Abstract
Regulering av genuttrykk er en av flere roller foreslått for stress-indusert nucleotide diadenosine -tetrafosfat (Ap
4A). Vi har undersøkt dette direkte gjennom en sammenlignende RNA-Seq analyse av KBM-7 kronisk myelogen leukemi celler og KBM-7 celler der
NUDT2
Ap
4A hydrolase genet hadde blitt forstyrret (NuKO celler), forårsaker en 175 ganger økning i intracellulær Ap
4A. 6,288 differensielt uttrykte gener ble identifisert med
P
0,05. Av disse 980 var oppregulert og 705 nedregulert i NuKO celler med en fold-endring ≥ 2. Oppfinnsomhet
® Pathway Analysis (IPA
®) ble brukt for å tildele disse genene til kjente kanoniske trasé og funksjonell nettverk. Pathways assosiert med interferon svar, mønstergjenkjenning reseptorer og betennelse scoret høyt i nedregulert sett av gener, mens funksjoner knyttet til MHC klasse II antigener var fremtredende blant oppregulert gener, som ellers viste liten organisasjon i større funksjonelle genene bestemmer. Tryptofan katabolisme ble også sterkt nedregulert som var mange gener som er kjent å være involvert i tumorvekst i andre systemer, med roller i epitel-mesenkymale overgang, proliferasjon, invasjon og metastase. Omvendt, noen pro-apoptotiske gener ble oppregulert. Store oppstrøms faktorer spådd av IPA
® for genet nedregule inkludert NFkB, STAT1 /2, IRF3 /4 og SP1 men ingen store faktorene som styrer genet oppregulering ble identifisert. Potensielle mekanismer for genregulering mediert av Ap
4A og /eller
NUDT2
avbrudd inkluderer binding av Ap
4A til Hint1 co-repressor, autokrint aktivering av purinoceptors av Ap
4A, kromatin ombygging, effekter av NUDT2 tap på karakterutskriften stabilitet, og hemming av ATP-avhengige regulatoriske faktorer som proteinkinaser av Ap
4A. Eksisterende bevis favoriserer den siste av disse som den mest sannsynlige mekanismen. Uansett Våre resultater tyder på at NUDT2 proteinet kan være en ny cancer kjemoterapeutisk mål med en hemming potensielt utøver sterke anti-tumoreffekter via flere veier som involverer metastase, invasjon, immunsuppresjon og apoptose
relasjon:. Marriott AS, Vasieva O, Fang Y, Copeland NA, McLennan AG, Jones NJ (2016)
NUDT2
Forstyrrelse Hever Diadenosine -tetrafosfat (Ap
4A) og nedregulerer immunrespons og kreft Promotion gener. PLoS ONE 11 (5): e0154674. doi: 10,1371 /journal.pone.0154674
Redaktør: Francisco J. Esteban, Universitetet i Jaen, Spania
mottatt: 9 desember 2015; Godkjent: 18 april 2016; Publisert: 04.05.2016
Copyright: © 2016 Marriott et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant analyserte data er i avisen og dens saksdokumenter filer. I tillegg har alle datafiler er tilgjengelig fra ArrayExpress databasen (tiltredelse antall E-mtab-4104)
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av North West Cancer Research (https://www.nwcr.org) gi tall CR968 til generalforsamlingen, NJJ og NAC; CR891 til NAC; og NWCR stipendiatstilling antall BR879 til NAC (www.nwcr.org). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Nudix hydrolaser regulere nivåene av et bredt utvalg av kanoniske og modifiserte nukleotider og noen ikke-nukleotid-fosforylerte substrater, så vel som å delta i viktige prosesser slik som mRNA decapping [1, 2]. En av de mest studerte er pattedyr NUDT2. Dette enzymet har blitt isolert fra mange kilder [3, 4] og dens viktigste underlaget er antatt å være diadenosine 5 «, 5′ » –
P
1,
P
4–tetrafosfat (Ap
4A). I dyreceller, Ap
4A kan syntetiseres av de fleste aminoacyl-tRNA syntetaser, ligaser DNA, ildflueluciferase og acyl-CoA syntetaser mens ytterligere rekke enzymer er i stand til å gjøre det i planter, sopp og bakterier [5-7 ]. Syntese vanligvis innebærer overføring av AMP fra en acyl-AMP eller enzym-AMP reaksjon middels til en ATP akseptor. Det kan også bli degradert ved et utall enzymer i tillegg til NUDT2, inkludert FHIT [8], aprataxin [9] og ikke-spesifikke fosfodiesteraser [3]. Imidlertid er NUDT2 antas å være hovedsakelig ansvarlig for å opprettholde det lave nivå av intracellulær Ap
4A [10-12].
