Abstract
Pasienter med ALK genet rearrangements ofte manifest dramatiske svar på crizotinib, en ALK-hemmer. Nøyaktig identifikasjon av pasienter med ALK-positiv, ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) er avgjørende for den kliniske anvendelse av ALK-målrettet terapi. Men vurdere
EML4-ALK
omorganisering i NSCLC er fortsatt utfordrende i rutine patologi praksis. Hensikten med denne studien var å sammenligne den diagnostiske nøyaktigheten av FISH, immunhistokjemi (IHC), og real-time kvantitativ RT-PCR (qPCR) metoder for påvisning av
EML4-ALK
omorganisering i NSCLC og å vurdere immunhistokjemi som en pre-screening. I denne studien ble totalt 473 parafininnstøpte NSCLC prøver tatt ved kirurgisk resections og biopsier analysert ved IHC med ALK antistoff.
ALK
omorganisering ble ytterligere bekreftet ved FISH og QPCR. ALK-protein ekspresjon ble påvist i tyve pasienter (20/473, 4,2%). Av de 20 ALK-positive tilfeller av IHC, ble 15 tilfeller ytterligere bekreftet som
ALK
omorganisering av fisk, og 5 tilfeller var ikke tolkes. Også vi evaluert 13 av de 20 IHC-positive vev ved QPCR i tillegg til fisk, og fant ut at 9 tilfeller var positive og 2 tilfeller var usikre, mens 2 tilfeller var negative selv om de var positive med både IHC og FISH. ALK status var konkordant i fem av åtte saker som var tolkes av tre metoder. I tillegg er ingen av de 110 IHC-negative tilfeller med adenokarsinom histologi viste
ALK
rearrangements av fisk. Histologisk nesten alle
ALK
-rearranged tilfellene var adenokarsinom, bortsett fra at ett tilfelle var sarcomatoid carcinoma. En solid signet-ring celle mønster eller mucinous cribriform mønster ble presentert minst fokalt i alle ALK-positive svulster. I konklusjonen, våre funn foreslo at
ALK
omorganisering ble assosiert med ALK protein uttrykk. Den konvensjonelle IHC-analysen er et verdifullt verktøy for pre-screening av pasienter med
ALK
omorganisering i klinisk praksis og en kombinasjon av fisk og QPCR er nødvendig for ytterligere bekreftelse
Citation. Zhang YG Jin ML, Li L, Zhao HY, Zeng X, Jiang L, et al. (2013) Evaluering av
ALK
Omorganisering i kinesisk Ikke-småcellet lungekreft bruke fisk, Immunohistochemistry, og Real-Time Kvantitativ RT PCR på parafininnstøpte vev. PLoS ONE 8 (5): e64821. doi: 10,1371 /journal.pone.0064821
Redaktør: Pan-Chyr Yang, National Taiwan University Hospital, Taiwan
mottatt: 23 november 2012; Godkjent: 18 april 2013; Publisert: 31. mai 2013
Copyright: © 2013 Zhang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Natural Science Foundation National of China (NO.81050015). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft er fortsatt den ledende årsak til kreft dødsfall på verdensbasis [1], [2], til tross for forbedringer i deteksjonsmetoder og behandlinger. Blant ikke-småcellet lungekreft (NSCLC), sto for ca 85% av alle lungekrefttilfellene, er adenokarsinom den vanligste typen av lungekreft hos både menn og kvinner [2]. Foreløpig er arbeidet viet til utvikling av molekyler mot konkrete mål for bestemte krefttyper. Med fortsatt forbedring i vår forståelse av det molekylære grunnlaget for lungekreft, er en rekke målrettede terapier for NSCLC blir vurdert eller utviklet. Disse legemidlene inkluderer angiogenese-inhibitorer og signaleringsoverførings hemmere som epitel-vekstfaktor-reseptor (EGFR) -targeted terapier [3]. Derfor identifisering av de viktigste onkogener for lungekreft er en svært viktig skritt mot utviklingen av nye molekylære målretting midler.
