Abstract
mirnas er foreslått å være viktige regulatorer av progresjon og metastasering i kreft. Imidlertid er en forståelse av sine roller og molekylære mekanismer som trengs for å gi dypere innsikt for bedre terapeutiske muligheter. I denne studien undersøkte vi rolle og mekanismen av MIR-493 i utvikling og progresjon av nonsmall-celle lungekreft (NSCLC). Våre data indikerer at uttrykket av MIR-493 ble kraftig redusert i lunge carcinoma. Ektopisk uttrykk for MIR-493 nedsatt cellevekst og invasjon in vitro og in vivo. Mekanisk, MIR-493 som vanligvis direkte rettet E2F1, noe som resulterte i en sterk reduksjon av ekspresjonen av mRNA og protein. Denne effekten, i sin tur, redusert vekst, invasjon og metastasering av lungekreftceller. Våre funn markere betydningen av MIR-493 dysfunksjon i å fremme tumorprogresjon, og implisere MIR-493 som en potensiell terapeutisk mål i lungekreft
Citation. Gu Y, Cheng Y, Song Y, Zhang Z, Deng M, Wang C, et al. (2014) mikroRNA-493 Undertrykker tumorvekst, invasjon og metastasering av lungekreft ved å regulere E2F1. PLoS ONE 9 (8): e102602. doi: 10,1371 /journal.pone.0102602
Redaktør: Rana Pratap Singh, Jawaharlal Nehru University, India
mottatt: 28 mars 2014; Godkjent: 19 juni 2014; Publisert: 08.08.2014
Copyright: © 2014 Gu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Studien ble finansiert med tilskudd fra Kina Postdoktor Science Foundation (Prosjekt Kode: 2012M521588), https://jj.chinapostdoctor.org .cn /V1 /program1 /default.aspx. Den Funder hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft er den mest utbredte histologisk kreft subtype hele verden [1]. Fordi de fleste pasienter til stede med invasiv, metastatisk sykdom [2], forstå grunnlaget for lungekreft progresjon er avgjørende. Mange faktorer, blant annet kreftdempere og onkogener, er involvert i lunge tumorigenesis eller progresjon. [3], [4]. Nylig har de klassiske medlemmene av protein-kodende gener blitt utvidet til å omfatte en type ikke-protein-kodende RNA-molekyl kjent som mikroRNA (miRNA) [5], [6], [7]. mirnas er 19-24 nukleotider i lengde, og de regulerer genekspresjon via ufullkomne baseparring med komplementære sekvenser lokalisert hovedsakelig, men ikke utelukkende, i den 3 «ikke-translaterte regioner (UTR) av mål-mRNA. Derfor mirnas representerer en av de viktigste regulatoriske familier av gener i eukaryote celler, og de fungerer ved å indusere translasjonell undertrykkelse og karakterutskrift degradering [8], [9]. Raskt voksende bevis tyder på at mirnas spille viktige roller i tumorigenesis og progresjon [10], [11], [12]. For eksempel, MIR-34 hindrer velig kreft initiering og progresjon i lunge adenokarsinom [13]. miRNA-218, en ny regulator av HMGB1, velig undertrykker celle migrasjon og invasjon i ikke-småcellet lungekreft [14]. Likevel er ytterligere kunnskap om de molekylære mekanismene for miRNA nødvendig for å gi dypere innsikt for å utvikle bedre terapeutiske muligheter for pasienter med lungekreft.
I vår siste undersøkelse (Chen, et al. Upublisert paper), brukte vi en miRNA microarray for å finne at Mir-493 uttrykk ble kraftig redusert i 95D celler, en svært metastatisk lungekreft cellelinje, sammenlignet med HBE, en udødeliggjort human bronkial epitel cellelinje. Dermed hypotese vi at MIR-493 kan spille en viktig rolle i lungekreft tumorigenesis og progresjon.