En økning i Ap
4A som følge av aktivering av syntese, inhibering av nedbrytning eller begge deler har blitt implisert i flere intracellulære prosesser. Gentoksiske, termiske og andre påkjenninger føre til økt Ap
4A [13-17] og så Ap
4A har vært innblandet i regulering av DNA-replikasjon etter DNA-skade og i å fremme apoptose [17-19]. Ap
4A kan også heves i respons til eksterne ligander og fungere som en intracellulær andre budbringer [20-22]. Den virker også som et ekstracellulært budbringer gjennom dets interaksjon med et antall av P2-type reseptorer [23]. Ap
4A er også en ligand for et antall proteiner, inkludert en multiprotein kompleks inneholdende DNA-polymerase-α [24, 25], proteinkinaser [26-28], glykosylase uracil-DNA [29], protein anstand [30] den Hint1 tumor suppressor [31], 5′-nukleotidase II [32], CBS domeneproteiner [33, 34] og CFIm25 [35], men i de fleste tilfeller er betydningen av denne binding ikke klart. Av særlig interesse, er imidlertid muligheten for at Ap
4A kan virke som en transkripsjonen regulator. Det har blitt foreslått at et øket nivå av Ap
4A indusert i mastceller av eksterne faktorer aktiverer ekspresjon av et delsett av gener som styres av MITF og USF2 transkripsjonsfaktorer ved å binde seg til og å forskyve den inhiberende Hint1 proteinet fra disse faktorene [ ,,,0],10, 31, 36].
for å avgjøre om transkripsjonsregulering av Ap
4A er begrenset til relativt få gener eller er mer utbredt, har vi analysert transkriptomet av en knockout derivat av KBM- 7 kronisk myelogen leukemi (KML) cellelinje [37] der den intracellulære nivået av Ap
4A er økt 175 ganger ved avbrudd av
NUDT2
genet (KBM-7-NuKO, referert til heretter som NuKO). Disse cellene viser store forandringer i gen-ekspresjon i forhold til den overordnede KBM-7-cellelinjen med et total på 6288 signifikant differensielt uttrykte gener (degs) identifisert. Oppfinnsomhet
® Pathway Analysis ble brukt til å markere genet nettverk og metabolske og signalveier som berøres, avslører nedregulering av interferon, inflammatoriske og medfødte immunresponser og oppregulering av prosesser som involverer MHC klasse II antigener. I tillegg er mange av de sterkest berørt gener har roller i å fremme kreft metastase og invasjon, noe som tyder på at NUDT2 kan tilby en roman, pleiotropisk mål for kreft kjemoterapi.
Materialer og metoder
Cells
KBM-7 henvisning klone B (varenr. P00174E07) og KBM-7-NuKO derivat (P01289H04) der
NUDT2
genet har blitt inaktivert av retrovirale gen-felle innsetting [ ,,,0],38] ble oppnådd fra Haplogen og holdt ved 37 ° C i 5% (v /v) CO
2 /luft i Isocoves modifiserte Eagle medium (IMEM, Sigma) supplementert med 10% (v /v) føtalt bovint serum ( Sigma), 2 mM L-glutamin (Sigma) og 100 mikrogram ml
-1 penicillin-streptomycin (Sigma).
