Abstract
Bakgrunn
kreft-assosiert fibroblaster, som består av aktiverte fibroblaster eller myofibroblasts, er funnet i stroma som omgir solide tumorer. Disse myofibroblasts fremme invasjon og metastasering av kreft celler. Mekanismene som regulerer aktiveringen av fibroblaster og initiering av invasiv tumorigenesis er av stor interesse. Oppregulering av cytoskeletal protein, Palladin, har blitt oppdaget i stromale myofibroblasts rundt mange solide kreftformer og uttrykk skjermer for gener involvert i invasjonen. Ved hjelp av en bukspyttkjertelkreft modell, undersøkte vi funksjonell konsekvens av overekspresjon av eksogene Adin i normale fibroblaster
in vitro Hotell og dens effekt på de tidlige stadier av tumorinvasjon.
hovedfunnene
Palladin uttrykk i stromale fibroblaster skjer svært tidlig i tumorigenesis.
In vivo
, konkordant uttrykk for Palladin og myofibroblast markør, alpha glatt muskulatur aktin (α-SMA), oppstår tidlig på dysplastiske stadier i peri-tumor stroma og gradvis økning i bukspyttkjertelen tumorigenesis.
In vitro
innføring av eksogene 90 kD Adin i normale humane dermale fibroblaster (HDFs) induserer aktivering av stromale fibroblaster inn myofibroblasts som preget av induksjon av α-SMA og vimentin, og gjennom fysisk endring av celle morfologi. Videre Palladin uttrykk i fibroblaster forbedrer cellemigrasjon, invasjon gjennom ekstracellulære matrise, og etablering av tunneler der kreftceller kan følge. Fibroblast invasjonen og etablering av tunneler resultater fra utvikling av invadopodia lignende cellulære utstikkere som uttrykker invadopodia proteiner og proteolytiske enzymer. Palladin uttrykk i fibroblaster er utløst av co-kulturen i normale fibroblaster med k-ras-uttrykke epitelceller.
Konklusjoner
Totalt Adin uttrykk kan formidle myofibroblast egenskaper i sin tur fremme invasiv potensialet i disse peri-tumorceller med invadopodia drevet nedbrytning av ekstracellulær matrix. Adin ekspresjon i fibroblaster kan utløses av k-ras-ekspresjon i tilstøtende epitelceller. Disse dataene støtter en modell der Adin-aktiverte fibroblaster lette stromal avhengig metastase og utvekst av tumorigent epitel
Citation. Brentnall TA, Lai LA, Coleman J, Bronner MP, Pan S, Chen R (2012) opphisselse of Cancer-Associated Stroma: Overuttrykte Adin aktiverer fibroblaster å fremme tumorinvasjon. PLoS ONE 7 (1): e30219. doi: 10,1371 /journal.pone.0030219
Redaktør: Donald Gullberg, Universitetet i Bergen, Norge
mottatt: 22 mars 2011; Godkjent: 15 desember 2011; Publisert: 23 januar 2012
Copyright: © 2012 Brentnall et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Gene og Mary Ann Walters Fund for kreft i bukspyttkjertelen forskning (TAB), Canary Foundation (TAB) og NIH NCI 5K07 CA116296 (RC). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Fibroblaster spille en sentral rolle i kreft invasjon, metastase, og chemoresistance [1] – [7]. Kreft-assosiert fibroblaster er myofibroblasts med kontraktile egenskaper og alpha-glatt muskulatur aktin (α-SMA) farging er et kjennetegn på disse cellene [8]. Den mekanismen som myofibroblasts forbedre tumorigenesis understrekes av tre viktige studier som viser: 1) kreft-assosiert fibroblaster anstand kreftcellene fra den primære området inn i metastatisk nisje 2) blokkerer de aktiverte fibroblaster
før
tumorinvasjon initierer kan forebygge kreft; men stoppe myofibroblasts etter invasjonen har begynt er for sent å forebygge kreft og 3) terapeutisk behandling av kreft i bukspyttkjertelen som reduserer kreft-assosiert fibroblaster er mer effektive i å forlenge overlevelse enn standard kjemoterapi som er rettet mot bare kreftcellene [9] – [11 ].
