Abstract
Magekreft er en av de vanligste årsakene til kreft relatert dødelighet på verdensbasis. Uttrykk for tumor suppressor, promyelocytic leukemi (PML) protein, er redusert eller avskaffet i mage karsinom, i forbindelse med økt nivå av lymfatisk invasjon, utvikling av høyere pTNM iscenesettelse, og ugunstig prognose. Heri, undersøkte vi forholdet mellom graden av tumor-infiltrerende lymfocytter og status for PML protein ekspresjon i avansert gastrisk karsinom. Vi har observert høyere antall av infiltrerende T-celler i mage-karsinom vev hvori PML-ekspresjon ble redusert eller opphevet, sammenlignet med vev positive for PML. Omfanget av T-cellemigrering mot kultur-supernatanter erholdt fra interferon-gamma (IFN-γ-stimulert gastrisk karsinom-cellelinjer ble også påvirket av ekspresjon av PML
in vitro
. Interferon-gamma-induserbar protein 10 (IP- -10 /CXCL10) uttrykk ble økt i magekreft vev viser reduserte PML nivåer. Videre, både
PML
knockout og knockdown celler vises forbedret IP-10 mRNA og protein uttrykk i nærvær av IFN-γ. PML knockdown øket IFN-γ-mediert signal Svinger og aktivator av transkripsjon-1 (STAT-1) binding til IP-10-promoteren, noe som resulterer i forhøyet transkripsjon av IP-10-genet. Omvendt, PML IV protein ekspresjon trykkes IP-10-promoteren aktivering . Basert på disse resultatene, foreslår vi at tap av PML protein uttrykk i magekreftceller bidrar til økt IP-10 transkripsjon
via
forbedring av STAT-en aktivitet, som i sin tur fremmer lymfocytt menneskehandel innenfor kreft regioner .
Citation: Kim HJ, Song DE, Lim SY, Lee SH, Kang JL, Lee SJ, et al. (2011) Tap av Promyelocytic Leukemi Protein i Gastric Cancer: Konsekvenser for IP-10 Expression og Tumor-infiltrerende lymfocytter. PLoS ONE 6 (10): e26264. doi: 10,1371 /journal.pone.0026264
Redaktør: Yoshio Yamaoka, Veterans Affairs Medical Center (111D), USA
mottatt: 21 april 2011; Godkjent: 23 september 2011; Publisert: 12 oktober 2011
Copyright: © 2011 Kim et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Basic Science Research Program gjennom National Research Foundation of Korea (NRF) finansiert av departementet for utdanning, vitenskap og teknologi (2010-0015506) til Y-HC, ved National Research Foundation of Korea (NRF) finansiert av Korea regjeringen (MEST) (2010-0029353) til JLK, og ved RO1 NS50665 til ENB. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Magekreft kreft~~POS=HEADCOMP er en av de hyppigste årsakene til kreftrelaterte dødsfall på verdensbasis. Nylige fremskritt innen genetikk har muliggjort påvisning av hendelser som oppstår i løpet av magekreftutvikling, inkludert aktivering av onkogener, tie av tumorsuppressorgener, og mutasjon av gener involvert i DNA-reparasjon [1]. Blant disse genetiske hendelser, er det kjent at tumor suppressor promyelocytic leukemi (PML) protein uttrykk er redusert eller avskaffet i magekreft, og at dette er forbundet med mer omfattende lymfatisk invasjon, høyere pTNM iscenesettelse, og ugunstig prognose, noe som tyder på at PML tap er knyttet til kreftutvikling og gastrisk karsinom progresjon [2]. Tidligere studier innblandet
PML
dysfunksjon i utviklingen av en rekke kreftformer, og redusert eller avskaffet uttrykk for PML er rapportert i prostata, bryst, CNS, tykktarm, lunge og mage kreft [2], [3] .
PML
genet ble opprinnelig identifisert ved fusjon med retinsyre reseptoren involvert i t (15; 17) translokasjon i forbindelse med akutt promyelocytic leukemi (APL) [4], [ ,,,0],5], [6], [7], [8]. PML er en tumor suppressor protein som regulerer cellesyklusprogresjon, gentranskripsjon, transformasjon undertrykkelse, og apoptose.