Måling av Ap
4A og derivater
nivået av intracellulær Ap
4A i log fase KBM-7 og NuKO celler ble bestemt som tidligere beskrevet ved hjelp av en følsom luminometric analysen med små modifikasjoner for bruk med suspensjonsceller [17, 39]. Celler ble høstet fra suspensjonen ved sentrifugering ved 500
g
i 5 minutter og brukt til nukleotid ekstraksjon. Ap
4A ble også målt i vekstmediet supernatanten fra disse cellene, som ble filtrert gjennom et 0,2 um Millipore-filter, avproteinisert med 10% TCA, og deretter analysert som ovenfor. ADP-ribosylert derivater av Ap
4A (ADPR-Ap
4A) ble separert ved ione-bytte kromatografi og identifisert og analysert som tidligere beskrevet [17].
vekstinhibering assays
Celler (2 x 10
5) ble utsådd i 25 cm
2 kolber inneholdende 7 ml vekstmedium. Kjemiske midler ble tilsatt som angitt og celler dyrket i 96 timer ved 37 ° C, hvoretter kulturene ble sentrifugert ved 500
g
i 5 minutter, cellene resuspendert i friskt medium og tellet ved bruk av et hemocytometer. Gjennomsnittlig tellinger ble normalisert til celletall av ubehandlet kultur
RNA-Seq analyse. CDNA bibliotek forberedelse og sekvense
Tre uavhengige prøver av total RNA ble preparert fra både KBM-7 og NuKO celler. RNA ekstraksjon ble utført ved hjelp av en Qiagen RNeasy mini kit med QIAshredder, og mengden og kvaliteten bestemmes ved hjelp av en Nanodrop og Agilent Bioanalyzer. For hver av de seks prøver, 10 ug RNA ble DNase-behandlet ved hjelp av en Ambion TURBO DNA
fri
™ kit og deretter renset ved anvendelse av AMPure XP-perler. 2 ug av den DNase-behandlede total RNA ble deretter utsatt for rRNA uttømming ved hjelp av Ribo-Zero gull (human /mus /rotte) kit og renset igjen med Ampure XP-perler. Vellykket uttømming ble vurdert ved hjelp av en qubit fluorometer og Agilent 2100 Bioanalyzer og alle de utarmede RNA ble anvendt for RNA-Seq bibliotek fremstilling ved hjelp av ScriptSeq v2 protokollen. Etter 15 sykluser av forsterkning bibliotekene ble renset ved hjelp Ampure XP perler. Hvert bibliotek ble kvantifisert ved hjelp qubit og størrelsesfordeling vurdert ved hjelp av Agilent 2100 Bioanalyzer. De endelige bibliotekene ble slått sammen i ekvimolare mengder ved hjelp av de qubit og Bioanalyzer data. Mengden og kvaliteten på hvert basseng ble vurdert med Bioanalyzer og ved qPCR bruke KAPA Bibliotek Kvantifisering kit for Illumina plattformer på en Roche LC480II Lys sykler i henhold til produsentens instruksjoner. Malen DNA ble denaturert i henhold til protokollen beskrevet i Illumina CBOT brukerhåndboken og lastet i en konsentrasjon på 21:00. Sekvensering ble utført på ett kjørefelt av en Illumina HiSeq 2000 med versjon 3 kjemi generere 2 × 100 bp paret slutt leser. Kvalitetskontroll ble opprettholdt med en 1% pHix pigg-i.
bioinformatiske analyse av RNA-sekv data
Basecalling og de-multipleksing av indekserte avlesinger for hver prøve bibliotek ble utført ved anvendelse av casava 1,8. 2 (Illumina). Rå fastq filene ble behandlet ved hjelp Cutadapt 1.2.1 [40] med alternativet «-O 3» satt til fjerne adapter sekvenser av tre bp eller mer. Leser ble ytterligere trimmet bruker Sickle 1,200 fjerne lav kvalitet baser og til slutt leser 10 bp ble fjernet. Den TopHat2 aligner versjon 2.0.10 [41] ble brukt til å justere trimmet R1-R2 lese parene for menneske referansen genom montering GRCh38, som inneholder 64,253 gener. Standardparametere ble benyttet med unntagelse for biblioteket type, som ble satt til «fr-secondstrand» for alle prøver som kittet benyttes produserte en andre-tråd bibliotek type (R1 er forventet å kartlegge på 5 «→ 3′ tråd og R2 på 3»-→ 5 «tråd). Leser innrette til referansen i mer enn en posisjon ble kassert og FKPM-verdier (fragmenter pr kilobase-transkript per million leser kartlagt) beregnet. Differensial genekspresjonsanalyser ble gjennomført i R miljø ved hjelp av edger pakken [42]. Telle data ble normalisert over bibliotekene bruker trimmet gjennomsnitt M-verdier (TMM) metoden i EDGER med standard parametere. Tagwise spredningsparametere ble estimert og deretter brukt for log
2FC (log
2 ganger endring) estimering og testing i EDGER bruker Likelihood Ratio (LR test) [43].