For å teste denne hypotesen, undersøkte vi uttrykket av MIR-493 bruker QRT-PCR i seks lunge kreft cellelinjer og 65 lungekreft vevsprøver i denne studien. Dataene viste at ekspresjonen av MIR-493 ble markert redusert i lungecancerceller og vev. Funksjonelt in vitro og in vivo-analyser indikerte at MIR-493 hemmet lungecancer celleproliferasjon, invasjon og metastase ved direkte rettet mot det 3′-UTR av E2F1 for å frembringe en spesifikk og robust knockdown av proteinet. Våre funn markere betydningen av MIR-493 dysfunksjon fremme tumorprogresjon og tumorigenesis; og implisere MIR-493 som en potensiell terapeutisk mål i lungekreft.
Resultater
MIR-493 er nedregulert i lungekreft og negativt forbundet med overlevelse
For å identifisere feilregulering av miRNA-493 i lungekreft, undersøkte vi uttrykket av MIR-493 ved hjelp av real-time PCR i seks cellelinjer avledet fra lungekreft og en lunge fibroblast linje (MRC5); samt en immortalisert human bronkial epitelcelle (HBE). Dataene indikerte at MIR-493-ekspresjon ble betydelig redusert hos lungekreftceller, spesielt i 95D, et høyt metastatisk lungecancer cellelinje (figur 1A). Videre har vi sammenlignet miRNA-493 uttrykk nivåer i 65 friske lungekreft vev ved real-time PCR. Tilsvarende uttrykk for MIR-493 var betydelig lavere i lungekreft vev enn i tilsvarende normal lunge vev (figur 1B). For å avgjøre om nedregulering av MIR-493 påvirker lungekreft fenotyper eller kliniske patologiske funksjoner, vi ansatt en korrelasjonsanalyse og fant at Mir-493 uttrykk nivået ble omvendt korrelert med metastase (p = 0,038), men ikke andre patologiske parametere som klinisk stadium (tabell 1). I tillegg ble en Kaplan-Meier overlevelsesanalyse utført ved bruk av pasient total overlevelse (OS, figur 1C) og sykdomsfri overlevelse (DFS, figur 1D) for å analysere betydningen av MIR-493 videre i form av klinisk prognose. Resultatene viste at pasienter med lav MIR-493 uttrykk hadde en kortere gjennomsnitts OS og DFS enn pasienter med høy MIR-493 uttrykk (p = 0,006 for OS, P = 0,000 for DFS, figur 1C og D). Disse dataene antyder at nedregulering av MIR-493 bidrar til lungekreft kreftutvikling og prognose.
(A) De relative uttrykk nivåer av MIR-493 i seks cellelinjer avledet fra lungekreft og en lunge fibroblast linje (MRC5 ), samt en immortalisert human bronkial epitelcelle (HBE) ble bestemt ved QRT-PCR. Dataene er presentert som gjennomsnitt ± SEM fra minst 3 separate eksperimenter * p. 0,05, ** p 0,01. (B) Mir-493 uttrykk nivåer i 65 paret menneskelige NSLCC og tilsvarende normale vev ble undersøkt ved real-time PCR, bruker GAPDH som en intern kontroll. Uttrykket verdi (ΔCt (N) – ΔCt (T)) representerer differansen av de MIR-493 nivåer mellom normalt vev og tumor. En uttrykk verdi 1 indikerer at MIR-493 nivåer er økt i svulster. En uttrykk verdi 1 indikerer at MIR-493 nivåer er redusert i svulster. En paret t-test (univariate) ble anvendt for å sammenligne forskjellen mellom normalgruppen og kreft gruppe. (C) Lave nivåer av MIR-493 korrelerer med kortere overlevelse. OS og DFS kurver for alle undersøkte pasienter med høy eller lowmiR-493 uttrykk.
Overuttrykte MIR-493 hemmer celledeling og invasjon
For å vurdere biologiske effekter av overekspresjon MIR-493 i lungekreftceller, stabile ektopiske overekspresjon celle undergrupper 95D /MIR-493 og H1975 /MIR-493 og deres parede kontrollceller ble bygget. En QRT-PCR-analyse viste at transfeksjon var vellykket (figur 2A). Vi fastslått at overekspresjon av MIR-493 i 95D og H1975 celler markert svekket celleproliferasjon sammenlignet med kontrollene ved hjelp av en celle vekst analysen (figur 2B), cellesyklus distribusjon (figur 2C) og en koloni formasjon analysen (figur 2D) . I tillegg, testet vi om MIR-493 kan spille en rolle i tumorvekst ved anvendelse av hårløse mus xenograft-modeller (seks mus pr gruppe). 95D celler transfektert enten med MIR-493 eller et egge kontroll ble transplantert inn i hårløse mus og utviklet seg til solide tumorer i 25 dager. Men tumorvekst ble betydelig redusert når MIR-493 ble stabilt uttrykt i 95D celler (figur 2 E). Disse resultatene antydet at MIR-493 kan sterkt undertrykke tumorcellevekst.