90 kD isoform av Adin, et foster og cytoskeletal protein viktig for cellemotilitet er overuttrykt i kreft-assosiert fibroblaster av en rekke krefttyper, inkludert bukspyttkjertel, bryst, lunge, nyre, og eggstokk men blir uttrykt ved lave nivåer i normale stromale fibroblaster [12] – [15]. Adin-uttrykkende fibroblaster er også funnet i tilknytning til kreftceller i lymfeknuten og levermetastaser [12]. Feilregulering av Palladin fra dyrkede celler fører til avvikende aktin organisasjon, feilregulert celle adhesjon og bevegelighet, og brutto avbrudd av cellen morfologi [16] – [20]. Ikke overraskende har Adin blitt oppdaget i uttrykket skjermer for invasjonen spesifikke gener i bukspyttkjertelen og brystkreft [21], [22].
En interessant sammenheng mellom kreft-assosiert fibroblaster og Palladin i innstillingen av kreft i bukspyttkjertelen har kommet frem i lyset. Vi har rapportert en meget penetrant, sjelden form for familiær kreft i bukspyttkjertelen (Family X) som er forårsaket av en mutasjon i en høyt konservert region av 90 kD Adin. Denne mutasjonen induserer cytoskeletal unormalt og forbedrer migrasjon når transfektert inn i celler som normalt uttrykker minimale mengder av 90 kD Palladin isoform [19]. Det var interessant å finne at Palladin protein er overuttrykt fortrinnsvis og overalt i stromal rommet for kreft i bukspyttkjertelen i stedet duktale epitelceller [12], [23].
Det grunnleggende rolle Adin i cellemotilitet og den økende bevisstheten om at aktivert fibroblaster faktisk kan samarbeide med kreftceller til å fremme invasjon og metastasering førte til disse undersøkelsene. Heri, ved hjelp av bukspyttkjertelkreft som modell, rakne vi 1)
når
i neoplastisk progresjon gjør Adin aktivere fibroblaster, 2)
mekanisme
underliggende overgangen til normal fibroblast inn en aktivert myofibroblast i innstillingen av kreft og 3)
hvordan
myofibroblast kan hjelpe kreftcellene til å slippe unna. I tillegg har vi også utforsket effekten av en arvelig mutert 90 kD Adin i fibroblaster av en slekt disponert for kreft i bukspyttkjertelen (Family X eller FX). Kan en Palladin-mutert stromal fibroblast initiere kreft?
Resultater
Palladin uttrykk i tumorassosierte fibroblaster oppstår tidlig i neoplastisk progresjon og co-lokaliserer med α-SMA i menneskelig kreft i bukspyttkjertelen
Immunhistokjemisk (IHC) farging av myofibroblast markør, α-SMA, og 90 kD Palladin ble utført samtidig på menneskelige vev microarray blokker som inneholder alle histologiske stadier av menneskelig kreft i bukspyttkjertelen inkludert forstadier til kreft (figur 1). Normale bukspyttkjertelen manglet 90 kD Palladin protein uttrykk unntatt i slimhinnen i endotelceller. I motsetning økt 90 kD Adin uttrykk med neoplastisk progresjon i forstadier til kreft dysplastiske lesjoner og det mest slående var at Palladin farging ble begrenset til fibroblaster i umiddelbar nærhet til de dysplastiske duktale celler (figur 1). I kreft i bukspyttkjertelen, diffus og sterk Adin uttrykk ble observert i hele stroma, spesielt i området rundt de adenokarcinomceller, i samråd med ved tidligere rapporter [12], [23]. Uttrykk av α-SMA på kreft stroma tett paralleller at av Adin som tidligere rapportert i nyrecellekreft [15]. Co-uttrykk for α-SMA og Palladin i fibroblaster omgir forstadier til kreft tyder på at myofibroblast fenotype aktiveres tidlig i neoplastisk progresjon og blir mer utbredt i kreft.