PML
knockout-mus er betydelig mer følsomme for tumordannelse etter eksponering for kreftfremkallende enn det som er villtype-kontroller, og
PML
-deficient cellene er mindre tilbøyelige til å gjennomgå apoptose etter påføring av bestemte typer cellulært stress [9]. I tillegg til rapporter med fokus på tumor suppressor rolle PML, har flere studier bekreftet at proteinet fungerer som en transkripsjonsregulator,
via
tilknytning til co-aktivator CREB-bindende protein; co-repressors inkludert HDAC, N-Cor, og mSin3A; og transkripsjonsfaktorer Nur77, AP-1, myc, p53, og STAT-1α [10], [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17].
Progressive mutasjon av og genetiske forandringer i flere tumorsuppressorgener fremme svulst utvikling og progresjon [18]. I tillegg til genetiske endringer i tumorceller, både inflammatoriske celler og mediatorer bidrar til dannelsen av bestemte tumor microenvironments [19], [20]. Tumorassosierte fibroblaster (TAFs) og makrofager (TAM) er også involvert i modulering av tumor-mikromiljøet
via
produksjon av cytokiner, kjemokiner, interferoner, og andre biologisk aktive faktorer [21], [22]. Krysstale mellom tumorceller, TAFs, TAMs, og lymfocytter, er av betydning i tumorutvikling og progresjon, og bidrar til etableringen av tumor microenvironments anriket i ekspresjon av en rekke biologisk aktive faktorer [23], [24], [25] [26], [27].
TAMs er funnet å korrelere med angiogenese og en ugunstig prognose i flere typer kreft, inkludert magekreft [22], [28]. Mastcelle produserer mange angiogene faktorer og en rekke cytokiner, og dets tetthet har blitt rapportert å høyt korrelere med graden av tumor neoangiogenesis og dårlig prognose [29], [30]. CD4
+ og CD8
+ lymfocytter er også funnet i en rekke av faste kreftvevet. Til nå har de presise molekylære mekanismer som typen og antallet tumorceller infiltrere reguleres er stort sett ukjent. Det er flere kontroversielle rapporter med hensyn til antall og funksjon av tumor-infiltrerende lymfocytter. Spesielt, CD8
+ T-lymfocytter, mens deres funksjon er kjent for å eliminere begynnende transformerte celler og bidra til immunosurveillance [31], er det rapportert at CD8
+ tumor-infiltrerende T-celler er defekte i effektorfasen funksjon ved kontakt med tumorceller [32] og deres infiltrasjon er knyttet til ugunstig prognose i visse typer kreft så som nonsmall celle lungekreft og nasofaryngeal karsinom [33], [34].
Kjemokiner utskilt av stromale celler eller tumor cellene påvirke tumorcelle-migrering, invasjon, proliferasjon, angiogenese og immuncelleinfiltrasjon i tumormassen [35]. IFN-γ-induserbart protein-10 (IP-10, CXCL10) er en av de CXC kjemokiner som spiller flere roller i inflammatoriske sykdommer og kreft [36], [37]. Siden IP-10 fortrinnsvis fremmer Th1-immunresponser ved å tiltrekke robust NK og T-cellene, er det foreslått som en av mulige mekanismer for T-celle-infiltrasjon i tumorer.
Enten tap av tumorsuppressorgener i tumorceller induserer rekruttering av lymfocytter og modulering av funksjonene til slike celler i kreft microenvironments er foreløpig uklart. I denne studien undersøkte vi PML funksjon med hensyn til rekruttering av lymfocytter og modulering av uttrykket av tumor-avledet faktorer. Ekspresjon av PML er omvendt korrelert med graden av infiltrering av CD8
+ T-celler til gastriske karsinomer. PML tap ble ytterligere assosiert med økt ekspresjon av IP-10, en av de lymfocytt-tiltrekkende CXC kjemokiner, i gastrisk karsinom celler og vev. PML knockdown fremmet IFN-γ-mediert STAT-1 binding til IP-10-promoteren, som resulterer i økt transkripsjon av IP-10 genet. Våre data understøtter ideen om at PML er involvert i rekruttering av lymfocytter inn i tumorer,
via
modulering av uttrykket nivåer av tumor-avledede faktorer, inkludert IP-10, noe som gir ytterligere bevis på at tapet av tumorsuppressorgener i tumor celler deltar aktivt i etableringen av tumor microenvironments.