Nylig, aktivering av anaplastisk lymfom kinase (ALK) genet i lungekreft med fusjon til echinoderm microtubule-assosiert protein-like4 (EML4) eller andre genet partnere (for eksempel
TFG Hotell og
KIF5B
) har blitt rapportert [4], [5], [6]. ALK-genet ble først karakterisert som en fusjonspartner for den NPM-ALK-onkogenet i anaplastisk stor cellelymfom [7], og er nå anerkjent som den aktive komponent i flere fusjonsproteiner i en rekke kreftformer [8]. ALK er en transmembrane reseptor med tyrosinkinase-aktivitet som hører til insulinvekstfaktor-reseptor-superfamilien, som er kodet i kromosom 2 (2p23). De ulike fusjonspartnere ALK medierer ligand-uavhengige dimerisering av ALK, noe som resulterer i konstitutiv kinase-aktivitet, og derved overfører anti-apoptotiske og celleproliferasjonsprosesser signaler via KRAS og PI3K trasé [8]. I NSCLC, avvikende aktivering av ALK bidrar til lunge karsinogenese etter å ha blitt smeltet sammen med en rekke andre gen partnere, oftest echinoderm mikrotubulus-assosiert protein 4 (
EML4
). EML4 genet ligger på kromosom 2 (2p21), og er omvendt orientert med
ALK
.
EML4-ALK
fusjon kan forekomme etter en spalting av kromosomet ved et variabelt område, og kromosom inversjon, som gir opphav til forskjellige fusjons isoformer [9].
EML4-ALK
fusjon skjer i en gjensidig utelukkende mote med
EGFR
eller
KRAS
mutasjoner og nesten utelukkende i adenokarsinom. Tilstedeværelsen av
EML4-ALK
er mer sannsynlig hos pasienter med visse demografiske egenskaper, som aldri røykestatus eller yngre alder [10]. De fleste studier har oppdaget denne genetisk abnormitet med en hastighet på 2-5% i den generelle befolkningen av pasienter med NSCLC [11], [12], [13], [14].
I tidligere kliniske studier, Crizotinib, en dobbel ALK /MET kinase inhibitor, ble vist å være dramatisk effekt hos pasienter med NSCLC husing ALK gen rearrangementer [15]. Crizotinib ble nylig godkjent av amerikanske FDA for behandling av avansert
ALK
-positivt NSCLC identifisert av fluorescens in situ hybridisering (FISH) [16]. For å sikre identifikasjon av pasienter som mest sannsynlig å dra nytte av Crizotinib, er det viktig å utvikle robuste og enkle diagnostiske metoder for å påvise ALK gen omorganisering når screening pasienter for behandling med crizotinib. Selv ALK FISH har blitt gullstandarden for påvisning av
ALK
omorganisering i NSCLC, kan det være teknisk utfordrende og kostnadskrevende. Derfor er andre diagnostiske modaliteter gjenstår å bli utforsket, inkludert immunhistokjemi (IHC) og revers transkriptase-polymerasekjedereaksjon (RT-PCR). RT-PCR er en svært følsom teknikk for påvisning og kvantifisering av RNA for
EML4-ALK
. Det er også i stand til å skrive
EML4-ALK
variant av sekvensering av PCR-produktet. Men fordi denne metoden ikke kan identifisere nye rearrangements involverer tidligere uncharacterized
EML4-ALK
varianter eller ukjente fusjonspartnere og sin prosess kan lett forurenset, følsomhet og spesifisitet gjenstår å bli bekreftet. IHC har fordelen av å være lett tilgjengelig og forholdsvis enkel å utføre og beholder morfologisk informasjon, som tillater trygg vurdering av avvikende gener i tumorceller. Av denne grunn, synes ALK IHC egnet for en storstilt screening av pasienter med
ALK
-positivt NSCLC.
Den store utfordringen til å bruke ALK IHC er ofte lavt nivå uttrykk for ALK fusjonsproteiner i
ALK
-rearranged NSCLC [16], noe som gjør det nødvendig å utvikle mer sensitive IHC-baserte metoder. Flere ALK antistoffer er blitt rapportert i de senere studier som viser at IHC har høy overensstemmelse med ALK FISH, inkludert Alk1 monoklonalt antistoff fra DAKO [17], 5a4 monoklonalt antistoff fra Novocastra [18], og D5F3 monoklonalt antistoff utviklet ved å Cell Signaling Technology [19] . Likevel er store studier er nødvendig for å videre validere samsvar mellom IHC og FISH, og utvikling og evaluering av nye antistoffer med høy spesifisitet og sensitivitet for ALK fusjonsproteiner vil være svært velkommen.