A) Uttrykk for Palladin og α- SMA ble undersøkt via IHC flekker i bukspyttkjertelen prøver. Venstre: Det er lite eller ingen flekker i normal bukspyttkjertelen. Midten: uttrykk økning i peri-tumoral fibroblaster i bukspyttkjertelen dysplasi eller Panin 2. Høyre: uttrykk er høyeste og mest utbredt i fibroblaster rundt kreft i bukspyttkjertelen. B) Semi-kvantitative målinger gir IHC score for tissue microarray farging av normal (NL), lavgradig dysplasi (Panin 2), høygradig dysplasi (Panin 3) og kreft (CA) ved Adin og α-SMA. Farging av Palladin eller α-SMA ble scoret som 0 til 4. Se også tabell S1.
Palladin opp-regulerer α-SMA og aktiverer fibroblaster å bli myofibroblasts
Basert på protein uttrykk for Palladin og α-SMA i peri-tumoral fibroblaster, søkte vi å løse forholdet mellom disse proteinene. Adin er markert oppregulert under fibroblast-til-myofibroblast overgang etter behandling med TGF-β1 [4] som er a-SMA [3]. I vaskulære glatte muskelceller, er Adin uttrykk kreves for α-SMA oppregulering [24], [25]. Vi lurte på hva regulerende effekt disse to myofibroblast-assosierte proteiner kan ha på hverandre og myofibroblast fenotype (se data nedenfor). Transfeksjon av 90 kD isoform av villtype (WT) og mutant P239S (FX) Adin inn i normale humane dermale fibroblaster (HDFs) opp-regulerer myofibroblast markører, α-SMA og vimentin, og er tilstrekkelig til å utløse en myofibroblast fenotype følgende Adin induksjon. Ved døgn 5 etter Adin transfeksjon, blir α-SMA signifikant forhøyet (27,4% ± 2,8%), og enda ytterligere øket ved dag 9 (79% ± 15,7%) (figur 2). Transfeksjon av Adin resulterte også i oppregulering av 11 myofibroblast kontraktile proteiner som er rapportert av Malstrøm et al. [26] (inkludert cofilin, vimentin, profilin, caldesmon, tropomyosin, alfa enolase, beta aktin, tubulin, Rho GTP dissosiasjon hemmer en, calponin, og peptidyl Prolyl- cis-trans isomerase A). Dette proteomforskning analysen er beskrevet i større detalj senere.
A) HDF-celler transfektert med 90 kD Adin (WT eller FX) eller tom vektor (EV) ble undersøkt for myofibroblast markører a-SMA og vimentin via IF. Rød = α-SMA eller vimentin; Blå = DAPI. B) HDF-celler ble behandlet som ovenfor i (A) og ekspresjon av α-SMA ble analysert ved RT-PCR. RNA ble høstet på antall dager indikert etter transfeksjon. C) Ekspresjon av α-SMA ble analysert ved RT-PCR. GAPDH ble anvendt som en intern kontroll lasting og den relative ekspresjon av hver prøve i forhold til TGF-ß1 behandlede prøver ble plottet som gangers induksjon ± SD.
Adin-aktiverte fibroblaster utvikle en myofibroblast fenotype
Innføring av 90 kD Adin (WT eller FX) i HDF celler (heretter benevnt HDF-WT eller HDF-FX) resulterte i endringer i den cellulære morfologi (figur 3A). Under normale vekstbetingelser (med komplett medium), Adin-uttrykkende fibroblaster viste en nedgang i celleareal, og en økning i tynne cellulære fremspring med pigglignende vedheng sammenlignet med foreldrekontrollcellene. Cytoskeletal endringene inkluderte både forlengelse og fortykkelse /bunting av aktin stresset fibre (figur 3A). Tynne cellulære utstikkere med spike-lignende vedheng er synlig ved elektronmikroskopi i Adin-uttrykke fibroblaster (figur 3B). Fordi mange kreftformer dannes i en inflammatorisk setting, og fordi kreft er ansett såret som ikke leges [27], vi også undersøkt Adin-uttrykke fibroblaster etter inkubasjon i såret media (kondisjonert medium fra fibroblaster som ble såret med en pipette tips ) for å avgjøre om ytterligere endringer var bemerkelsesverdig (figur 3A). De morfologiske forandringer ble vesentlig styrket i forhold til tom-vektorkontroll fibroblaster (Figur 3C). Cellene utviklet en mer fusiform eller mesenchymale form med lange tynne fremspring i forhold til tom-vektor kontroll fibroblaster (Figur 3C).