Resultater
Tap av PML protein er assosiert med økt infiltrasjon av CD8
+ T-celler i avansert magekreft vev
Immunhistokjemisk farging for PML og CD8 ble utført for å undersøke om omfanget av lymfocytter infiltrasjon var assosiert med PML uttrykk status i avansert magekreft. CD8-immunopositive celler ble nummerert som beskrevet i Materialer og Metoder. I alt 35 prøver (71,4%) viste delvis til fullstendig tap av PML i tumorcellekjerner av scenen IV avanserte mage karsinom. Prøver fra 14 avanserte magekarsinom pasientene var diffust positivt for PML, og inneholdt et gjennomsnitt på 32,7 CD8
+ T-celler per felt (figur 1A). Vi identifiserte 19 tilfeller av avansert magekreft stiller samlings positivitet for PML, med et gjennomsnitt på 47,2 CD8
+ T-celler per felt. Videre ble fullstendig tap av PML observert i 16 avanserte magekreft pasienter; prøvene inneholdt et gjennomsnittlig antall CD8 52,8
+ T-celler per felt. Prøvene viser fokus positivitet eller fullstendig tap for PML viste en mer markert økning i CD8
+ T-celle nummer enn gjorde eksemplarer stille diffuse positivitet for PML. Representative bilder er vist i figur 1B. Selv om PML protein uttrykk ble redusert eller avskaffet i tumorceller, som alle normale mage slimhinnekjertlene, stromale vev og lymfoide celler, viste diffus moderat til sterk kjernekraft immunopositivity for PML.
(A) Immunhistokjemisk farging for PML protein og CD8 ble utført for 49 tilfeller av scenen IV avanserte mage karsinom. Immunopositivity for PML protein ble kategorisert som diffust positivitet (DP; atom immunreaktivitet i ≥50% av tumorcellene, n = 14), fokal positivitet (FP, i ≥10%, men 50%, n = 19), eller fullstendig tap (CL; i 10%, n = 16). Antallet CD8 immunopositive celler i en høy effekt felt (HPF, x40) på 0,25 mm
2 for fem tilfeldig valgte tumor infiltrerende grenser ble tellet for hver prøve, etterfulgt av beregningen av middelverdien og SD. (B) Representative bilder som viser PML proteinekspresjon og CD8
+ T-celle-infiltrasjon i avanserte gastrisk karsinom vev. Barer, SD. *
P
. 0,05
PML påvirkninger T-celle infiltrasjon /migrasjon
in vitro
I lys av tapet av PML proteinekspresjon og økningen i infiltrasjon av CD8
+ T-lymfocytter i avanserte gastrisk karsinom vev, hypotese vi at PML bidro til T-celleinfiltrasjon /migrasjon i magekreft. For å undersøke om PML nivået i magekreftceller påvirkes T-celle migrasjon, klimaanlegg media fra SNU-638 celler transient transfektert med enten
PML
siRNA eller PML IV uttrykk vektor, deretter behandlet med IFN-γ ble benyttet i Transwell migrasjon analyser. SNU-638 magecancerceller uttrykte høye nivåer av PML-protein, i overensstemmelse med tidligere funn [2], mens SNU-638-celler transfektert med
PML
siRNA som vises reduserte nivåer av endogen PML uttrykket (~46-56%) , som bekreftet av immunoblotting (figur 2A). IFN-γ induserte en beskjeden økning i PML protein uttrykk, i samsvar med tidligere resultater [38]. Migrering av Jurkat T-celler mot kondisjonert medium fra
PML
siRNA-transfekterte SNU-638-celler ble betydelig forbedret, sammenlignet med den for kontroll siRNA-transfekterte celler etter behandling med IFN-γ (figur 2B). Ved transfeksjon av SNU-638 med PML IV ekspresjonsvektor, migrering av Jurkat T-celler mot kondisjonert medium fra PML IV overuttrykt-celler ble redusert sammenlignet med tom vektor (figur 2C). Disse resultater antyder at PML regulerer nivåene av sekretoriske molekyler som produseres av og slippes ut fra IFN-γ-stimulerte magekreftceller, og påvirker også migreringen av T- lymfocytter.