En stabil ektopisk overekspresjon av MIR-493 ble generert i celle undergrupper 95D /MIR-493 og H1975 /MIR-493. QRT-PCR ble brukt til å kontrollere transfeksjon. ** Betyr P 0,001 (t-test). B, vekstkurvene demonstrerte at lungeceller var i stand til proliferasjon. Celler ble sådd ut i 12-brønners plater ved de ønskede cellekonsentrasjoner og opprettholdt i medium inneholdende 10% FBS. Absorpsjonen Verdien av cellene ble målt ved de angitte tidspunkter i triplikat og deres vekstrater ble registrert. * Betyr P 0,05 (t-test). C, The cellesyklus distribusjon av lungekreft celler ble analysert med en FACScan strømningscytometer. Utbredelsen indeks (PI) ble anvendt for å beskrive potensialet av celleproliferasjon. PI = G2 + S fraksjon) /(G1 + G2 + S) x 100%. Venstre, representant bilde av cellesyklus prosent endring. Til høyre, den statistiske analysen av cellesyklus prosentandel, blir data presentert som gjennomsnitt ± SEM fra 3 uavhengige eksperimenter * betyr P 0,05 (t-test). D, kolonidannelse analyser ble benyttet for å bestemme virkningen av MIR-493 på langsiktig celleoverlevelse. Venstre, det området som er dekket på hver plate av koloniene ble målt ved bruk av et avbildningssystem og representert som en prosentandel av det totale areal av platen. Rett, effekten av MIR-493 overekspresjon på kolonidannelse av lungekreftceller: hver kolonne representerer en middelverdi av tredoble eksperimenter i hver gruppe. Dataene er gjennomsnitt ± SEM. * Betyr P 0,05 (t-test). E, MIR-493 hemmet pulmonal tumorvekst i mus xenograft modeller (12 dyr). Venstre, representative tumorer isolert fra mus 25 dager etter subkutan injeksjon av 95D-celler som var stabilt transfektert med MIR-493-uttrykkende eller kontrollvektor. Høyre Data er gjennomsnitt ± SEM. * P. 0,05, (t-test)
I tillegg til hemming av cellevekst, ble effekten av MIR-493 på tumorinvasjon og metastase også adressert i denne studien. En sårhelende analysen viste at MIR-493 kan dramatisk undertrykke svulst celle mobilitet i 95D celler sammenlignet med de tomme vektor-transfekterte celler (figur 3A). Videre er en invasjon analyse ble også utført. Resultatet viste at MIR-493 kan undertrykke invasiv evne til lungekreft celler (figur 3B). En eksperimentell dyremodell ble benyttet til å undersøke den undertrykkende effekt av MIR-493 på tumormetastase, ble 95D /MIR-493 celler injisert i halevenene av hårløse mus (fem mus per gruppe). Tomme vektor-transfiserte (95D /kontroll) celler ble anvendt som kontroller. Musene ble drept og lungene ble skåret ut, og den metastatiske lesjoner av lungen ble deretter påvist ved anvendelse av et Bruker Small Animal Imaging System (Tyskland) etter 28 dager. Felt av metastatiske lesjoner dannelse i lungene ble betydelig redusert sammenlignet med kontrollgruppen (figur 3C). Selv om det synlige metastatiske noduler ikke ble observert på overflaten av lungene ble det metastatiske lesjoner funnet i lungene ved hematoksylin og eosin-farging (figur 4D). Disse resultatene indikerte at MIR-493 kan effektivt undertrykke tumormetastaser in vitro og in vivo.