A) HDF transfektert med WT-Adin (WT) eller FX-Adin (FX) var sammenlignet med tom vektor (EV) ved hjelp av IF analyse av phalloidin beiset celler dyrket i komplett media eller såret medier. B) Phalloidin-farget HDF-WT celle utvekst ble forsterket av elektron micrography (
innfelt
). C) HDF ble behandlet som ovenfor i (A) og dyrket i media såret. Phalloidin fargede celler ble analysert ved IF. Tomter illustrere den relative overflateareal av celler (
toppen
) og gjennomsnittlig lengde på fremspring (
nederst
). Dataene er representative for to uavhengige eksperimenter; Verdiene er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM. (T-test, *, p-verdi 0,05; **, p-verdi 0,01).
Palladin-uttrykke fibroblaster pluss en stimulerende trigger forbedrer invasiv og vandringsmønstrene
Vi neste spurt om 90 kD Adin uttrykk vil påvirke migrasjon og /eller invasiv kapasitet på fibroblaster. Migrering ble testet ved bruk av et transwellsystem hvor cellene kan krysse direkte gjennom porene fra et øvre kammer til et nedre kammer. Invasjonen ble testet ved hjelp av en Matrigel belagt transwell. Analyseresultatene ble sammenlignet for inkubasjon med komplett media, såret media (betinget media samlet fra konfluente HDF celler manuelt såret med en pipettespiss), eller kondisjonert medium fra Panc-1 epitelceller. Tidligere studier har vist at eksponering av celler til å såre media, øker migrasjonsrate av epitelceller [28]. I overensstemmelse med nyere studier som viser anti-trekkende virkning av Adin uttrykk i brystkreftceller [29], i fravær av en såret signal, Adin-aktiverte fibroblaster ikke har forbedret migrering eller invasjon. Men en såret signal dramatisk økt migrasjon og invasiv kapasitet på Adin-aktiverte fibroblaster (WT og FX) sammenlignet med tom vektor kontroll (HDF-EV) (4A 4B). Mens epidermal vekstfaktor (EGF) hadde et lignende resultat på cellene som sårede media (data ikke vist), ble inkubering med kondisjonert medium fra bukspyttkjertelcancerceller (PANC-1) ikke øke invasivitet av Adin-uttrykkende celler (figur 4B) .
A) Migrasjon over en transwell ble sammenlignet for HDF transfektert med tom vektor (EV), WT-Adin (WT), FX-Adin (FX) når de utsettes for normale komplett media eller såret medier. Dataene som vises, er representativt gjennomsnitt ± SEM av tre uavhengige forsøk. (T-test, *, p-verdi 0,05) B) Invasion over et matrigel dekket transwell ble sammenlignet for HDF-celler behandlet som ovenfor i (A) når de utsettes for å fullføre medier, såret media, eller kondisjonert medium fra Panc-1 celler. Dataene som vises, er representativt gjennomsnitt ± SEM av tre uavhengige forsøk. (T-test, **, p-verdi 0,01) C) HDF-celler ble transfektert som beskrevet ovenfor i (A) og platet ut på Dekk belagt med Texas Rødt-merket gelatin. Representative bilder tatt via IF vises. DAPI (blå) ble anvendt for å visualisere kjerner. D) Protein lysater fra celler transfektert HDF som ovenfor i (A) ble testet for RhoA aktivitet. Hver prøve ble kjørt i triplikat i to uavhengige eksperimenter. Feilfelt angir SD. (T-test, **, p-verdi 0,01) E) proliferasjonsanalyse av HDF-celler transfektert som ovenfor i (A). Data viser gjennomsnitt ± SD for tre uavhengige brønner.