(A) SNU-638 magekreftcellene ble transient transfektert med
PML
siRNA eller kontrollere siRNA. To dager etter transfeksjon ble cellene behandlet med eller uten interferon-gamma (IFN-γ (10 ng /ml) i 8 timer og lysert og analysert ved immunblotting. Effektiv siRNA-mediert undertrykkelse av PML-protein-ekspresjon ble bekreftet for hver analyse ved immunblotting . (B) Jurkat celler og kultursupernatantene fra SNU-638-celler som var forbigående transfisert med enten kontroll siRNA eller
PML
siRNA ble analysert ved hjelp av en transwell migrasjonsanalyse. etter transfeksjon, SNU-638-celler ble inkubert med IFN -γ (10 ng /ml) i 8 timer eller forblir ubehandlet, og de oppsamlede supernatanter ble plassert i de nedre kamre. de øvre kamrene mottatt 5 x 10
5 Jurkat-celler i et volum på 100 ul og de transwell migrasjonsenheter ble inkubert ved 37 ° C i 2 timer. migrering av Jurkat-celler fra det øvre til det nedre kammer ble analysert ved å undersøke celler høstet fra de nedre kamre av fluorescerende telle-vulst medierte telling på et strømningscytometer. Relativ cellemigrering ble bestemt ved antall av migrerte celler normalisert til antallet celler som migrerer til supernatantene fra SNU-638-celler transient transfektert med kontroll siRNA uten IFN-γ, og verdien fra parentale celler ble vilkårlig satt til 1. (C) SNU-638 magekreftceller ble midlertidig transfektert med enten tom vektor (Mock) eller PML IV ekspresjonsvektor (PML IV). Dag etter transfeksjon ble cellene behandlet med eller uten IFN-γ (10 ng /ml) i 8 timer, og kultursupernatanter ble oppnådd og underkastet transwell migrasjon analyse som beskrevet i B. PML-protein-ekspresjon ble bekreftet for hver analyse ved immunblotting. Dataene som vises, er representative for minst tre forsøk. Barer, SD. *
P
. 0,05
Tap av PML øker IFN-γ-indusert IP-10 uttrykk
Kjemokiner, en familie av kjemotaktiske cytokiner, fremme migrasjon av sirkulerende leukocytter /lymfocytter til steder med inflammasjon og skade. For å undersøke om chemokin nivåene ble påvirket av
PML
genetisk status, chemokine genuttrykk ble undersøkt ved hjelp av ribonuklease beskyttelsestest (RPA).
PML
+ /+ og
PML
– /- mus embryonale fibroblast (MEF) celler ble inkubert i fravær eller nærvær av IFN-γ for 0-24 timer , total mRNA ble oppsamlet ved forskjellige tidspunkter og underkastet RPA. I
PML
– /- MEFs, IP-10 mRNA nivåer økt 1,5 ganger på to timer, og ble markert forhøyet (8 ganger) etter 4 h (figur 3A). RANTES mRNA nivåene ble øket 3,2 ganger i 0,5 timer, og forble forhøyet, men i en lavere grad (1,3 ganger), 8 timer etter IFN-behandling γ in
PML
– /- MEFs . Andre chemokin gener, inkludert MIP-1, MIP-2, og MCP-1, ble ikke påviselig uttrykt i
PML
+ /+ eller
PML
– /- MEFs (data ikke vist). STAT-1 uttrykk ble økt etter eksponering for IFN-γ i begge celletyper, men ingen forskjell var tydelig når IFN-y-nivåene ble sammenlignet mellom
PML
+ /+ og
PML
– /- celler. Som transkripsjon av IP-10-genet ble vesentlig forhøyet i IFN-γ-stimulert
PML
– /- MEFs, vi målte relevante proteinnivåer i kultursupernatanter av
PML
+ /+ og
PML
– /- MEFs, ved hjelp av en enzymbundet immunosorbent assay (ELISA). I samsvar med RPA resultater, høyere nivåer av IP-10 protein var tydelig i kondisjonert medium fra IFN-γ-behandlet
PML
– /- MEFs (figur 3B). Også, IP-10-mRNA-ekspresjon i
PML