A, skrape sår analyser ble utført på 95D-celler transfektert med MIR-493 og dens sammenkoblet kontroll. Resultatene fra 3 separate analyser ble i gjennomsnitt sammen og grafisk. *, P 0,05 (til venstre). Representative bilder av analysene er vist. Original forstørrelse: × 200 (til høyre). B ble invasive egenskapene til H1975 og 95D celler analysert med en Transwell-analyse ved hjelp av en Matrigel belagt kammeret. Migrerte celler ble plottet som det gjennomsnittlige antall celler pr synsfelt fra 3 forskjellige forsøk, som beskrevet i avsnittet Materialer og metoder. * P 0,01 (til venstre). Representative bilder av analysene er vist. Original forstørrelse: × 200 (til høyre). C, in vivo metastase analyser ble anvendt for å undersøke den lunge metastatisk evne til 95D /mir-493 celler merket med grønt fluorescerende protein (GFP) og dens sammenkoblet kontrollcelle 95D /kontroll. Lungecancerceller ble injisert inn i halevenene på fem week- gamle mus. På dag 28 ble alle dyrene avlivet og lungene ble skåret ut. Lunge metastase bildene ble oppnådd med en Bruker Small Animal Imaging System. Lungevevet ble så fjernet, fiksert, parafin-innleiret, i serie seksjonert og utsatt for hematoksylin og eosin (H 0,05 versus krafse. D og E, MIR-493 stabil transfeksjon reduserer E2F1 protein og mRNA nivåer. F og G, Nivået på MIR-493 inverst korrelert med E2F1 uttrykk. F, The E2F1 ekspresjonsnivåer ble målt ved hjelp av immunhistokjemi i tumorvev. Disse parafininnstøpte vev prøver var den samme kilde for 65fresh lungekreft vevet tidligere nevnte i figur 1. Et representativt bilde av uttrykket nivåer av E2F1 i humane lungetumorvevet (200 x) er vist. G, data er midler ± standardavvik * Betyr P. 0,05
MIR-493 direkte rettet mot og hemmer E2F1
Basert på observasjonen at MIR-493 påvirker celleproliferasjon, invasjon og metastasering, vi søkte på målgener av MIR-493 knyttet til bevegelighet og migrasjon ved hjelp av to mål skanning algoritme (TargetScan og microRNA.org). Et stort antall forskjellige målgener ble forutsagt. Blant disse kandidat målgener ble E2F1 valgt for videre eksperimentell validering, ikke bare fordi det ble identifisert som mål for MIR-493 ved begge databasene (figur 4A), men også på grunn av sin hyppige deregulering i tumorvev [15], [16 ], [17]. En dual-luciferase reporter-analyse viste at ko-ekspresjon av MIR-493 signifikant hemmet aktiviteten av ildflueluciferase som bæres vill-type, men ikke mutant 3′-UTR av E2F1 (figur 4B, C) i 95d og H1975-celler, noe som indikerer at MIR-493 kan undertrykke genekspresjon via sin bindende sekvens på 3′-UTR av E2F1. Videre, innføring av MIR-493 redusert ekspresjon av cellulære E2F1 mRNA og protein (figur 4D, E). Men når inhibering av oligonukleotider mot MIR-493 ble transfektert inn i lungekreftceller 95D eller H1975, en invers uttrykk mønster ble ikke observert mellom MIR-493 og E2F1 protein (data ikke vist). Det antas at denne miRNA behandling bidratt til den minimale endogene ekspresjon i begge lungekreftceller. Videre er det fenomenet ble ytterligere bekreftet ved en invers korrelasjon mellom nivået av E2F1 protein, indikert ved immunhistokjemi farging, og nivået av MIR-493 ekspresjon bestemt ved Q-PCR i de friske lungekreft vev som brukes i de ovenfor nevnte analysene (figur 4F , G og figur 1B).
