCL2 /BCL-XL overlevelse signalveien i menneskelig lungekreft [32]. For å teste om denne effekten av erlotinib skjer i hode og nakke kreft celler, ble Tu212 og Tu686 celler behandlet med erlotinib (0,1 gM) for ulike tider. Resultatene indikerte at erlotinib redusert EGFR fosforylering i forbindelse med forbedret Tyr705 STAT3 fosforylering, økte nivåer av BCL2 /BCL-XL og redusert nivå av survivin (figur 1A). STAT3 er en fysiologisk transkripsjonsfaktor på BCL2 og BCL-XL [33-35]. Økte nivåer av BCL2 og BCL-XL mRNA ble også observert i Tu212 og Tu686 celler etter erlotinib behandling (figur 1B), noe som indikerer at erlotinib-aktivert STAT3 positivt regulerer BCL2 /BCL-XL, men ikke survivin på transkripsjonsstadiet. For å demonstrere hvordan erlotinib stimulerer STAT3 fosforylering ble effekten av erlotinib på STAT3 kinase (dvs. JAK2) og fosfatase (dvs. PTPMeg2) vurderes. Forbløffende nok erlotinib ikke bare hemmet JAK2 fosforylering men også betydelig redusert PTPMeg2 uttrykk nivå i hode- og nakkekreftceller (figur 1A). Disse funnene tyder på at erlotinib-mediert STAT3 fosforylering og aktivering kan skyldes hemming av STAT3 fosfatase PTPMeg2.
En
, Tu212 og Tu686 celler ble behandlet med erlotinib (0,1 gM) for ulike tider . Nivåer av ulike proteiner (pSTAT3, PTPMeg2, pEGFR, BCL2, BCL-XL, etc.) ble analysert ved Western blot.
B
, Tu212 og Tu686 celler ble behandlet med erlotinib (0,1 gM) for ulike tider. Nivåer av BCL2 eller BCL-XL mRNA ble analysert ved RT-PCR.
Viktigere spesifikk knockdown av PTPMeg2 også ført til økt STAT3 fosforylering og forhøyede nivåer av BCL2 og BCL-XL i hode og nakke kreft -celler (figur 2), noe som ytterligere støtter rollen PTPMeg2 som en fysiologisk STAT3 fosfatase, som nylig rapportert [15].
PTPMeg2 shRNA eller kontroll shRNA ble transfektert inn i Tu212 celler. Expression nivåer av pSTAT3, BCL-XL, BCL2 og Mcl-1 ble analysert ved Western blot.
Brudd STAT3 sensitizes hode- og nakkekreftceller som erlotinib
For å teste om erlotinib -mediert STAT3 aktivisering påvirker erlotinib aktivitet mot hode og nakke kreft negativt, ble STAT3 slått ned fra Tu212 og Tu686 celler ved hjelp STAT3 shRNA (figur 3A). Stanse av STAT3 ikke bare nedregulerer BCL2 og BCL-XL (figur 3A) men også betydelig sensitizes hode- og nakkekreftceller til erlotinib (figur 3B), noe som tyder på at målretting STAT3 kan ha et stort potensial for å forbedre effekten av erlotinib mot hode og nakke kreft .
En
, STAT3 shRNA eller kontroll shRNA ble transfektert inn Tu212 og Tu686 celler. Expression nivåer av STAT3, BCL-XL og BCL2 ble analysert ved Western blot.
B
, Tu212 og Tu686 celler som uttrykker STAT3 shRNA eller kontroll shRNA ble behandlet med erlotinib (1 um) i 48 timer. Cellevekst ble bestemt av SRB analyser.