siRNA-transfekterte NIH3T3-celler ble forbedret, sammenlignet med kontroll siRNA-transfekterte celler, etter IFN-γ behandling (figur 3C). Reduksjonen i uttrykket av PML protein i
PML
siRNA-transfekterte NIH3T3 celler ble bekreftet av immunoblotting
-. /- MEFs sammenlignet med
PML
+ /+
villtype-celler. (A) RNA fra
PML
+ /+ og PML
– /- MEFs som ble behandlet med IFN-γ (10 ng /ml) i 0-24 timer ble utsatt for ribonuklease beskyttelsestest ( RPA). Kvantifisering av IP-10, RANTES og STAT-1 mRNA (gangers økning) ble beregnet ved å dividere densitometrisk verdien for hver bane av den tilsvarende GAPDH verdi. (B)
PML
+ /+
og
PML
– /- MEFs cellene ble inkubert i fravær eller nærvær av IFN-γ (10 ng /ml) i 12 timer. IP-10 protein fra kultursupernatantene ble analysert ved hjelp av ELISA og normalisert ved celleproteinkonsentrasjon. Den relative konsentrasjonen ble beregnet som den normaliserte beløp dividert med den normaliserte mengden av ubehandlet
PML
– /- MEFs celler. (C) NIH3T3 fibroblaster ble transient transfektert med enten
PML
siRNA eller kontrollere siRNA. To dager etter transfeksjon ble cellene behandlet med eller uten IFN-γ i 0-24 timer, og analysert ved immunblotting for påvisning av PML proteinekspresjon og RT-PCR for IP-10 mRNA. Kvantifisering (Quant) av IP-10 mRNA ble beregnet ved å dividere densitometrisk verdien for hver bane av den tilsvarende aktin mRNA verdi. Dataene som vises, er representative for minst tre forsøk. Barer, SD. *
P
. 0,01
Redusert PML uttrykk er omvendt korrelert med IP-10 proteinnivået i magekreft vev og SNU-638 celler
Neste, vi undersøkt forholdet mellom IP-10 og PML protein uttrykk i avansert magekreft vev. Cancer vev ble farget for immunhistokjemisk PML og IP-10, og intensiteten av IP-10 immunopositivity ble målt som beskrevet i materialer og metoder. Den gjennomsnittlige intensiteten av IP-10 var 1,2 i 14 prøvene som viser diffus positivitet (DP) for PML, 2,2 i 19 tilfeller av fokal positivitet (FP), og 2,0 i 16 prøver hvor det ikke var fullstendig tap (CL) av PML uttrykket ( 4A, venstre panel). Signifikant økning i IP-10 uttrykk ble observert i prøvene viser fokus positivitet av PML (
P
= 0,034), sammenlignet med dem som viser diffuse positive PML uttrykk. Det ble observert en økning i IP-10 uttrykk når fullstendig tap av PML var tydelig, sammenlignet med hva som ble notert når PML var diffust uttrykk; Men denne forskjellen ikke statistisk signifikant. Representative eksempler på variasjoner i PML protein status som korrelerte med ulike IP-10 uttrykk nivåer i kreftceller fra avanserte mage karsinom er vist (figur 4A, høyre). For ytterligere å undersøke forholdet mellom IP-10 og PML protein ekspresjon i gastrisk karsinom-cellelinjer, IP-10-proteinnivåer ble målt i kultursupernatantene fra SNU-638-celler transient transfektert med enten
PML
siRNA eller PML IV exression vektor. Celler ble dyrket i fravær eller nærvær av IFN-γ i 8 timer ble supernatanter oppsamlet, og IP-10 nivåer kvantifisert deri (ved ELISA). IFN-γ-indusert IP-10-sekresjon ble betydelig forbedret i SNU-638-
PML
siRNA-transfekterte celler, sammenlignet med den av SNU-638-celler transfektert med kontroll siRNA (figur 4B). Transfeksjon av SNU-638 med PML IV ekspresjonsvektor trykkes IFN-γ-indusert IP-10-sekresjon (figur 4C). Resultatene viser klart at sekresjon av IP-10 fra magekreftceller blir øket når PML ekspresjon blir redusert.