P
verdier knyttet log
2FC ble justert for multippel testing med False Discovery Rate (FDR) tilnærming [44]. Betydelige degs ble definert som de med en FDR justert
P
verdi 0,05. Alle originale RNA-Seq data produsert i denne studien har blitt sendt til EMBL-EBI ArrayExpress database under deponeringsnummer E-mtab-4104.
RT-PCR-analyse av utvalgte gener
RNA ekstraksjon ble utført ved hjelp av en Qiagen RNeasy mini kit med QIAshredder og cDNA ble syntetisert ved hjelp av en Bioline Tetro cDNA syntese kit, både i henhold til produsentens instruksjoner. CDNA ble deretter kvantifisert ved PCR ved bruk Maxima SYBR Grønn mester mix (Thermo) og en StepOnePlus ™ Real Time PCR system (Applied Biosystems). Primere ble oppnådd fra Sigma og er oppført i S1 tabell. De 2
-ΔΔCt metoden ble benyttet for å bestemme relative transkripsjonsnivåer ved hjelp av rengjøring GAPDH genet for å normalisere data [45].
Pathway analyse
Gener som viser ≥ 2 ganger opp- eller nedregulering med en FDR justert
P
verdi 0,05 ble analysert ved bruk av QIAGEN Oppfinnsomhet
® Pathway Analysis programvare (IPA
®, QIAGEN, Redwood City, https://www.ingenuity.com) for å tildele dem til ulike funksjonelle nettverk. IPA
® bruker manuelt kuratert Ingenuity® Knowledge Base, som inneholder informasjon fra flere gen og protein uttrykk, samspill og merknads databaser som intakt, BIND og MIPS, samt fra den publiserte litteraturen [46]. Vi har også brukt IPA å identifisere funksjonelt beslektede gener som svarer til bestemte kanoniske trasé som var mest vesentlige for datasettet fra en samling av 200 kuratert metabolske, celle-signalkaskade og sykdomsassosierte veier. Fishers eksakte test av uavhengighet ble brukt til å beregne sannsynligheten for at sammenhengen mellom gener i datasettet og den kanoniske vei kan forklares ved en tilfeldighet alene. Til slutt brukte vi IPA oppstrøms regulator analyse for å identifisere faktorer som kan styre genene og stier markert med nettverksanalyse for å gi testbare hypoteser for genregulering av Ap
4A.
Resultater
nivå av Ap
4A i KBM-7-NuKO celler
den overordnede KBM-7 linje som brukes i denne studien inneholder
BCR-ABL1
genet fusjon og potensielt inaktive mutasjoner i
TP53 Hotell og
NOTCH1
, men mangler de andre vanlige genetiske avvik som finnes i myeloide maligniteter [38]. Det uttrykker de fleste annoterte proteiner fra et bredt utvalg av signalveier, noe som gjør det til en egnet cellelinje for denne studien. Den komplette fravær av NUDT2 protein fra NuKO
NUDT2
disruptant ble bekreftet ved Western blotting (fig 1). Steady-state-konsentrasjon av intracellulært Ap
4A i ubetonte pattedyrceller er typisk i området 0,1-1,0 pmol /10
6-celler (0,05-0,5 pm), den nøyaktige mengde er arts- og celletype-avhengige [17, 47]. Logg fase KBM-7 celler hadde et nivå på 0,21 ± 0,02 (
n
= 3) pmol /10
6 celler. Men NuKO derivatet hadde en 175-fold økt nivå på 36,9 ± 0,3 (
n
= 3) pmol /10
6 celler, som gir den klareste beviset på at Ap
4A er en viktig NUDT2 underlaget
in vivo Hotell og at dette enzymet spiller en viktig rolle i å opprettholde det lave bakgrunnsnivået av Ap
4A. Legg merke til at en Ap
4A innhold på 1 pmol /10
6-celler tilsvarer omtrent en intracellulær konsentrasjon på 0,5 uM hvis ensartet fordelt [17] slik at nivået i NuKO cellene vil være rundt 20 pM. Om hvorvidt dette høye nivået, og de resulterende endringer i cellene som rapporteres her er biologisk relevant, har vi tidligere målt opp til 20 mikrometer Ap
4A i DNA reparasjons-defekte celler behandlet med mitomycin C [17] mens en konsentrasjon så høy som 775 mikrometer har blitt rapportert i FCεR1-aktiverte mastceller [31]. Kromatografisk analyse av Ap
4A fra NuKO celler viste at ca 35% var til stede i form av ADP-ribosylert-derivater (ADPR-Ap
4A), hovedsakelig mono-ADPR-Ap
4A (Fig 1 ). Vi har tidligere vist at ADP-ribosylering av Ap
4A ved PARP1 og PARP2 i kinesisk hamster EM9 celler og mus embryo fibroblaster forekommer som respons på DNA-skade [17]; Men viser det seg at det høye nivået av Ap
4A her er underlagt konstituerende ADP-ribosylering.