Niclosamide blokker erlotinib-indusert STAT3 fosforylering og synergizes med erlotinib i undertrykkelse av hode og nakke kreft celle vekst
Niclosamide har nylig blitt identifisert som en potent inhibitor STAT3 [18]. For å teste om farmakologiske avbrudd av STAT3 aktivitet sensitizes hode- og nakkekreftceller til erlotinib ble Tu212 og Tu686 celler behandlet med erlotinib i fravær eller nærvær av økende konsentrasjoner av niclosamide. Western blot analyse viste at niclosamide hemmet erlotinib-indusert fosforylering STAT3 og downregulated BCL2 /Bcl-XL på en doseavhengig måte (figur 4A). Viktigere, niclosamide i kombinasjon med erlotinib betydelig utvidet veksthemming på hode og hals kreftceller (dvs. Tu212 og Tu686) (figur 4B). For mer nøyaktig analysere grad av synergi mellom niclosamide og erlotinib, kombinert indeks (CI) verdiene ble beregnet som beskrevet i «metoder». CI verdiene var 0,39325 for Tu212 og 0,447333 for Tu686 celler, henholdsvis. CI verdier på mindre enn 1 indikerer at niclosamide og erlotinib utstillingssynergistisk vekst hemming av hode og nakke kreft celler.
En
, Tu212 og Tu686 celler ble behandlet med erlotinib i fravær eller nærvær av økende konsentrasjoner av niclosamide i 48 timer. pSTAT3, BCL2 og BCL-XL ble analysert ved Western Blot.
B
, Tu212 og Tu686 celler ble behandlet med erlonitib, niclosamide eller deres kombinasjon. Etter 48 timer ble celleveksten bestemt ved SRB-analyser. Kombinasjon indeks (CI) verdiene ble beregnet som beskrevet i «Methods.
Niclosamide og erlotinib synergi hemme veksten av hode og nakke kreft dyre xenografter
Siden niclosamide og erlotinib spille en synergistisk rolle mot hode og nakke kreft
in vitro plakater (figur 4), er det interessant å undersøke dette synergistisk effekt
in vivo
. Først ble hode- og halskreft xenografter generert ved hjelp Tu212 celler. Deretter ble mus med Tu212 hode og nakke kreft xenotransplantater behandlet med erlotinib (40 mg /kg /d), niclosamide (20 mg /kg /d) alene eller i kombinasjon for to uker. Resultatene viste at både erlotinib og niclosamide alene hadde beskjeden effekt mot xenografttumorer. Men kombinasjonen av erlotinib og niclosamide trykt xenograft tumordannelse betydelig mer effektivt enn både monoterapi alene
in vivo product: (p 0,01) (figur 5A). Disse dataene antyder at niclosamide og erlotinib har sterke synergisme i behandling av hode og nakke kreft.
En
, mus som bærer Tu212 xenotransplantater ble behandlet med kjøretøy kontroll, erlotinib (Erlo, 40 mg /kg /d), niclosamide (Niclo, 20 mg /kg /d) eller deres kombinasjon i 14 dager. Hver gruppe inkluderte 8 mus. Tumorvolumet ble målt en gang hver 2. dag. Etter 14 dager ble musene avlivet og tumorene ble fjernet og analysert. Representative kreft bildene ble tatt.
B
, aktiv caspase 3 og Ki 67 ble analysert i tumorvev ved slutten av forsøkene ved IHC-farging og kvantifisert som beskrevet under «Metoder».
C
, Expression nivåer av pEGFR, pSTAT3, BCL2 og BCL-XL i tumorvev fra ulike behandlingsgruppene ble analysert ved Western blot.
Vi målte apoptose ved analyse av aktiv caspase 3 i tumorvev etter IHC-farging som tidligere beskrevet [25]. Kombinasjonen av erlotinib og niclosamide betydelig økt aktiv caspase 3 positive celler i forbindelse med redusert Ki-67 positive celler i hode og nakke tumorvev (figur 5B). Protein analyse av svulstvev lysatene fra tre mus i hver behandlingsgruppe indikerte at niclosamide blokker erlotinib stimulert STAT3 fosforylering fører til redusert BCL2 og BCL-XL nivåer (figur 5C). Disse dataene antyder den molekylære mekanismen som niclosamide og erlotinib utstillings synergisme mot hode og nakke kreft vekst
in vivo
.