For å verifisere om Palladin-uttrykke celler var i stand til å nedbryte ekstracellulære matrise, HDF-EV, HDF-WT, og HDF-FX ble dyrket på dekk belagte med fluorescens-merket gelatin. I nærvær av såret media, ble gelatin bunting observeres og gelatin overflaten ble ødelagt av Adin-uttrykkende HDF-WT eller HDF-FX-celler, men ikke den normale foreldre HDF-EV (figur 4C). Disse destruktive endringer er mye mer dramatisk og utbredt enn normalt kan forventes med invadopodia alene. Vi lurte på om de Palladin-indusert myofibroblasts hadde økt kontraktilitet som kan føre til en «ripping» av matrisen. For å svare på dette, undersøkte vi om RhoA, et protein som er involvert i cytoskeletal bevegelse og ombygging [30], ble aktivert i Adin-uttrykke celler og fant at RhoA nivåer økte nesten to ganger (figur 4D). Dette tyder på at eksogene Adin uttrykk fremmer evne myofibroblasts både invadere og ødelegge ekstracellulære matrise (Figur 4C). Invasiv effektene av såret media og EGF på Adin-uttrykke fibroblaster var ikke på grunn av en forskjell i spredningsrater (Figur 4E).
Tidligere etterforskere har antydet at tumor-assosiert fibroblaster kan føre kreftceller gjennom ekstracellulære matrise [31]. Vi spurte om Palladin-aktiverte fibroblaster kunne passe som paradigme. For å undersøke denne hypotesen, utførte vi 3D-invasjons analyser ved hjelp av lysbilder utviklet av Bellbrook Labs (figur 5A). To sirkulære brønner ble forbundet ved hjelp av en sentral kanal rett på 1 mm x 1,8 mm. Kanalen ble fylt fortynnet fluorescerende matrigel; EGF ble tilsatt til brønnen på en side av kanalen som et lokkemiddel og HDF eller Adin-aktivert HDF ble lastet inn i motsatt brønnen. Cell invasjon inn i matrigel fylte kanalen ble vurdert til 12 timers intervaller som fibroblaster flyttet mot lokkemiddel. Etter avtale med våre Transwell invasjons analyser, Adin-aktiverte fibroblaster invadert kanalene raskere og migrert over kanalen i betydelig større antall enn kontroll fibroblaster (figur 5B). Selv med lengre tid, ingen av HDF celler uten Adin var i stand til å krysse kanalen. I motsetning til dette Adin-aktiverte fibroblaster fullstendig krysset 1 mm kanal med 72 timer, noe som skaper tunneler som ble brukt av andre aktiverte fibroblaster som fulgte etter. De sorte tunneler skapt av de Adin-aktiverte fibroblaster er ganske klart i det fluorescerende-røde kanal i 3D-invasjon kammeret (figur 5C). I tillegg til den omfattende tunnele skapt av de Adin-aktiverte fibroblaster mot tiltreknings de Adin-inneholdende celler viste seg å ha bedre retningsbestemt bevegelse mot EGF tiltreknings enn kontrollcellene (figur 5B); sistnevnte ofte sirkler tilbake til hjem godt der de startet.
A) Skjematisk av 3-D invasjonen analysen viser Texas Red merket gelatin /matrigel blanding i kanalen med 5 ng /ml EGF som lokkemiddel i venstre port og celler (HDF ± Adin merket med QTracker 585 med eller uten Panc-1 merket med QTracker655) sådd inn i riktig port. Celle bevegelse ble evaluert som celler krysset kanalen (høyre mot venstre retningsbevegelse) ved hjelp av konfokal mikroskopi. B) Palladin-aktiverte fibroblaster (grønn) invaderer videre inn i den røde matrigel kanal på alle tidspunkter testet (24 og 72 timer)
(høyre panel)
forhold til HDF med EV
(venstre panel)
. Representative bilder tatt med konfokalmikroskopi vises. Linjene indikerer 100 mikrometer. C) Den gule eske region er vist ved høyere forstørrelse til høyre.
toppen
, Red matrigel er ensartet i den tomme kanal før invasjonen.
midten
, Adin-aktiverte fibroblaster (grønn fluorescens utslipps) opprettet svarte tunneler (blottet for Texas Red signal, se pil) i matrisen.
Bottom
, fibroblaster (hvit phalloidin beis) kan flytte enkelt fil gjennom tunneler. Vist er representative bilder som er tatt med konfokalmikroskopi. Linjene indikerer 50 mikrometer. D) Panc-1 celler (rosa, se pilspisser) følger Adin-aktiverte fibroblaster (hvite) gjennom kanalen, mens de ikke følger den HDF-EV. Vist er representative bilder som er tatt med konfokalmikroskopi 72 timer etter at co-kultur. Kanaler ble fiksert og farget med DAPI.