I denne studien har vi undersøkt ALK genet omorganisering ved hjelp av immunhistokjemi i NSCLC kliniske prøver, og korrelert resultatene med de som ble oppnådd ved FISH og QPCR. I tillegg undersøkte vi clinicopathologic kjennetegn ved NSCLC med ALK genet rearrangements. Denne studien var rettet mot å identifisere nyttig informasjon forutsi ALK genet omorganisering og fastsettelse av en diagnostisk prosedyre som kan utføres i rutinemessig praksis.
Materialer og metoder
Pasienter og Prøver
denne studien ble utført med godkjenning av klinisk etikk-komité i Beijing Chao-Yang Hospital, Capital Medical University. Alle pasienter gitt skriftlig informert samtykke. Archival formalinfiksert parafin-embedded vev ble innhentet fra 473 pasienter som hadde gjennomgått behandling av primær lungekreft mellom 2006 og 2011 på Beijing Chao-Yang Hospital of Capital Medical University i Kina. Tilfeller ble tilfeldig utvalgt blant pasienter diagnostisert som NSCLC ved histologisk undersøkelse av prøver innhentet av kirurgisk reseksjon og biopsi. Ingen pasienter hadde fått kjemoterapi før operasjonen og biopsi. For alle tilfeller, vi anmeldt alder ved diagnose, kjønn, røyking historie, og plasseringen av primærtumor, som ble hentet fra pasientjournaler. Ifølge the7th utgaven TNM staging manual for lungekreft utgitt av AJCC i 2010, ble alle tilfeller anmeldt og iscenesatt. Alle tilgjengelige histologi lysbilder fra hvert tilfelle ble revurdert, og histologisk type og grad av differensiering ble bekreftet i henhold til kriteriene i Verdens helseorganisasjon Klassifisering av lungesvulster og ERS /ATS /IASLC tverrfaglig klassifisering av lunge adenokarsinom [20]. For hvert tilfelle ble representanten vevsblokk inneholder mest levedyktige kreftceller valgt av to patologer. Den fasen av sykdommen var postoperative patologisk stadium. Scenen IV sykdommer inkludert tilfeller som fikk biopsier av åpen lunge eller videoassistert torakoskopisk kirurgi for diagnose. De clinicopathological data er oppsummert i tabell 1.
ALK Detection med Immunohistochemistry
For hvert tilfelle en representant formalinfiksert parafin-embedded (FFPE) vev blokk ble valgt og delt på 4-mikrometer tykkelse for farging. I korthet, etter deparaffinization og rehydratisering, ble platene oppvarmet i antigen gjenfinning i trykkoker i 3 minutter ved 100 ° C i 0,01 mol /L Tris-EDTA-buffer (pH 9,0). Endogen peroksidaseaktivitet ble blokkert ved inkubering av lysbildene i 3% hydrogenperoksid i absolutt metanol i 15 minutter, og ikke-spesifikk binding ble blokkert med 10% geiteserum i 15 minutter. En kanin monoklonalt antistoff til ALK (klon SP8, Thermo Fisher Scientific, Fremont, CA, USA) ble anvendt som det primære antistoff i en fortynning på 1:100. Etter inkubering over natten med ALK antistoff ved 4 ° C, ble platene inkubert med et anti-kanin, pepperrot peroksidase-merket polymer som sekundært antistoff fra DAKO Envision + ™ -system (Dako Corporation). Immunoreaktivitet ble visualisert med 3,3′-diaminobenzidin (Dako Corporation, Carpinteria, CA). Til slutt ble seksjonene motfarget med hematoksylin og montert. Positive kontroll seksjoner fra kjente ALK-positive ALCL saker ble inkludert i hver farging batch. Normal lymph node vev ble anvendt som en negativ kontroll. For blank kontroll, alle ruge trinn var identiske bortsett fra at kaninen ikke-immune IgG serum ble brukt i stedet for det primære antistoff (ALK).