En nukleotid utdrag fra NuKO cellene ble utsatt for ionebytterkromatografi og fraksjoner analysert luminometrically for Ap
4A som beskrevet i materialer og metoder. Innfelt: en prøve av rekombinante NUDT2 og proteinekstrakter av KBM-7 og KBM-7 NuKO celler ble underkastet polyakrylamidgel-elektroforese og etterfølgende nitrocelluloseblottene probet for tilstedeværelse av NUDT2 med kanin polyklonalt anti-NUDT2 (Santa Cruz) etterfulgt av deteksjon med HRP-konjugert geit-anti-kanin IgG og ECL visualisering (ECL Select, GE Healthcare). Mouse β-actin ble påvist med HRP-konjugert geit-anti-mus IgG (Santa Cruz).
RNA-Seq og differensial genekspresjonsanalyser
Ap
4A har blitt rapportert å aktivere transkripsjon av delmengder av gener som kontrolleres av transkripsjonsfaktorene MITF og USF2 [31, 36]. I lys av dette, og for å utforske videre fenotype av
NUDT2
knockout celler, gjennomførte vi en komparativ analyse av transcriptomes av KBM-7 og NuKO celler ved RNA-Seq å identifisere degs. Et gjennomsnitt på 46,1 millioner par 100 bp parvise end leser per prøve ble generert at justert til referanse menneskelige genom. Innrettings Resultatene er oppsummert i tabell 1, som viser antallet og prosentandelen av lesninger kartlagt for hver prøve. Kartlegging prosenter for de seks prøvene var mellom 80,2 og 81,3%. 31 177 (48,5%) av de 64,253 referanse gener hadde minst ett lese justert mens 33,076 gener hadde ingen lese justert fra noen av de seks prøvene.
Forskjellen i genuttrykk profiler mellom de to celletypene er illustrert i det Principal Component Analysis (PCA) plotting av log2 gene expression dataene som er vist i figur 2A. De triplikate prøver av hver celletype er gruppert i god avstand fra hverandre, noe som indikerer en høy grad av differensiell genekspresjon mellom dem. Videre heatmap av Pearson-korrelasjonskoeffisienten i figur 2B indikerte at uttrykket profilene for de tre prøver fra den samme celletype var mye mer korrelert enn prøver fra forskjellige celletyper, viser at virkningen av
NUDT2
knockout på genekspresjon var mye sterkere enn påvirkning av eventuelle tekniske eller biologiske forskjeller mellom prøvene. Heatmap viser også en svært høy korrelasjon (R 0,99) blant prøver fra samme celletype. Dermed kan vi konkludere med at differensial genuttrykk oppdaget her er statistisk svært robust.
(A) PCA tomt på log2 genuttrykk data som viser to
nd og 3
rd hovedkomponenter. (B) Heatmap visualisering av Pearson korrelasjonskoeffisienter av log
2 genuttrykk mellom prøvene. De tre prøver fra villtype KBM-7 celler er merket WT1-WT3 og de fra KBM-7-NuKO celler KO1-KO3. (C) MA plott som viser fordelingen av gjennomsnitts genuttrykk nivåer (log
2Counts Per Million kartlagt leser) mot log
2 Fold-Change (KO
vs
WT) for enkelte genet svar. Lave uttrykk gener (log
2CPM -5) er farget oransje. Betydelige forskjellig uttrykte gener (degs) er farget rød; gener som viser ingen endring i uttrykket er farget svart.