E2F1 bidrar til effekten av undertrykke spredning og invasjon indusert av MIR-493
i tillegg, bygget vi siRNA fragmenter rettet mot E2F1 å slå ned uttrykket av E2F1 å undersøke bidraget fra E2F1 til effekten av MIR-493 på følgende fenotyper. Vi fant at den knockdown E2F1 kan delvis simulering cellevekst (figur 5 B) og celle invasjon (figur 5C og D) fenotype indusert ved overekspresjon av MIR-493. Deretter ble redningsforsøk utført ved overekspresjon den E2F1-Δ3′- UTR vektor (uten en endogen 3’UTR) i celle uttrykker Mir-493. Mir-493 indusert nedregulering av E2F1 ble reddet ved innføringen av E2F1. Videre er overekspresjon av E2F1 attenuert hemming av cellevekst (figur 5A) og invasjon (figur 5C og E) forårsaket av MIR-493. Disse observasjonene tyder på at Mir-493 mål spesifikt E2F1 spesifisitet for å bidra til effekten av på cellevekst og invasjon.
A, The knock-down av E2F1 delvis simulert kreftceller veksthemming lunge indusert av overekspresjon av MIR-493 i 95D og H1975 celler. Vekstkurvene demonstrerte evnen til lungeceller proliferasjon. Absorpsjonen Verdien av cellene ble målt ved de angitte tidspunkter i triplikat og deres vekstrater ble registrert. B, Overuttrykte eksogene E2F1 (uten 3′-UTR av E2F1) reddet ved spredning undertrykkelse indusert av MIR-493 i 95D og H1975 celler. C, T De invasive egenskapene til H1975 og 95D celler som enten var knock-down eller overekspresjon av E2F1were analysert med en transwell analyse ved hjelp av en Matrigel belagt kammeret. De migrerte celler ble plottet som det gjennomsnittlige antall celler pr synsfelt fra 3 forskjellige forsøk, som beskrevet i avsnittet Materialer og metoder. Dataene er gjennomsnitt ± SD * betyr p. 0,05. D og E, er representative bilder av analysene er vist. Original forstørrelse. × 200
E2F1 forskrifter ERK og PI3K-AKT sti i 95D og H1975 celler
E2F1 spiller en avgjørende rolle i celle-syklus progresjon, som igjen fremmer celler spredning og metastasering. Men den presise mekanismen for E2F1 funksjon er komplisert og er avhengig av cellulær sammenheng [18]. En ny studie viste at E2F1 avhengig tumorprogresjon ble utløst ved aktivering av de cytoplasmiske Ras /Raf signaleringskaskader, slik som PI3K-AKT [16] og MEK-ERK trasé [19], hvorav de fleste regulerer celleproliferering, overlevelse og invasjon [20], [21]. Dermed har vi undersøkt t om MIR-493 regulerer disse banene ved å målrette E2F1. Den oppregulering av MIR-493, via transfeksjon av MIR-493, i 95D og H1975 cellene redusert fosforylering nivåer av AKT og dens nedstrøms mål GSK3p (figur 6A). Tilsvarende MIR-493 også undertrykte nivåer av fosforylert ERK (figur 6A). Vi observerte også at knockdown av MIR-493 via transfeksjon med anti-MIR-493 i HBE, A549 og H1299 celler, hvor den relative uttrykket nivået av MIR-493 var høyere, økte nivåer av fosforylert AKT, GSK3b og ERK ( figur 6B). Disse vestlige blotting Resultatene viste at MIR-493 er negativ regulator av AKT og ERK veier. Deretter ble redningsforsøk utført ved overekspresjon den E2F1-Δ3′- UTR vektor (uten en endogen 3′-UTR) i MIR-493-behandlede celler. MIR-493-indusert nedregulering av E2F1 ble reddet ved innføringen av E2F1 (figur 6C), og fosforyleringen nivåer av AKT og ERK ble forandret på en lignende måte. Disse observasjoner tyder på at MIR-493 hemmer AKT og ERK veier ved å målrette E2F1.
(A) MIR-493 overekspresjon reduserte aktiviteten av AKT og ERK trasé på 95D og H1975 celler. (B) Den knockdown av MIR-493 ved med anti-speil 493 økte aktiviteten til AKT og ERK signal i HBE, A549 og H1299 celler. (C) MIR-493 (eller rykke kontroll) transfeksjon fulgt av E2F1 (eller mock vektor) transfeksjon 24 timer senere i 95D celler påvirker AKT og ERK signalering. Den AKT pathway aktivitet ble målt ved å undersøke uttrykket av fosforylert AKT (Pakt), mens EKR pathway aktivitet ble målt ved å undersøke uttrykk av fosforylert ERK (perk).