Viktigere behandlinger ble godt tolerert uten vekttap under behandling (Figur 6A). Det var ingen observerbare endringer i vitale organfunksjoner som reflekteres av resultatene av lever, nyre, og benmargsfunksjonsprøver (ALAT, ASAT og bun, WBC, Hb og blodplater) (figur 6B). Histopatologi av høstet normalt vev (hjerne, hjerte, lunge, lever, milt, nyre og tarm) viste ingen tegn på toksisitet i normalt vev (figur 6C).
En
, Kroppsvekt av mus med Tu212 xenografter ble målt en gang annenhver dag under behandling med kjøretøy kontroll, erlotinib (Erlo, 40 mg /kg /d), niclosamide (Niclo, 20 mg /kg /d) eller deres kombinasjon.
B
, Blood analyse av mus etter forskjellige behandlinger for 14 dager. C, H E histologi av ulike organer etter behandlinger.
Analyse av pEGFR og pSTAT3 i tumorvev etter quantum dot (QD) -basert immunohistofluorescence (QD-IHF)
QD-IHF teknikk har en betydelig fordel i at for kvantifisering av flere biomarkører samtidig på det samme vev glide [27-29,36]. Nivåene av pEGFR og pSTAT3 ble samtidig analysert ved QD-IHF hjelp primære antistoffer og QD-konjugerte sekundære antistoffer med to forskjellige emisjonsbølgelengder (dvs. QD705 (grønn) og QD605 (rød)). Både skilt og kombinert QD bilder ble oppnådd etter bestemme QD spektral biblioteket og unmixing den cubed bildet. QD bilder fra tumorvev viste at pEGFR ble lokalisert ved cellemembranen og pSTAT3 ble plassert i kjernen (figur 7). Redusert pEGFR og ble observert økt pSTAT3 nivåer i hode og nakke xenograft tumorvev etter behandling av mus med erlotinib (figur 7). Videre niclosamide fullstendig blokkert erlotinib stimulert STAT3 fosforylering i tumorvev (figur 7).
A Hotell og
B
, Tu212 xenotransplantater ble behandlet med kjøretøy kontroll, erlotinib (Erlo, 40 mg /kg /d), niclosamide (Niclo, 20 mg /kg /d) eller deres kombinasjon i 14 dager. pEGFR og pSTAT3 ble analysert i tumorvev ved utgangen av eksperimenter ved QD-IHF og kvantifisert som beskrevet i «metoder».
Diskusjoner
Hode og nakke kreft er blant de mest utbredt svulster i verden. Til tross for fremskritt i konvensjonell terapi (dvs. kirurgi, stråling og kjemoterapi), har den generelle overlevelse for SCCHN ikke vesentlig forbedret de siste tre tiårene [4]. Derfor er utvikling av mer effektive nye tilnærminger som virker gjennom grunnleggende molekylære mekanismer kritisk for å bedre prognosen for hode og nakke kreft. EGFR er mye overuttrykt i SCCHN. Til tross for den allestedsnærværende ekspresjon, behandling målrettet mot EGFR er bare moderat effektivt ved behandling av SCCHN [5]. Mekanismen for resistens mot EGFR målsøkende midler er ikke fullt ut forstått. Her fant vi at hemming av EGFR av erlotinib resulterer i fosforylering av STAT3 på Tyr705 fører til sin aktivering og til økte nivåer av BCL2 /BCL-XL på både mRNA og protein nivå i hode og nakke kreft celler (figur 1). Denne effekten kan redusere effekten av erlotinib mot hode og nakke kreft. Interessant, fikk erlotinib-indusert STAT3 fosforylering og aktivering ikke et resultat av sin oppstrøms kinase JAK2 fordi erlotinib ikke aktivere JAK2, men ordreantal reduserer JAK2 fosforylering (figur 1A). I tillegg til JAK2 er STAT3 fosforylering også strengt regulert av defosforylering ved dens fysiologisk fosfatase PTPMeg2 [15]. Behandling av Tu212 og Tu686 hode og nakke kreft celler med erlotinib redusert PTPMeg2 (dvs. en fysiologisk STAT3 fosfatase) i en tidsavhengig måte (figur 1A). Således, erlotinib, i tillegg til inhibering av EGFR, kan også undertrykke PTPMeg2 fører til økt STAT3 fosforylering. Forbløffende spesifikk knockdown av PTPMeg2 aktivert også STAT3 /BCL2 /BCL-XL overlevelse pathway (figur 2), noe som tyder på at PTPMeg2 kan spille en viktig rolle i å regulere følsomheten av erlotinib til hode og nakke kreft celler.