(A) Immunohistokjemisk farging av PML og IP-10 protein ekspresjon ble utført i 49 tilfeller av stadium IV avansert mage karsinom. Immunopositivity for PML protein ble kategorisert som diffust positivitet (DP; atom immunreaktivitet i ≥50% av tumorceller), fokal positivitet (FP, i ≥10%, men 50%), eller fullstendig tap (CL; i 10% ). For kvantitativ analyse av immunoreaktivitet av IP-10, positivt fargede områder ble målt ved anvendelse av et ImageJ program som beskrevet i Materialer og Metoder. Representative bildene viser PML og IP-10 protein uttrykk i avanserte magekreft vev (til høyre). (B) SNU-638 celler ble transient transfektert med
PML
siRNA eller kontrollere siRNA. To dager etter transfeksjon ble cellene inkubert i fravær eller nærvær av IFN-γ (10 ng /ml) i 8 timer. IP-10 protein fra kultursupernatantene ble analysert ved hjelp av ELISA og normalisert ved celleproteinkonsentrasjon. Den relative konsentrasjonen ble beregnet som den normaliserte beløp dividert med den normaliserte mengden av SNU-638-celler som ble transient transfektert med kontroll-siRNA i nærvær av IFN-γ, og konsentrasjonen av parentale celler ble vilkårlig satt til 100%. (C) SNU-638 gastrisk kreft celler ble transient transfektert med enten tom vektor eller PML IV ekspresjonsvektor. Dag etter transfeksjon ble cellene behandlet med eller uten IFN-γ (10 ng /ml) i 8 timer, og kultursupernatanter ble oppnådd og underkastet ELISA som beskrevet i B. PML-protein-ekspresjon ble bekreftet for hver analyse ved immunblotting. Dataene som vises, er representative for minst tre forsøk. Barer, SD. *
P
0,05, **
P
. 0,01
IP-10 nøytralisering reduserer migrering av T-celler
som SNU-638-
PML
siRNA-inneholdende celler som uttrykker reduserte nivåer av PML-proteinet viste forbedring av T-celle-rekruttering og IP-10 som respons på IFN-γ (figurene 2 og 4), vi neste undersøkt hvorvidt en økning i IP-10 nivåer lettes T-cellemigrasjon mot kondisjonert medium fra SNU-638 magekreftceller stimulert med IFN-γ. SNU-638-
PML
siRNA-celler ble dyrket i fravær eller nærvær av IFN-γ i 8 timer, og de oppsamlede supernatantene ble forbehandlet med et anti-IP-10-nøytraliserende antistoff eller kontrollere ikke-spesifikk IgG i 1 time før begynnelsen av transwell analysen. Nøytraliserende antistoff eller IgG-holdige supernatanter ble plassert i de nedre kamre, og migrering av Jurkat-celler fra øvre til nedre kammer ble analysert ved å undersøke celler høstet fra de nedre kamre. Inkludering av IP-10-nøytraliserende antistoffer hemmet Jurkat T-celle migrasjon mot kondisjonert medium fra SNU-638-
PML
siRNA celler (figur 5A). Disse funnene er i samsvar med data fra NIH3T3 celler; IP-10-nøytraliserende antistoff hemmet EL-4 T-celle migrasjon mot kondisjonert medium fra NIH3T3-
PML
siRNA celler (figur 5B).