Vi bestemte scoringskriteriene under en foreløpig evaluering ved hjelp av en multi-ledet mikroskop for å komme til en enighet. Farging resultatene ble deretter tolket av to av forfatterne uavhengig, uten forutgående kunnskap om clinicopathological parametere. Uharmoniske saker ble gjennomgått og avtalt før data ble statistisk analysert. For hver prøve ble minst fem felt (x 400) og mer enn 500 celler analysert. For ALK flekker, ble bare utvetydig cytoplasmatisk farge ansett som en positiv reaksjon. Antallet immunopositive celler ble semikvantitativt beregnet: ingen positive celler (-); 50% av tumorceller farging positive (+); 50% -75% av tumorcellene positive flekker (++); . 75% av kreftceller flekker positiv (+++) Den fargeintensitet ble gradert på en skala fra 0 til 3+ (0, negativ, 1+, svak, 2+, moderat, 3+, intens), på samme måte til de tidligere beskrevne protokoller [17], [18].
Fluorescens In Situ Hybridisering (FISH)
FISH ble utført på formalinfiksert, parafininnstøpte (FFPE) tumorvev bruker Vysis LSI ALK Dual Color, Break Apart Omorganisering Probe (Abbott Molecular, Abbott Park, Illinois, USA). ALK break-apart probe settet inneholder to DNA-prober merket med Spectrum Orange og Spectrum Grønn som henholdsvis hybridiserer til bandet 2p23 på motsatte sider flankerer stoppunkt av ALK-genet. Analysen ble utført i henhold til produsentens instruksjoner. I korthet, ble 4-um tykke seksjoner fra FFPE vevsblokker deparaffinized og dehydrert, deretter ble seksjonene behandlet med Vysis forbehandling reagens (Abbott Molecular) og omsatt med protease-oppløsning (Abbott Molecular). ALK break-apart sonde blanding ble påført på hele vev, og de ble ko-denaturert ved 73 ° C i 3 minutter. Glassene ble deretter hybridisert over natten i et fuktet kammer ved 37 ° C. Etter vasking, ble kjernene motfarget med 4 «, 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI). Seksjonene ble analysert under en fluorescens mikroskop utstyrt med en trippel-pass filter (DAPI /grønn /oransje). En gjentatt analyse av noen prøver ble utført på grunn av dårlige hybridiseringssignaler og /eller morfologi fattig vev. Positive og negative slides ble inkludert i hver kjøring av FISH testen.
FISH Tolkning
I henhold til produsentens spesifikasjoner, var fisk lysbilder evaluert uten kjennskap til IHC resultater for ALK. De to teknikere analysert hver fisk lysbilde, skanne hele vev seksjonen og scoret 50 representative kjerner, som ble tydelig identifisert og inneholdt entydige signaler. Kjerner som inneholder signaler om bare én farge bør ikke være nummerert. Resultatene av hver tekniker ble ikke kombineres før studien ferdigstillelse for å redusere skjevheter i scoring. Cellen ble ansett som positiv, når en kjerne hadde minst ett sett med brutt fra hverandre signaler, eller hadde en enkelt rød signal (strøket grønt signal) i tillegg til sammensmeltede og /eller brutt fra hverandre signaler. Avstanden mellom to adskilte røde og grønne signaler som ble beregnet ved hjelp av de to tider av største signal størrelse. Prøvene ble betraktet som positive hvis mer enn 25 ut av 50 tumorcellene var positive, og negative hvis mindre enn 5 tumorcellene var positive. Prøven med 5-25 positive tumorceller ble ansett tvetydig, og deretter ble evaluert ved en andre tekniker. De første og andre celle telleavlesninger ble tilsatt sammen, og en prosent ble beregnet ut fra 100-celler. Hvis den gjennomsnittlige prosent av positive celler var 15% eller mer, ble prøven ansett som positive. Ellers ble det ansett som negativt for
ALK
omorganisering.
Sanntids Kvantitativ RT-PCR (QPCR)
Total RNA ble ekstrahert fra nyklipt FFPE- vevsdelene bruker RNeasy-sett (Qiagen). I korthet, ble tumorområdet identifisert gjennom hematoxylin-eosin-farging og vev fra dette området på ufargede seksjoner ble skrapt for RNA-ekstraksjon. Etter deparaffinization og oppløsningstrinn, ble det totale RNA ble renset med en RNeasy MinElute spinnkolonne. Genomisk DNA ble fjernet med RNase-fri DNase I (Qiagen). Før RNA forsterkning, ble integriteten og renhet av RNA estimeres ved denaturering agarosegelelektroforese og A260 /A280 måling.