Diskusjoner
selv om en håndfull av studier har identifisert spesifikke mirnas som er involvert i humane tumordannelse og progresjon [10], [11], [12]. Vi tror også mer innsats bør gjøres for å identifisere relevante mirnas samt de spesifikke mekanismene som de utføre sine spesifikke funksjoner, særlig med hensyn til onkogenese og progresjon av ulike typer svulster. Her har vi identifisert at MIR-493, en potensielt kandidat tumor suppressor miRNA [22], [23], ble kraftig redusert i lungekreft og at lavere Mir-493 uttrykk var assosiert med metastase og dårlig prognose (figur 1C, D og tabell 1). Ektopisk uttrykk for MIR-493 markert svekket evne til cellene til å spre seg og invadere i lungekreftceller 95D og H1975 in vitro og in vivo.
Til dags dato, karakterisering av MIR-493-funksjonen har ikke vært omfattende selv om flere mål har blitt identifisert med en sentral rolle i celle migrasjon og metastaseveier, inkludert FZD4, Rhoc, MKK7 og IGF1R [22], [23], [24]. Her har vi identifisert et nytt mål av MIR-493, E2F1. E2F1 er en viktig transkripsjonsfaktor som spiller en viktig rolle i celle-syklusprogresjon og er strengt regulert av retinoblastom protein (Rb) [25]. Den inaktivering av Rb frigjør E2F1 fra den undertrykkende komplekset, som i sin tur induserer en kontinuerlig ekspresjon av mål-gener hvis produkter fremme cellesyklusprogresjon [26]. Ektopisk ekspresjon av E2F1 resulterer i neoplastisk transformasjon av gnagerceller [27], [28], og resultatene fra transgene modeller indikerer at økt E2F1 aktivitet er forbundet med tumorutvikling i flere vev [29], [30], [31] . Abnormaliteter i E2F1 genekspresjon og /eller E2F1 genamplifisering er blitt beskrevet i forskjellige cancercellelinjer og tumortyper, inkludert lungekreft [32], [33]. Av notatet, er overekspresjon av E2F1 ofte forbundet med høy grad av svulster og dårlig pasient overlevelse prognose [29], [31], [34], noe som tyder på at dets onkogene egenskaper utover evnen til å stimulere den avvikende vekst av neoplastiske celler. I samsvar med disse funnene, har den siste bevis avdekket at E2F1 er mest relevant for kreft metastase og chemoresistance [18], [19], [35]. Her viser vi at uttrykket av E2F1 er høy i lungekreft. I mellomtiden fant vi ut at MIR-493 direkte rettet mot og hemmer E2F1protein uttrykk. En dual-luciferase reporter-analyse indikerte at MIR-493 kan bindes til sekvensen i 3′-UTR av E2F1 (figur 4B). I tillegg innføring av MIR-493 redusert ekspresjon av cellulære E2F1 mRNA og protein (figur 5C, D) .Whereas, når inhibering av oligonukleotider mot MIR-493 ble ble transfektert inn i HBE, A549 og H1277-celler, en invers uttrykksmønster var observert mellom MIR-493 og E2F1 protein (figur 6 B). Fordi E2F1 spiller en betydelig rolle i regulering av celleproliferasjon, overlevelse og invasjon, undersøkte vi om E2F1 bidrar til effekten av MIR-493 på følgende fenotyper av lungekreftceller. Vi konstruerte siRNA-fragmenter rettet mot E2F1 å slå ned ekspresjonen av E2F1, og fant at knock-down av E2F1 kan delvis simulere cellevekst (figur 5 A) og celle invasjon (figur 5 D, E) fenotype indusert ved overekspresjon av MIR-493. Videre er overekspresjon av E2F1 (uten en endogen 3′-UTR) reddet inhibisjon av cellevekst og invasjon forårsaket av MIR-493 (figur 5B, D og E).