Av de 31 177 leser kartlagt (S2 tabell) totalt 6,288 degs ble identifisert med et
P
-verdi (FDR justert ) 0,05, hvorav 2550 ble oppregulert og 2285 nedregulert med en fold-endring ≥ 1,2 (Fig 2C og S3 tabell). MA plottet i figur 2C viser en relativt symmetrisk fordeling av opp- og ned-regulert gener på alle nivåer av uttrykk. Av disse genene, 980 ble oppregulert og 705 nedregulert med en fold-endring ≥ 2. I begge tilfeller 88% hadde FPKM ≥ 0,3 for en eller begge av WT og KO datasett. Den 40 sterkest ned- og opp-regulert kommenterte gener er vist i tabell 2 og 3 henholdsvis. Merk at mange av disse genene hadde null lese teller for enten WT eller KO datasett nødvendig tillegg av en liten null-offset pseudocount av edger programvare for å beregne log
2FC [42].
RNA-Seq analyse ble validert ved å utføre sanntid QRT-PCR på et utvalg av gener som representerer ulike berørte trasé (fig 3). Disse resultatene bekreftet retning av regulering (opp eller ned) for alle gener studert. Størrelsen av forandringen var også tilsvarende for de fleste av gener, med en korrelasjonskoeffisient på 0,83 mellom de to datasettene (figur 3, innfelt). Imidlertid, for noen gener med en nullverdi av FPKM for en av prøvene i RNA-Seq analyse, bruken av pseudocount metode ved Kantskjærer for å beregne en fold-endringen har ført til en betydelig forskjellig verdi, f.eks
GFRA1 Hotell og
TNF
. Likevel er de verdiene som er beregnet av EDGER brukes i følgende diskusjonene som de er tilgjengelige for alle gener og er fortsatt en god relativ indikasjon på endring i uttrykket. For å vise at den observerte differensial genekspresjon korrelerer utelukkende med øket Ap
4A heller enn de beslektede ADPR-Ap
4A-derivater, ble QRT-PCR-analyse også utført med RNA ekstrahert fra NuKO celler dyrket i nærvær av 100 nM KU-0058948, en PARP1 og PARP2 inhibitor som hindrer syntese av ADPR-Ap
4A arter [17]. Resultatene var meget lik de som ble oppnådd i fravær av KU-0058948 (figur 3) viser at for disse genene i det minste, ADPR-Ap
4A er ikke årsaken til dette uttrykket. Funksjonen til ADPR-Ap
4A, om noen, er fortsatt uklart.
QRT-PCR-analyse ble utført på utvalgte RNA fra KBM-7 og NuKO-celler i nærvær og fravær av 100 nM av PARP hemmer KU-0058948 hjelp av primere som er oppført i S1 tabell som beskrevet i materialer og metoder og loggen
2 fold-endring i uttrykket plottet ved siden av de som oppnås ved RNA-Seq analyse. Innfelt: enkel korrelasjon tomt på loggen
2 fold-endringer i uttrykk innhentet av RNA-Seq (
x
-aksen) og QRT-PCR uten PARP inhibitor (
y
-aksen ).
Oppfinnsomhet
® Pathway Analysis
for å plassere genuttrykk data inn i en biologisk sammenheng, Oppfinnsomhet
® Pathway Analysis (IPA
® ) programmet ble brukt til å tilordne degs til kjente kanoniske trasé og funksjonelle nettverk for å forutsi de biologiske funksjonene til transkripsjons endringer. For enkelhets skyld, den første analysen inkluderte bare gener som var opp- eller nedregulert med ≥ 2 ganger (
P
0,05); Men der er til stede i de resulterende trasé og nettverk, gener opp- eller ned-regulert av ≥ 1,2 ble også ansett for å være av potensiell interesse som det ikke er biologisk begrunnelse for en cut-off verdi på 2. Det ble funnet at degs tilordnet et stort antall veier med en betydelig berikelse poengsum (-log (
P
-verdi)) (S4 tabell). Topp rangert innenfor både opp- og ned-regulert gensettene signalveier knyttet til immunitet og betennelse. Trasé forbundet primært med den medfødte immunrespons, slik som aktivering av interferon-regulerende faktorer (IRFs) av mønstergjenkjenning reseptorer (PRRS), og betennelse ble spesielt anriket på nedregulert sett av gener mens funksjoner knyttet til MHC klasse II-antigener var spesifikke for settet av opp-regulerte gener (tabell 4). Overvekt av disse banene i datasettet kan gjenspeile myelogen natur KBM-7 cellelinje [37]. Disse banene er omtalt i detalj nedenfor.