Real-Time PCR-amplifikasjon ble utført ved hjelp av AmoyDx ™ EML4-ALK Fusion Gene Detection Kit (Amoy Diagnostics Xiamen, Kina) i henhold til produsentens anbefalinger. I korthet 0,1-5 ug total RNA ble revers transkribert til cDNA ved anvendelse av M-MLV revers transkriptase (Invitrogen). Seks pl av cDNA ble deretter anvendt som templat for en 25 pl reaksjon for real-time PCR deteksjon av de EML4-ALK-fusjons transkripter ved hjelp av EML4-ALK reaksjon Master-mikser og en ABI 7500 cycler (Applied Biosystems). Den EML4-ALK Fusion Gene Detection Kit syssels roman, proprietære primere til spesielt forsterke målet gensekvensen som involverer ni kjente EML4-ALK fusjons transkripsjon varianter, inkludert E13, A20, E6a /b, A20, E20, A20, E15, A20, E14 ; A20, E18, A20, E2, A20, E17, A20. Den mengden av target-cDNA ble målt etter hver syklus på dataregistreringsfasen ved hjelp av en ny fluorescerende probe. Kvaliteten av det syntetiserte cDNA ble bekreftet under samme kjøring av amplifikasjon av referanse genet (β-actin,
ACTB
). Den EML4-ALK fusjonsgenet og
ACTB
analyser ble merket med FAM. En positiv og negativ kontroll ble inkludert i hver real-time PCR løp. Som definert av produsentens instruksjoner, ble QPCR analyse for EML4-ALK fusjonsgenet vurderes positivt, hvis prøven Ct verdien 30. For de negative prøver, ble real-time RT-PCR-analyse gjentatt to ganger.
Statistiske analyser
De statistiske analysene ble utført ved hjelp av SPSS for Windows 13.0 program (SPSS Inc., Chicago , IL). For å analysere sammenhenger mellom
ALK
status og klinisk-patologisk variabler brukte vi χ2 test eller Fishers eksakte test, der det er aktuelt. Sannsynlighets verdier av 0,05 ble betraktet som signifikant i analysene
Resultater
Clinicopathogical Funksjoner av Svulster
I denne studien har vi analysert et panel av 473 NSCLC prøvene,. bestående av 375 saker fra kirurgisk resected svulster, og 98 saker fra biopsier. Ingen pasienter fikk kjemoterapi ved diagnosetidspunktet. Som er oppsummert i tabell 1, pasientene består av 314 (66,4%) menn og 159 (33,6%) kvinner med en median alder 59 år (fra 21 til 84 år). Histologisk 341 (72,1%) var adenokarsinom, 112 (23,7%) squamous cell carcinoma, og 20 (4,2%) andre typer. Den patologisk stadium var jeg i 166 (35,1%), II i 104 (22%), III i 105 (22,2%), og IV i 98 (20,7%) tilfeller.
ALK Protein Expression ved IHC
Alle ALK-positive tilfeller oppviste en diffus og cytoplasmatisk fargemønster i tumorceller, og ingen farging ble observert i normal lunge bronkiale epitel, alveolare pneumocytes, alveolære makrofager, mesenchymale vev, og inflammatoriske celler i de tilstøtende lungevev (Figur 1). Tjue tilfeller av 473 ble ALK-positive, som representerer 4,2% av alle tilfeller studert av IHC, som omfattet score på 3 sett i 14 tilfeller med en granulær intens cytoplasmatisk farging (figur 1 A), stillingen av to i 5 tilfeller med en moderat cytoplasma farging (figur 1-C), resultatet av en i en sak med en svak cytoplasma farging (figur 1-E) og score på 0 i 453 tilfeller (figur 1-G). Ingen signifikant intratumoral farging heterogenitet ble observert, selv om signet-ring-celler hadde en tendens til å oppvise svakere fargingen enn de andre celler, kanskje fordi cytoplasmatisk ALK protein ble redusert med et stort volum av slim materiale. Det var ingen tydelig sammenheng mellom ALK genet omorganisering av fisk og intensiteten i farging
A, C, E, G:. ALK immunostainings (opprinnelig forstørrelse × 200). A og C: intense og moderat cytoplasmatiske stainings (poengsum = 3 og 2 henholdsvis), E: svake cytoplasmatiske stainings (poengsum = 1) og G: ingen farging (0 poeng). B, D, F og H. FISH analyse for
ALK
bruker doble farge ALK break-apart sonde. B, D og F viser FISH sigals i ALK-omar svulster, og andelen av celler med ALK positive signaler var 49% (49/100), 38% (38/100), 56% (28/50), henholdsvis . Omorganiseres
ALK plakater (B, D og F) indikeres ved splitting av røde og grønne signaler eller enkel rød signals.H viser FISH sigals i en ikke-omorganisert svulst. den andel av celler med ALK positive signaler ble 3% (3/100). Non-omorganiseres
ALK product: (H) viser fusjon eller tilstøtende røde og grønne signaler.