Panc-1 celler ble tilsatt en dag etter at fibroblaster for å vurdere om disse epitelceller vil gjøre bruk av tunneler tidligere skapt av invaderende fibroblaster. Ja, vi var i stand til å identifisere Panc-1 celler etter de Palladin-aktivert fibroblast celler gjennom tunneler (figur 5D). Palladin-aktiverte fibroblaster hadde en direkte innflytelse på atferd og utseende på Panc-1 kreft i bukspyttkjertelen epitelceller. Etter co-kulturen i Panc-1 og Palladin-aktiverte fibroblaster celler i hjemmet godt av 3D-invasjons lysbilder, de Panc-1 kreft celler migrert en mye lengre distanse noen helt krysset kanal- mens kontrollgruppen Palladin fritt co -cultures avslørte Panc-1 celler knapt å forlate hjemmet godt. I tillegg, i nærvær av Palladin-aktiverte fibroblaster, de Panc-1 celler utviklet en langstrakt utseende (figur 5D).
Palladin fremmer invasjon gjennom utvikling av invadopodia fylt med matrix-ødelegge enzymer
for å avdekke mekanismen bak den invasiv evne til Palladin-uttrykke fibroblaster, undersøkte vi de «føtter» av Adin-aktivert fibroblaster, som var blitt mer fremtredende med overgangen til myofibroblasts (Figur 3B). HDF, transfektert med og uten Adin, ble sådd ut på Matrigel-belagte transwells. Selv om porestørrelsen i transwell var for liten for en hel celle til å gå igjennom, kan det imøtekomme podosomes, som måtte trenge inn i første Matrigel laget (figur 6A). De invadopodia /podosomes som invaderte gjennom matrise dekket porene ble kuttet fra cellen kroppen med en barberhøvel. Merket kvantitativ proteomikk analyse ble brukt for å sammenligne proteinene i «føtter» fra Adin-uttrykke fibroblaster i forhold til de «føtter» fra de vanlige foreldre fibroblaster. Proteomikk analyse viste at over 200 proteiner ble dysregulerte ved ≥1.5 fold i «føtter» av Adin-uttrykkende fibroblaster i forhold til de av merkede kontrollceller. Disse feilregulert proteiner inkludert invadopodia proteiner [30], [32], [33], ras relaterte og GTP bindende proteiner og proteolytiske enzymer, (utvalgte proteiner, se figur 6B, for fullstendig liste, se tabell S2). Vi var spesielt interessert i invadopodia proteiner, inkludert cortactin, filamin A, beta-inte 1, vinculin, profilin, alfa-actinin, og cofilin [32], [33]. Nesten halvparten av de oppregulert proteiner identifisert i vår proteomikk analyse ble nylig rapportert som nye invadopodia komponenter [34].
A) Undersiden av en tre mikrometer transwell viser podosomes /invadopodia fra en HDF-WT fibroblast som har invadert gjennom matrigel via IF. De «føtter» ble kuttet med en barberhøvel for proteomikk analyse. B) HDF celler transfektert med GFP-tom vektor (EV) eller GFP-hvete Adin (WT) ble undersøkt med phalloidin farging via IF. Palladin-uttrykker fibroblaster har lineære fremspring (
pilspisser
) fylt med proteaser og lysozym som Cathepsin D. Vist er representative bilder. C) proteomikk analyse av «føtter» avslører overekspresjon av proteolytiske enzymer, Rho aktiveringsproteiner, og verifiserer nærværet av proteiner som tidligere er identifisert i invadopodia. Vist er protein prosenter fra fibroblaster med WT eller FX Adin i forhold til tom vektor. Se også Tabell S2. D) HDF celler transfektert med villtype Palladin ble dyrket på Matrigel dekket Dekk. Erosive degradert spor ble oppdaget via elektronmikroskopi. Linjen viser en mikrometer.