Interferon respons og medfødt immunitet.
Interferoner er viktige formidlere av det medfødte immunforsvaret, noe som gir en innledende viktig forsvar mot invaderende patogener (virus , bakterier, protozoer) etter samspill av patogen komponenter med PRRS i ulike cellulære avdelinger. De kan også inhibere celleproliferasjon, modulere den adaptive immunrespons, og være pro- eller anti-inflammatorisk, avhengig av sammenhengen [48-51]. Underkastelse av settet av 4,835 degs med gangers endring ≥ 1,2 til Interferome databasen (v2.01) [52] avslørte en undergruppe av minst 1,038 degs som er kjent for å bli regulert av type I IFN (IFNα og IFNβ) i andre systemer. Omtrent halvparten av disse overlappet med det sett av 944 viser kjent regulering av Type II IFN (IFNy). Noen (56) også viste Type III (IFNλ) regulering med 15 av disse potensielt unike til Type III (S5 tabell).
Figur 4 viser IPA
® kanoniske pathway for aktivering av interferon reseptorer (IFNRs ) av type i og type II-interferoner, med eksempler på gener funnet å bli uttrykt forskjellig i denne studien uthevet. De fleste av funksjonene i denne veien ble nedregulert, med uttrykk av
IFNb
blir sterkest berørt (15-fold, S3 tabell). De JAK-STAT signalveier er sentrale for interferon respons. I Type II-interferon signalering, aktiverte STAT1 homodimerer binde til GAS (Interferon gamma Aktivert Sequence) promoter og indusere genekspresjon mens Type I-signalering innebærer en kombinasjon av STAT1-STAT2 heterodimerer med IRF9 (Interferon Response Factor 9) danner ISGF3 (Interferon stimulert Gene faktor), som deretter bindes til SBR (interferon-stimulerte responselement) promoter.
STAT1
,
STAT2 Hotell og
IRF9
var nedregulert (1,4, 1.8- og 3.7 ganger henholdsvis), mens veien dempere
SOCS1
og
PTPN2
ble oppregulert (1,2-1,4 ganger). Selv individuelt liten, kan den kombinerte effekten av disse endringene likevel være betydelig. Økningen i
SOCS1 Hotell og
PTPN2
også viser at det er ikke bare en generell undertrykkelse av genekspresjon men at negative tilbakemeldinger via disse genene er bevart. Endelig flere av STAT-kontrollerte gener som er nedregulert i seg selv er aktivatorer av ytterligere IFN-responsgener, f.eks
IRF1
,
IRF7 Hotell og
IRF9 plakater (1.2-, 3.8- og 3.7 ganger henholdsvis).
nedregulert gener er i grønt, oppregulert gener i rødt. Fargeintensitet svarer til folden endring; dristige grenser markere gener med 2 ganger endring i uttrykket. Lines tilsvarer fysiske interaksjoner og piler til funksjonelle relasjoner mellom proteiner. Heltrukne linjer og piler innebærer direkte relasjoner og stiplede linjer og piler innebærer indirekte relasjoner. Funksjonelle relasjoner inkluderer posttranslasjonelle modifikasjoner, transkripsjon regulering, proteolyse eller co-uttrykk. Flat pilspisser indikerer hemming.
Den kanoniske sti i figur 5 fremhever rollene til de tre RIG-en-lignende helicase PRRS i det medfødte immunrespons, RIG-en (DDX58), MDA5 (IFIH1) og LGP2 (DHX58) i aktivering av
IFNb
etter stimulering av virus-dobbel-strandet RNA og tilbakemeldingene fra IFNβ på uttrykk for disse PRRS. Alle tre reseptorgenene er nedregulert (3.1-, 2.3- og 3.0 ganger henholdsvis) (S3 Table) i NuKO celler. I tillegg
IFITM2 Hotell og
IFITM3
, hvis produkter begrense oppføring av mange virus [53], og alle fire antivirale iFit familiemedlemmer som binder virale komponenter (
IFIT1
2
,
3 Hotell og
5
) [54] er nedregulert mellom 1,6- og 6,8-fold. Andre nedregulert anti-virusgener har
PKR
,
GBP1 Hotell og
TLR10 product: [55-58] (S3 tabell).