(A) SNU-638-
PML
siRNA-celler ble dyrket i fravær eller nærvær av IFN-γ (10 ng /ml) i 8 timer, og supernatanten ble oppsamlet og forbehandlet med IP-10-nøytraliserende antistoff (5 pg /ml) eller IgG (5 mikrogram /ml) i 1 time før oppstart av transwell migrasjon analysen. Antallet trekkende Jurkat-celler oppnådd fra det nedre kammer ble analysert ved hjelp av fluorescerende telle-vulst mediert telling på et strømningscytometer. (B) Transwell migrering av EL-4-celler i kultur-supernatanter fra NIH3T3-celler transient transfektert med
PML
siRNA i nærvær av nøytraliserende IP-10-antistoff eller kontroll-IgG. Relativ cellemigrering ble bestemt ved antallet av de migrerte celler dividert med antall celler som migrerer til supernatanter uten IFN-γ, og verdien fra parentale celler ble vilkårlig satt til 1. De viste data er representative for minst tre forsøk. Barer, SD. *
P
. 0,05
PML knockdown forbedrer IP-10 promoter aktivering
Som IP-10 uttrykk ble økt i PML knockdown celler, vi videre utforsket om PML protein uttrykk påvirket IP-10 promoter aktivitet. Muse IP-10 promoter inneholder en antatt GAS-lignende element som ligger mellom nts -246 og -238 (TTN
5AA) (Figur 6A). Vi har tidligere rapportert at PML regulerer transkripsjonen aktivitet av STAT-1 [17] negativt. For å finne ut om PML påvirket IFN-γ-indusert IP-10 genekspresjon
via
en mekanisme som involverer STAT-en, vi isolert og genererte en reporter konstruere starter i posisjon -330 av murine IP-10 promoter inneholder formodede GAS lignende element, som beskrevet i Materialer og Metoder. IP-10-
luc
reporter inneholder gasslignende element ble transient transfektert inn i NIH3T3-celler inkubert med eller uten IFN-γ i 24 timer, og deretter analysert for luciferase-aktivitet. IFN-γ-indusert IP-10 promoter-aktivitet ble betydelig forbedret i NIH3T3-celler transfektert med
PML
siRNA, sammenlignet med celler som fikk kontroll siRNA (figur 6B). Ved transfeksjon av NIH3T3-celler med PML IV ekspresjonsvektoren, ble IFN-γ-indusert IP-10-promoteren aktivering betydelig undertrykt. Nedregulering av PML uttrykk ved hjelp av
PML
siRNA og overekspresjon av PML ved PML IV ekspresjonsvektor ble verifisert av immunoblotting. For å avgjøre om den hemmende effekten av PML på IFN-γ-indusert IP-10 promoter aktivitet skjedde i magekreftcellelinjer utførte vi lignende eksperimenter med SNU-638 mage kreftceller. Mønstre av økning og reduksjon av luciferaseaktiviteten i SNU-638 var lik den for NIH3T3 celler (figur 6C). Nivået av PML protein ekspresjon i SNU-638-celler transfektert med enten
PML
siRNA eller PML IV ekspresjonsvektor ble bekreftet ved immunblotting (data ikke vist).
(A) den murine IP- 10 promoteren inneholder et antatt GAS lignende element (understreket). (B) NIH3T3-celler ble ko-transfektert med IP-10-luc reporter inneholdende en gass-lignende element og /eller
PML
siRNA, eller PML IV proteinet ekspresjonsvektor. Celler var enten ubehandlet eller behandlet med muse-IFN-γ (10 ng /ml) i 24 timer, og deretter luciferase-aktiviteten ble bestemt. Den pCMV-β-galaktosidase vektor ble inkludert for å normalisere transfeksjonseffektivitet. Luciferaseaktiviteten er normalisert til aktiviteten i fravær av IFN-γ og aktiviteten fra parentale celler ble vilkårlig satt til 100% (RLA; relativ luciferaseaktivitet). Økt eller redusert PML protein uttrykk i cellelysatene transfektert med enten PML IV ekspresjonsvektor eller
PML
siRNA ble verifisert ved immunoblotting, henholdsvis. (C) SNU-638 magecancerceller ble ko-transfektert med IP-10-luc reporter inneholdende en gass-lignende element og /eller
PML
siRNA, eller PML IV protein ekspresjonsvektor og analysert som beskrevet i B. Verdiene er gjennomsnittet ± SD for tre separate eksperimenter. Barer, SD. *
P
0,05, **
P
. 0,001
PML knockdown øker IFN-γ-indusert STAT-en DNA binding til IP -10 promoter
effekten av PML på IFN-γ-indusert STAT-en DNA binding til IP-10 promoter ble videre undersøkt. PML protein overekspresjon i NIH3T3-celler, etter transient transfeksjon med PML IV ekspresjonsvektoren, delvis blokkerte IFN-γ-indusert STAT-1-DNA-binding til den IP-10-promoteren, innbefattende sekvensen ved -246 til -238 (figur 7A, sammenlign kolonnene 3 og 5). Konkurranse ved hjelp av en 100-molart overskudd av umerket oligonukleotid som koder for den IP-10-promoteren avskaffet kompleksdannelse (felt 6). Nivåene av PML og STAT-1 protein uttrykk i hel-cellelysater (WCL) og omfanget av STAT-en tyrosinfosforylering i kjerneekstrakter (NE) ble verifisert av immunoblotting. Utnytte NE fra NIH3T3-
PML
siRNA-celler ble oppnådd etter 0,5 timer av IFN-γ behandling, sterk binding til muse-IP-10-promoteren ble observert (figur 7B, toppanelet, spor 5), sammenlignet med binding sett i NIH3T3-kontroll siRNA-celler (søyle 3). De samme NE ble utsatt for STAT-en konsensus oligonukleotid, og STAT-en DNA-binding ble forsterket i NE fra NIH3T3-
PML
siRNA celler (figur 7B, midtpanelet, sammenlign spor 3 og 5). Ved hjelp av SNU-638 magekreftceller, fant vi også at STAT-1 DNA-binding av
PML
siRNA-transfekterte SNU-638-celler ble forbedret sammenlignet med den for kontroll siRNA-transfekterte celler etter behandling med IFN-γ (figur 7C, sammenlign spor 3 og 5). Disse data indikerer at PML delvis inhiberer STAT-1 binding til IP-10-promoteren, og at denne effekten er korrelert med øket IFN-γ-indusert IP-10 transkripsjon i fravær av PML.