STAT3 har nylig blitt identifisert som en potensiell terapeutisk mål for behandling av hode og nakke kreft [37]. Nedbryting av STAT3 av RNAi sensitizes betydelig hode- og nakkekreftceller til erlotinib (figur 3). Niclosamide har nylig blitt identifisert som en STAT3 inhibitor som kan undertrykke STAT3 fosforylering på Tyr705 og karakterutskrift aktivitet [18]. Siden niclosamide ikke bare potent blokker erlotinib-indusert STAT3 fosforylering men også synergizes med erlotinib mot hode og nakke kreft
in vitro Hotell og
in vivo plakater (figur 4 og 5), foreslår vi at erlotinib i kombinasjon med niclosamide har stort potensial til å bli utviklet som en ny og mer effektiv terapeutisk tilnærming for å bedre prognose på hode og hals kreft. Kvanteprikker (QDS) er nanoskala partikler laget av uorganiske halvledere og har nye optiske egenskaper som kan produsere fluorescens utslipp ved ulike bølgelengder avhengig av deres størrelse og sammensetning [38-40]. Den store Stokes-forskyvning av QDS, målt ved avstanden mellom eksitasjons- og emisjonstoppene, kan brukes til å forbedre deteksjonsfølsomhet. Dette er spesielt viktig ved analyse av komplekse biologiske prøver slik som vevsprøver som inneholder en høy auto-fluorescens bakgrunn og flere biomarkører samtidig. I tillegg er det QD-baserte immunohistofluorescence (QD-IHF) signal ikke photobleachable og den signalspekteret er smalere enn de fra organiske fargestoffer, og dermed forbedre spesifisiteten av kvantifisering. QD-baserte analyse bekrefter at inhibering av pEGFR ved erlotinib stimulerer fosforylering av STAT3 i tumorvev, og at niclosamide spesifikt blokkerer erlotinib-indusert fosforylering STAT3 uten å påvirke pEGFR (figur 7). Disse QD-IHF data ikke bare gi ytterligere bevis for at erlotinib aktiverer STAT3, men også avdekke den molekylære mekanismen som niclosamide og erlotinib synergi undertrykke hode og nakke kreft
in vivo
.
I sammendraget, dagens studier har vist at hemming av EGFR av erlotinib stimulerer fosforylering og aktivering av STAT3 fører til økte nivåer av BCL2 og BCL-XL, som kan redusere effekten av erlotinib mot hode og nakke kreft. Erlotinib-indusert aktivering av STAT3 kan skje gjennom undertrykkelse av sin fysiologisk fosfatase PTPMeg2. Kombinert hemming av EGFR og STAT3 hjelp erlotinib og niclosamide synergi undertrykker hode og nakke kreft
in vitro Hotell og
in vivo
, som kan representere en ny og effektiv terapeutisk strategi for å bedre prognosen for pasienter med hode og halskreft.
takk
Vi takker Anthea Hammond for profesjonell redigering av manuskriptet.