Forklaring av symboler som i figur 4.
cytokin signalering, betennelser og NF-kB.
interleukin-1 (IL-1) signale er flagget av IPA
® som en topp nedregulert pathway (tabell 4) med redusert ekspresjon av viktige proinflammatoriske medlemmer av IL-1-superfamilien [59]. For eksempel er mRNA for IL-1β, dens reseptor IL-1R1 og tilbehør protein IL-1RAP er redusert 1,5-, 11.7- og 1,2 ganger henholdsvis, mens IL-18, IL-18R1 og IL-18RAP er nede 2.3-, 3.0- og 4.0 ganger hhv. Uttrykk for pro-inflammatorisk
IL32
er også redusert fem ganger, mens uttrykket av tumornekrosefaktor (
TNF
eller
TNFa
), som kan aktivere både Type I IFN og den inflammatoriske mediator NF-kB, blir nedregulert 30 ganger (S3 tabell). Den kanoniske vei som fører til transkripsjonen aktivering av NF-kB gjennom IL-1, TNFa og andre ligander er vist i figur 6. NF-kB-komplekset er en viktig formidler av inflammatoriske og immunresponser og svarer til PRRS og pro-inflammatoriske cytokiner [ ,,,0],60]. Det kan virke synergistisk med STAT signalering med økt induksjon av målgener som følge av koordinere binding av statistikk og NF-kB til gass og NF-kB arrangører. P50 og P52 komponenter av NF-kB kompleks og
relB
transaktivatorprotein er alle nedregulert som er mange komponenter i signalveier som fører til NF-kB aktivering.
det er kjent at type i-IFN og TNF kan gjensidig undertrykke hverandres uttrykk, og det har blitt foreslått at endringer i kryss regulering av disse banene kan påvirke balansen mellom de potensielle destruktive og beskyttende rolle av disse cytokinene i patogenesen av autoimmun inflammatoriske sykdommer, så som systemisk lupus erythematosus (SLE) og reumatoid artritt (RA) [61]. IPA
® identifiserer signalering i RA som en topprangerte berørte kanoniske pathway (tabell 4) og listen over degs forbundet med RA og SLE er vist i S6 tabell. Selv om beskjedne endringer i uttrykk i enkelte andre cytokinreseptorer kan potensielt være pro-inflammatorisk (f.eks
IL10RA Hotell og
IL23R
), er det generelle bildet en av undertrykkelse av betennelse ved forhøyet Ap
4A, med nedregulering av NF-kB signale med sterkt.
oppregulert kanoniske stier og MHC klasse II antigener.
KBM-7 celler kan betraktes som umodne forstadier til profesjonelle antigenpresenterende celler som makrofager og dendrittiske celler og nesten alle av de 20 oppregulert kanoniske trasé flagges ved IPA
® involvere funksjoner knyttet til den adaptive immunresponsen, inkludert antigen presentasjon, OX40 signalering, allotransplantatavvisning og B-celle utviklingen (tabell 4 og tabell S4). Det bør imidlertid understrekes at dette er i stor grad fordi disse banene alle involverer en av de mest fremtredende oppregulert gensettene, den induserbare MHC klasse II antigener (MHC-II). MHC-II-molekyler er hovedsakelig opptatt med presentasjon av antigener som stammer fra ekstracellulære patogener som resulterer i CD4 + T-hjelpercelle priming og produksjon av antistoffer av B-celler [62]. Nesten alle klasse II-undertypegener viser en betydelig økning i ekspresjon, med noe som viser en stor økning, f.eks
HLA-DOA
47 ganger og
HLA-DPA1
12-fold. Således, i hvilken grad disse kanoniske trasé kan betraktes som opp-regulert som en helhet er åpent spørsmål.
Likevel, i tillegg til MHC-II, et antall andre gener som er involvert i å fremme sider av *
P
0,05, **
P