ALK Omorganisering Vurdert av FISH
ALK omorganisering ble vurdert ved hjelp av FISH i 110 IHC-negative tilfeller med adenocacinoma histologi og 20 IHC-positive saker. Blant de 20 IHC-positive tilfeller, ble 15 tilfeller bekreftet som
ALK
omorganisering av ALK FISH, 5 tilfeller var ikke tolkbare, på grunn av tekniske artefakter som signaltap som muligens stammer fra upassende fiksering eller tap av svulst vev. Ingen av de 110 IHC-negative tilfeller viste
ALK
omorganisering av fisk. Representative bilder av ALK FISH er vist i figur 1-B, D, F, H. Det var to positive
ALK
omleirings mønstre. En var bruddet fra hverandre (BA) mønster med en eller to adskilte røde og grønne signaler, og en annen ble isolert røde signalmønster uten tilsvarende grønne signal. ALK FISH-negative tilfeller viste to fusjons signaler eller umiddelbar nærhet av de røde og grønne signaler.
Sammenheng mellom ALK IHC og FISH
I denne studien, 130 saker ble analysert av både IHC og fisk. Samsvar mellom IHC og FISH er vist i Tabell 2. Med tanke på 5 tilfeller av fisken ble ikke tolkbar, sensitiviteten og spesifisiteten av IHC i de 125 tilfellene, i sammenligning med fisk, var 100% og 100%, henholdsvis. Dermed denne studien viste at det var stor samstemmighet i vurderingen av
ALK
omorganisering mellom IHC og FISH.
EML4-ALK Fusion Gene av QPCR
deretter testet 13 IHC-positive tilfeller av QPCR. De EML4-ALK fusjonsgener ble påvist i 9 av 13 tilfeller. De inkluderte
EML4-ALK
variant 1, 2, 3 med ekson 13 av
EML4
, ekson 20 av
EML4
, og ekson 6a /b
EML4
smeltet til ekson 20 på henholdsvis
ALK
,. Det var 2 tilfeller der EML4-ALK fusjonsgener ikke ble oppdaget av QPCR, men
ALK
rearrangements ble oppdaget av fisk. I tillegg har positivt resultat for
EML4-ALK
i 2 tilfeller kunne ikke gjenta seg i gjentatte analyser. Av notatet, i ett tilfelle, ALK FISH var uninformative for
ALK
omorganisering, men saken ble rapportert positiv med QPCR. Dette kan sannsynligvis skyldes knappheten på tumorcellene. I dette utvalget, ble totalt 30 representative tumorcellekjerner telles, og bare to kreftceller var positive.
Clinicopathologic Kjennetegn på ALK-positive pasienter
Totalt 473 resected og biopsied NSCLC prøvene ble undersøkt. ALK-protein-ekspresjon ble evaluert i alle tilfeller ved IHC.
EML4-ALK
trans og /eller
ALK
rearrangements ble ytterligere bekreftet i alle ALK-immunopositive tilfeller av fisk og /eller QPCR. Forholdet mellom
ALK
omorganisering og clinicopathologic funksjoner er oppsummert i Tabell 3.