En ny studie viste at E2F1- avhengig tumorprogresjon ble mediert av aktivering av cytoplasmiske Ras /Raf signaleringskaskader [19], som MEK-ERK og PI3K /AKT vei, hvorav de fleste regulere celleproliferasjon, overlevelse og invasjon. I denne studien viste vi at MIR-493 kan hemme den konstitutive aktivitet av AKT og ERK veier ved å målrette E2F1. Deretter rednings eksperimenter indikerte at MIR-493-indusert nedregulering av E2F1 ble reddet ved innføringen av E2F1 (figur 3B), og fosforyleringen nivåer av AKT og ERK ble forandret på en lignende måte. Disse observasjonene tyder på at Mir-493 hemmer AKT og ERK veier ved å målrette E2F1.
Til sammen data fra vår studie antydet at MIR-493 kan være en potensiell svulst undertrykkende miRNA som hemmer celle invasjon og spredning av blokkering E2F1 i lungekreft, og deretter undertrykker nedstrøms AKT og ERK signalveier, for å kontrollere cellevekst, invasjon og tumorigenesis. Imidlertid vil fremtidige studier må oppdage flere kandidat mål i flere krefttyper å fullstendig avklare funksjon av MIR-493 i tumorigenesis.
Materialer og metoder
Cellelinjer og kultur
human lunge-cancercellelinjer (H1975, A549, H1299, H446), MRC5, en normal diploid, human cellelinje av lungefibroblaster, og udødeliggjort human bronkiale epitelceller HBE ble oppnådd fra og vedlikeholdes som anbefalt av American Type Culture Collection ( ATCC, Manassas, VA, USA) sikret human lungekreft cellelinje 95D ble hentet fra Cell Bank of Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Kina). Den H1975, A549, H1299, H446, HBE og 95D-celler ble holdt i RPMI-1640 medium (Hyclone, USA), supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS; Hyclone, USA). MRC5-celler ble opprettholdt i DMEM-medium (Hyclone, USA), supplert med 10% føtalt bovint serum. (FBS; Hyclone, USA) .De cellene ble inkubert i en atmosfære av 5% CO2 ved 37 ° C
Pasientprøver prøver~~POS=HEADCOMP
Alle vevsprøver ble samlet via kirurgisk fjerning fra pasienter diagnostisert mellom mars 2009 og mars 2012. Tilknyttet Tumor Hospital i Guangzhou Medical University (Guangzhou, Guangdong, Kina). Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle deltagerne. Studien protokollen ble godkjent av etikkomiteen Guangzhou Medical University.
Revers transkriptase (RT) -PCR og QRT-PCR
Den totale RNA ble ekstrahert fra celler eller vev ved hjelp Trizol reagens ( Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), og RT-reaksjoner ble utført ved anvendelse av en MIR-493 spesifikk primer. De spesifikke stilk-løkke RT primere for MIR-493 og U6 ble kjøpt fra Ribobio co., Ltd (Guangzhou, Kina). Primersekvensene av E2F1 ble definert som følger: forover primer: 5′-CCCATCCCAGGAGGTCACTT-3 «; Omvendt primer: 5-CTGCAGGCTCACTGCTCTC-3 «. Primersekvensene av GAPDH ble definert som følger: forover primer: 5»-CCACATCGCTCAGACACCAT-3 «; Revers primer: 5»-TGACAAGCTTCCCGTTCTCA-3 «. Real-time PCR ble utført ved hjelp av en standard protokoll for SYBR Grønn PCR kit (Toyobo, Osaka, Japan). U6 og GAPDH ble brukt som referanser for mirnas og mRNA, henholdsvis. De to
-ΔΔCt metode ble anvendt for å bestemme de relative mengder av genekspresjon. Hver prøve ble analysert i triplikat.