Kvantitativ proteomikk analyse viste oppregulering av den Adin-bindende protein, alfa-actinin som er en annen invadopodia-relatert protein som har blitt assosiert med dårlig prognose i ovarie og bukspyttkjertel [ ,,,0],35], [36]. Den markerte økningen av alfa-actinin i stroma av kreft i bukspyttkjertelen og pre-kreft ble validert av IHC (figur S1). Validering av økt uttrykk av valgt invadopodia proteiner -cofilin, cortactin, og profilin-oppdaget av proteomikk analyse ble utført ved immunfluorescens og /eller Western blot analyse (Figur S2).
I tillegg til invadopodia proteiner, proteolytisk enzymer var også oppregulert i «føtter» av Adin-uttrykke fibroblaster inkludert ADAM22, aminopeptidaser, og cathepsin D og B (figur 6C). Immunofluorescerende farging av cathepsin D, bekreftet at proteinet blir selektivt overuttrykt i HDF-FX og WT-celler, men ikke i sperre fibroblaster med tom vektor (figur 6C). Interessant nok har cathepsin D er vist å stimulere fibroblast invasjon og utvekst, og er angivelig involvert i parakrine interaksjoner mellom tumor epitel og fibroblaster [37]. I tillegg til uttrykk av proteolytiske og matriks-proteiner remodeling, er tydelig ved elektronmikroskopi (figur 6D).
Adin blir oppregulert i fibroblaster ved ødeleggelsen av Matrigel av Adin-uttrykkende HDF-WT celler tilstøtende k-ras aktivert epitelceller
Palladin er vanligvis ikke mutert i sporadisk kreft i bukspyttkjertelen (data ikke vist) eller i familiære bukspyttkjertel kreft, annet enn Family X [38] – [41]. Likevel ekspresjon av 90 kD Adin har blitt rapportert i fibroblaster som er omgitt pankreatisk dysplastisk eller kreft ductal celler i 96% av pankreas cancer, mens fibroblaster som omgir normale ductal cellene ikke [12], [23] (figur 1). Vi antok at parakrin signalering mellom kreft epitelceller og fibroblaster var sannsynligvis ansvarlig for oppregulering av Adin ekspresjon i fibroblaster, til slutt gjøre dem til tumorassosierte myofibroblasts. For å teste denne hypotesen, normale humane fibroblaster samtidig var dyrket i et transwell med immortaliserte normale bukspyttkjertelen duktale celler (HPDE celler) og med bukspyttkjertelen ductal kreftcellelinjer som har k-ras mutasjoner (MiaPaCa og Panc-1). Etter dag 5 av co-kultur, Palladin ble oppregulert i fibroblaster ved siden begge bukspyttkjertelkreft duktale cellelinjer (figur 7a). Til sammenligning hadde normale fibroblaster som var ved siden av normale pancreatic ductal celler ikke uttrykke Adin (figur 7B).
A) HDF celler ble undersøkt for Adin uttrykk via IF etter samtidig kultur med kreft i bukspyttkjertelen cellelinjer, MiaPaCa eller Panc-1, i 7 dager. TGFβ1 er vist som en positiv kontroll for opp-regulering Adin i normale fibroblaster, ingen epitelceller er den negative kontroll. Skala barer indikerer 20 mikrometer. B) HDF-celler ble undersøkt for α-SMA eller Adin uttrykk via IF følgende ko-kultur med normal pankreasgang epitelceller (HPDE) som var narretransfekterte eller transfektert med villtype eller mutante K-ras. Skala barer indikerer 20 mikrometer.
Neste vi lurte på hva var signalet fra kreftcellene som ville opp-regulerer Adin i tilstøtende fibroblaster? I lys av våre data viser det tidligste tidspunktet kurs for oppregulering av Palladin i peri-tumoral fibroblaster oppstår ved lavgradig dysplasi (kjent som Panin 2 i bukspyttkjertelen), hypotese vi at Palladin regulering må skje relativt tidlig i tumorigenesis . K-ras-mutasjoner er allestedsnærværende i bukspyttkjertelkreft: til stede i både kreft og pre-kreft ductal celler [42]. Fordi Palladin over-uttrykk er nevnt i myofibroblasts rett mot forstadier til kreft duktale celler (figur 1), vi spekulerte på om k-ras aktivering alene duktale celler var tilstrekkelig til å forårsake oppregulering av 90 kD Adin i nabo normale fibroblaster . En tilsvarende co-kulturen eksperiment ved hjelp av transwells ble utviklet med de normale fibroblaster i det nedre kammer; det øvre kammer inneholdt normale pankreas ductal epitelceller (HPDE) transfektert med vill-type K-ras, muterte K-ras, eller et tom-vektor. Ekspresjon av enten constituently aktivert villtype
eller
muterte K-ras i HPDE-celler var tilstrekkelig til å bevirke at opp-regulering av Adin og α-SMA i de tilstøtende normale fibroblaster (figur 7B). Verken Palladin eller α-SMA uttrykk ble økt ved co-kultur med foreldre pancreatic ductal celler (HPDE) transfektert med en tom vektor.