ALK
omorganisering ble påvist i 20 av 473 NSCLC tilfeller. Av de 20 ALK-positive tilfeller, 19 (95%) ble adenokarsinomer, og en var sarcomatoid carcinoma som hadde en betydelig spindel celle og kjempecellekomponent. Histomorphologically, som vist i tabell 4,
ALK
-rearranged lunge adenokarsinomer viste ofte solid signetring celle mønster. En solid signet-ring celle mønster eller mucinous cribriform mønster ble presentert minst fokalt i alle ALK-positive tumorer (figur 2). Som vist i tabell 3, ALK-positive pasienter viste statistisk forskjell i alder (p = 0,003) og patologisk trinn (p = 0,024), sammenlignet med ALK -negative pasienter. Pasienter med ALK-positiv lunge adenokarsinom var yngre ved diagnose og hadde en høyere stadium, vanligvis i trinn IV. Ingen nevneverdig forhold ble påvist mellom ALK omorganisering og enten pasienten kjønn eller røyking historie.
De viste solid signet-ring celle mønster (A), en cribriform struktur (BD), og rikelig ekstracellulært slim (C).
Diskusjoner
Selv om EML4-ALK fusjonsgenet er et mindre genetisk abnormitet i NSCLC [21], [22], er forekomsten av lungekreft øker i mange land, er det absolutte antallet lungekreftpasienter skjuler den EML4-ALK fusjonsgenet ikke trivielt. Crizotinib, har en dobbel MET /ALK-tyrosinkinase-inhibitor er vist å være effektive for behandling av pasienter med ALK-positiv NSCLC. Basert på sin effekt og sikkerhet, ble crizotinib nylig godkjent av amerikanske FDA for behandling av pasienter med avansert ALK-positive NSCLC. Imidlertid er forekomsten av
ALK
omleiring forholdsvis lav, fra 2 til 5%. Selv når en beriket populasjon av NSCLC pasienter er valgt på grunnlag av deres prediktive kliniske egenskaper, for eksempel yngre alder, røykfrie status, og adenokarsinom histologi, er det vanskelig å identifisere undergrupper av ALK-positive svulster. Derfor effektiv screening for pasienter med
ALK
-rearranged NSCLC er et viktig spørsmål i klinisk praksis.
ALK break-apart FISH analysen har fungert som ledsager dignostic test for å etablere ALK positivitet i kliniske utprøvinger av crizotinib [15]. I teorien er ALK FISH stand til å oppdage eventuelle omorganisering som innebærer
ALK
, uavhengig av fusjonspartnere eller
EML4-ALK
varianter, på FFPE vev som representerer den vanligste metoden for behandling og lagring vevsprøver. Men fra teknologisk og kostnadsmessig,
ALK
omorganisering i NSCLC forblir FISH for rutinen storskala påvisning av å være utfordrende. Det haster med å utvikle og validere mer kostnadseffektive metoder for å påvise denne genetiske avvik. Aktuelle diagnostiske metoder for å påvise
ALK
omorganisering inkluderer immunhistokjemi (IHC), fisk og polymerase chain reaction (PCR) -baserte metoder. Imidlertid er tilstrekkelige opplysninger til en adekvat sammenligning med FISH foreløpig mangler.