(A) nukleære ekstrakter (NE) fra NIH3T3-celler transient transfektert med PML IV protein ekspresjonsvektor og som ble behandlet med IFN-γ (10 ng /ml) i 30 min ble inkubert i nærvær av en radiomerket DNA-probe inneholdende GAS-lignende element av IP-10-promoteren, og underkastet elektroforetisk mobilitet skift analyse (EMSA). Forskjøvet probe-proteinkomplekser er indikert med pilen. Økt PML protein ekspresjon i hel-cellelysater (WCL) transfektert med PML IV ekspresjonsvektor ble verifisert ved immunoblotting. Mengden av histon i NE er vist som en kontroll. (B) NE fra NIH3T3-celler transient transfektert med enten
PML
siRNA eller kontrollere siRNA og behandlet med IFN-γ (10 ng /ml) i 30 min ble inkubert i nærvær av radioaktivt merkede DNA-prober inneholdende gass- som del av IP-10-promoteren eller et STAT-1-konsensussekvensen, og deretter underkastet EMSA. Bindingsspesifisiteten ble testet ved å tilsette økende konsentrasjoner av kald probe (konkurrent). Effektiv siRNA-mediert undertrykkelse av PML-protein-ekspresjon ble bekreftet for hver analyse ved immunblotting. (C) SNU-638 gastrisk kreft celler ble transient transfektert med enten
PML
siRNA eller kontrollere siRNA og behandlet med IFN-γ (10 ng /ml) i 30 min. NE ble oppnådd, inkubert i nærvær av radioaktivt merkede DNA-prober inneholdende en STAT-1-konsensussekvensen, og deretter analysert for EMSA som beskrevet i B. Nivåene av PML og STAT-1-protein ekspresjon i WCL og omfanget av STAT-1 tyrosine fosforylering i NE ble verifisert av immunoblotting. Dataene som vises, er representative for minst tre forsøk.
diskusjon
histopatologiske studier har vist at den inflammatoriske mikromiljøet av tumorer er kjennetegnet ved tilstedeværelsen av mononukleære celleinfiltrater, både i bære stroma og kreft regioner. Men de nøyaktige mekanismene som mononukleære celler infiltrere og opprettholdes innenfor kreft vev er foreløpig ikke fullt ut forstått. I denne studien har vi bevis for at tap av uttrykk av svulst suppressor protein, PML, bidrar til forbedring av lymfocytter infiltrasjon i magekreft vev,
via
regulering av IP-10 uttrykk.
Vi undersøkte funksjon av PML med hensyn til lymfocytt rekruttering ved hjelp av humane mage kreft vevsprøver,
PML
+ /+ og
PML
– /- MEFs, og PML knockdown i både NIH3T3 og SNU-638 celler. Data fra både menneskelig vev tester og transwell migrasjon analysene viste at tap av PML fremmer lymfocytt menneskehandel; derfor søkte vi mekanismer som kan muligens forklare disse observasjonene. Vi viser at en økning i IP-10 nivåer i kreftceller som uttrykker lave nivåer av PML bidrar til lymfocytt rekruttering.