Western blot-analyse
Proteinkonsentrasjonen i lysatene ble målt ved BCA Protein Assay Kit (Bio-Rad), og 30 ug protein blandet med 2 × SDS lasting buffer ble lastet per kjørefelt. Proteinene i lysatene ble separert ved 10% SDS-PAGE og overført til polyvinylidendifluorid-membraner (Millipore). Deretter ble membranene inkubert i 12 timer ved 4 ° C med et antiserum som inneholder antistoffer mot E2F1, p-ERK, andβ-actin kjøpt fra cellesignale Technology, Akt, p-Akt, GSK3p og p-GSK3p og ERK innkjøpt fra Sigma -Aldrich Technology. A-konjugert sekundært antistoff og ECL Western blotting gjenkjenning reagenser ble brukt til å visualisethe target proteiner (ECL New England Biolabs), som ble kvantifisert med en Bio bilde Intelligent kvantifikator 1-D (versjon 2.2.1, Nihon-BioImage Ltd.). Et anti-β-aktin-antistoff ble anvendt som en proteinlastekontroll.
Immunhistokjemi
vev glir inkluderte 65 primær lungeprøver og tilsvarende normale lunge epitelvev. Immunhistokjemi ble utført på formalinfiksert parafin-embedded vev ved hjelp av anti-E2F1 antistoff (Cellesignalering Technology) og standard streptavidin-peroksidasefarging metode (Biotin-streptavidin (ABC) IHC detection kits, Abcam Inc, USA). Immunhistokjemi resultater ble scoret i henhold til intensitet (0-4) og andelen positive celler scorer 0: ingen farging; 1: 10% positive celler; 2: 11-50% positive celler; 3: 51-75% positive celler; 4: 0,75% positive cells.the relativ ekspresjon ble oppnådd ved å multiplisere intensiteten av den prosentvise
luciferase reporter-analyse
A pmirGLO Dual-Luciferase miRNA target ekspresjonsvektor ble brukt til tre. «-UTR luciferase analysene (Promega). Målgenene av miRNA-493 ble valgt basert på målet skanne algoritmer [microRNA.org (https://www.microrna.org/microrna/home.do) og TargetScan (https://www.targetscan.org/) ]. Primersekvensene som ble anvendt ble definert som følger: E2F1 forover primer: GCCTCGAGGAGATGCTCACCTTGTCTCTG, den reverse primer: CTAGCGGCCGCTGGATCTGCTTTTGAGTT. Mutant E2F1 frem primer: GAGGTGAGTGGGG
ACAAGG
CTGATGTGGGCAGGAGGGGTG, reverserer Mutant E2F1 primer: CCTGCCCACATCAGCCTTGTCCCCACTCACCTCTCCCATCTC. Fet indikerer XhoI (CTCGAG), og understrek indikerer Notl interne nettstedet. Kursiv (wild: GACCTTCA, mutant: ACAAGG) indikerer målet sekvens. For 3′-UTR luciferase assay ble 293T celler transfektert med HSA-MIR-493 og pmirGLO Dual-Luciferase miRNA målrette ekspresjonsvektorer med villtype eller mutant målsekvens hjelp Lipofectamine 2000. luciferase assay ble utført ved hjelp av Dual-Luciferase reporter Assay System (Promega) 48 timer etter transfeksjon. Dataene er presentert som middelverdi ± SD for triplikate forsøk og sammenlignet med nivået av villtypesekvensen vektorer oppnådd i mutant-typesekvensen vektor transfekterte celler som er normalisert til 100%.
Lentivirus produksjon og smitte
for å konstruere en vektor som uttrykker MIR-493, forløperen til sekvensen av MIR-493 (MI0003132) ble syntetisert, glødet og deretter settes inn i BamHI-Hindlll-fragmentet av det PGCI-L3 vektor (GeneCopoeia, Inc., Rockville, MD USA) .De lentivirus plasmidene ble ko-transfektert med pLP1, pLP2, og PLP /VSVG (GeneCopoeia, Inc., Rockville, MD USA) i 293T-celler (Invitrogen), og virus-holdige supernatanter ble fremstilt i henhold til produsentens instruksjoner. For lentivirus infeksjon, ble cellene inkubert med virus-holdige supernatanter i nærvær av 6 ug /ml polybrene. De infiserte celler ble utvalgt i nærvær av 2 ug /ml puromycin til å generere to sammenkoblede stabile monoklonale cellelinjer (en stabil cellelinje som uttrykker MIR-493, 95D-MIR-493, H1975-MIR-493 og deres kontroll stabil cellelinje, 95D -kontroll eller H1975- kontroll).