IHC er en rask og rimelig metode foretrekkes av patologer for rutinediagnostikk. Det kan utføres med suksess på en rekke histologi og cytologi prøver. Selv om immunhistokjemisk teknikken ikke direkte å påvise ALK fusjonsgenet i seg selv, basert på den observasjon at ALK er ikke detekterbar i noen andre enn hjernen [23] normale vev, er ALK-immunoreaktivitet forbundet med oppregulert ekspresjon av genet, på grunn av endret promoter aktivitet som er svært karakteristisk for en
ALK
inversjon. Tidligere studier har vist at noen kommersielt tilgjengelige ALK-antistoffer har relativt lavere følsomhet i å oppdage ALK av IHC, muligens på grunn av en svak transkripsjonen aktivitet til promoter-enhancer regionen
EML4 Hotell som driver uttrykk for EML4-ALK. Den D5F3 antistoff (Cell Signal Technology) er en av de mest lovende antistoffer for påvisning av
ALK
omorganisering i NSCLC [19]. Men fortsatt videre studier er nødvendig for å validere samsvar mellom IHC og FISH i større serie prøver
I denne studien har vi utført immunhistokjemi bruk av monoklonalt antistoff (Klon SP8, Thermo Fisher Scientific, Fremont CA, USA)., en vanlig brukt, velprøvd ALK antistoff ved den samme fortynning som anvendes i ALCL, gjør bruken mer praktisk fra et diagnostisk laboratorium perspektiv. Dette antistoffet gjenkjenner et humant p80-protein, identifisert som en hybrid av ALK-genet og nucleophosmin (NPM) genet som resulterer fra t (2; 5) (p23; q35) trans funnet i 30-50% av CD30 + store cellelymfomer. Det erkjenner også full-lengde ALK protein. Vår IHC metoden er basert på en standard IHC fremgangsmåte for rutinemessig patologi praksis. Vi forlenget antigen gjenfinning tid og inkubert over natten antistoff i 4 ° C for å forbedre sensitivitet og spesifisitet. ALK-positive rate i våre NSCLC tilfeller (20/473, 4,2%) var sammenlignbar med frekvensen av EML4-ALK fusjons avskrift rapportert i tidligere studier (2-5%). Alle ALK-positive NSCLC tilfeller av IHC viste ALK genet omorganisering av fisk og /eller QPCR. På den annen side, blant 473 NSCLC tilfeller vi tilfeldig valgt 110 IHC-neagative tilfeller med adenokarsinom histologi å evaluere
ALK
omorganisering av fisk, og fant ut at det var ingen tilfeller der
ALK
gen omorganisering ble oppdaget. I motsetning til en tidligere studie [6], IHC-test med SP8 antistoff viste høyere spesifisitet og sensitivitet i vårt studium. ALK farging gitt en svært ren, lett tolke immunoreaktivitets uten å forstyrre bakgrunnsfarging i de positive sakene. Dette avviket antagelig et resultat av de forskjellige IHC prosedyre som antigen gjenfinning og antistoff inkubasjon, eller et resultat av variasjonene i vev behandling i forskjellige laboratorier. Våre resultater forble å bli bekreftet i lager kohortstudier.
RT-PCR av cDNA har vært et vanlig brukt screening strategi for ALK genet rearrangements. Ved sekvensering av PCR-produktet, kan den spesifikke EML4-ALK-varianter som uttrykte bli identifisert. Imidlertid vil nye ALK fusjonspartnere ikke bli oppdaget med slike teknikker. I nyere studier, RT-PCR basert gjenkjenning av
ALK
omorganisering stor grad har vært begrenset til fersk eller frossen vev. Sammenlignet med multipleks RT-PCR, vises QPCR en perfekt egnet fremgangsmåte for identifisering av direkte sammensmelting variant og påvisning av dets ekspresjon nivå, på grunn av sin lave pris og rask behandlingstid. RT-PCR basert gjenkjenning av
ALK
omorganisering på FFPE- vev krever optimalisering av analysen design og gjenstår å bli vurdert i store kohortstudier. I vår studie, utførte vi QPCR på FFPE- vev fra 13 ALK-positive tilfeller av IHC. 2 tilfeller var negative for
EML4-ALK
av QPCR, men positivt for
ALK
arrangement av fisk. Antagelig var det nye ALK fusjonspartnere eller roman
EML4-ALK
variant, mens vår analyse utforming involvert bare ni kjente
EML4-ALK
varianter. Dette forble å bli validert av genet sekvensering. I tillegg kan degradering av RNA i FFPE- vevsblokker også føre til falske negative resultater. I vår studie, alle de testede FFPE- vevsblokker var 7-45 måneder gammel da vår oppdagelse arbeidet ble utført. RNA kvalitet og fravær av forurensning med genomisk DNA ble verifisert ved formaldehyd-agarosegel-elektroforese. Vi har også kvantifisert nivået av β-actin som den endogene RNA kvalitetskontroll. Den nødvendige kvalitetskontroll, inkludert en ikke-templat kontroll, kjent ALK-positiv og negativ kontroll, ble utført gjennom hele prosedyren. Våre resultater viste QPCR på FFPE- vev var ikke effektive nok som eneste påvisningsmetoden, men det forble nyttig å identifisere de involverte fusion variant når frosset materiale er ikke tilgjengelig.
Vi utførte FISH, som regnes som den nåværende