oppregulering av α-SMA og Palladin i fibroblaster av de tilstøtende kreftceller hindres av stanse på 90 kD Adin
for å finne ut om ras-indusert transformasjon av fibroblaster inn myofibroblasts støttet seg på en Adin avhengig vei, vi utnyttet shRNA å generere stabile kloner av HDF med Palladin knockdown og deretter målt Adin og α-SMA produksjon etter 9 dager med co-kultur av de normale fibroblaster med kreft i bukspyttkjertelen cellelinje, Panc-1. Vi klarte ikke å påvise α-SMA-ekspresjon ved RT-PCR etter ko-kultur av HDF-celler stabilt transfektert med en hvilken som helst av tre distinkte shRNA-konstruksjoner rettet mot 90 kD Adin (figur 8A; data ikke vist). Imidlertid oppregulering av α-SMA ble observert ved ko-kultur med Panc-1 celler hvis HDF-celler ble transfektert med en styre shRNA plasmid eller i ubehandlede celler HDF. Det var også en funksjonell konsekvens å stanse Adin i fibroblaster, som demonstrert av migrasjon og invasjon analyser (Tall 8B 8C). Palladin stanse redusert de funksjonene som tidligere knyttet til myofibroblast fenotype. Sammen disse funnene tyder på at ductal celler som inneholder aktivert k-ras er tilstrekkelig til å opp-regulere Adin uttrykk i tilstøtende fibroblaster gjennom parakrint signalering. Dette i sin tur fører til at fibroblast å forvandle seg til en myofibroblast. Komplett stanse av Adin opphever prosessen.
a) HDF celler ble stabilt transfektert med kontroll shRNA (C) eller shRNA mot 90 kD Adin (Pal shRNA). a-SMA uttrykket etter co-kulturen med Panc-1 celler ble analysert via RT-PCR. Analyse av ubehandlet HDF (U) er vist for sammenligning. Den første kjørefelt er en ikke-mal negativ kontroll; GAPDH vises som en intern lasting kontroll. Vist er data fra en representant shRNA stabil klone (av tre uavhengige shRNA konstruksjoner testet). B) Invasion over et matrigel belagt transwell ble sammenlignet for HDF transfektert som i (A). Vist er gjennomsnitt ± SD. Vist er data fra en representant shRNA stabil klone (av tre shRNA konstruksjoner testet). C) HDF celler som i (A) ble dyrket til konfluens på Dekk og såret med scratch test. Migrasjon ble vurdert gjennom IF 24 timer etter såret. Minst 3 observasjoner for hver tilstand ble analysert. Blå = DAPI. Vist er data fra en representant shRNA stabil klone (av tre shRNA konstruksjoner testet).
mutert Adin (FX) overfører noen forskjeller i proteinuttrykk og atferd i fibroblaster sammenlignet med villtype Adin (WT)
av flere grunner, vi inkludert i disse forsøkene studiet av P239S mutasjon i et høyt konservert område på 90 kD Adin som forårsaker en sjelden form for autosomal dominant familiær kreft i bukspyttkjertelen. Hvordan kunne feilregulering av en cytoskeletal protein i peri-tumoral fibroblaster disponere for en slik dødelig, svært penetrant kreft? I disse studiene, fant vi at FX Palladin uttrykker fibroblaster var betydelig mer omfattende enn fibroblaster som inneholder vill-type Adin. I tillegg kvantitativ proteom analyse påvist uttrykk av 88 proteiner som er unike for HDF-FX (tabell S2) og ikke oppdaget i HDF-WT.
