Abstract
Enhancer av Zeste 2 (EZH2) protein har blitt rapportert å stimulere cellevekst i enkelte kreftformer og vurderes derfor å representere et interessant nytt mål for terapeutisk intervensjon. Her undersøkte vi en mulig rolle EZH2 for vekstkontroll av tykktarmskreftceller. RNA interferens (RNAi) -mediert intracellulær EZH2 uttømming førte til cellesyklus arrest av colon carcinoma celler i G1 /S overgang. Dette ble assosiert med en reduksjon av celletall ved transient transfeksjon av syntetisk
EZH2
for målretting sirnas og med hemming av deres kolonidannelse kapasitet på stabil uttrykk for vektorbårne sirnas. Vi dessuten testet om EZH2 kan undertrykke den veksthemmende
p27
genet, som rapportert for kreft i bukspyttkjertelen. Men analyser uttrykk for tykktarmskreft cellelinjer og tykktarmskreft biopsier viste ingen konsistent sammenheng mellom EZH2 og P27 nivåer. Videre EZH2 uttømming ikke re-indusere
p27
uttrykk i tykktarm kreft celler, noe som indikerer at
p27
undertrykkelse av EZH2 kan være celle- eller vev-spesifikk. Hele genomet transkriptomet analyser identifiserte cellulære gener påvirkes av EZH2 uttømming i tykktarm kreft cellelinjer. De inkluderte flere kreftassosierte gener knyttet til mobilnettet spredning eller invasjon, for eksempel
Dag1
,
MageD1
,
SDC1
,
Timp2
, og
Tob1
. I konklusjonen, våre resultater viser at EZH2 utarming blokkerer veksten av tykktarmskreftceller. Disse funnene kan gi fordeler for behandling av tykktarmskreft
Citation. Fussbroich B, Wagener N, Macher-Goeppinger S, Benner A, Fälth M, Sültmann H, et al. (2011) EZH2 utarming Blocks spredning av kolon kreftceller. PLoS ONE 6 (7): e21651. doi: 10,1371 /journal.pone.0021651
Redaktør: Moray Campbell, Roswell Park Cancer Institute, USA
mottatt: 02.02.2011; Godkjent: 04.06.2011; Publisert: 13.07.2011
Copyright: © 2011 Fussbroich et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Disse forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Enhancer av Zeste homolog 2 (EZH2) protein er en sentral komponent i Polycomb Undertrykkende Complex2 (PRC2) og modifiserer transkripsjon ved epigenetisk nivå ved å påvirke histon og DNA metylering [1]. EZH2 er overuttrykt i flere maligniteter, inkludert store menneskelige kreftformer, som prostatakreft, brystkreft, kreft i bukspyttkjertelen, nyrecellekreft eller livmorhalskreft [2] -. [6]
Det er eksperimentelle bevis for at
EZH2
kan direkte bidra til kreftutvikling ved å fungere som en
bona fide
onkogen. Nærmere bestemt, for visse kreft enheter, har det blitt rapportert at EZH2 stimulerer celleproliferasjon, blokker apoptose, fremmer celle invasjon og metastase, aktiverer tumor angiogenese, og fremkaller tumorer hos mus [2] – [11]. Disse funnene antyder at EZH2 inhibering kan representere en attraktiv ny strategi for epigenetisk cancerterapi [1], [12].
I den senere tid er det imidlertid også data som tyder på at EZH2 kan fungere som en tumor suppressor protein i visse vev [13]. Homozygot inaktive
EZH2
mutasjoner ble detektert i et parti av myeloide maligniteter [14], [15], øke muligheten for at EZH2 enten kan utøve pro- eller anti-onkogene aktivitet, i en celletype-avhengig måte [ ,,,0],16]. Et annet kompleksitetsnivå blir tilsatt ved påvisning av heterozygote
EZH2
mutasjoner i et parti av lymfomer av germinalsenter opprinnelse [13]. I dette tilfelle synes det mutante proteinet for å øke nivået av H3K27 metylering, en kritisk nedstrøms mål for EZH2, ved å virke sammen med villtype-proteinet uttrykt fra den ikke-muterte allel [17].
Kolorektalkreft er den fjerde vanligste kreftformen hos mennesker. Hvert år vil mer enn 1.200.000 personer utvikle sykdommen og over 600.000 vil dø av det [18]. Til tross for den høye biomedisinsk betydningen av denne svulsten, undersøkelser av EZH2 status og funksjon i tykktarm kreft celler er sparsom og delvis motstridende. For eksempel, mens EZH2 var konsekvent rapportert å være overuttrykt i tykktarm kreft, EZH2 ekspresjonsnivåer positivt korrelert [19], negativt [20], [21], eller ikke i det hele tatt [22], med overlevelse av tykktarmskreftpasienter. Videre til vår kunnskap, bare en funksjonell studien undersøkte rollen EZH2 for vekst av tykktarmskreftceller, men klarte ikke å se en effekt på
EZH2
genet Slå [22]. Dette funnet er i sterk kontrast til den vekstfremmende rolle EZH2 rapportert for flere andre kreft enheter [2] – [6]. I dette arbeidet, adressert vi dette problemet ved å analysere EZH2 uttrykk i tykktarm kreft celler
in vitro Hotell og
in vivo
, og ved å undersøke bidraget fra EZH2 til vekst av kolorektal kreft cellelinjer .
Resultater
uttrykk av EZH2 i tykktarm kreft celler
in vitro Hotell og RNA-interferens-mediert
EZH2
undertrykkelse
for å undersøke uttrykk for EZH2 i tykktarm kreft celler
in vitro
, analyserte vi et panel av tolv tumor avledet tykktarm kreft cellelinjer ved immunoblotting og QRT-PCR. Alle de testede cellelinjer uttrykte lett påvisbare mengder av EZH2 protein (figur 1A) og
EZH2
mRNA (figur 1B). For påfølgende RNA interferens (RNAi) analyser, genererte vi tre syntetiske sirnas rettet mot ulike regioner av
EZH2
transkripsjon. Alle tre sirnas effektivt blokkert EZH2 uttrykk (figur 1C). Siden potensielle off-target effekter av individuelle siRNAs kan reduseres ved siRNA pooling [23], [24], vi testet også et basseng som består av alle tre
EZH2
for målretting sirnas. Dette siRNA bassenget også effektivt blokkert EZH2 uttrykk (figur 1C) og ble brukt for ytterligere funksjonsanalyser.
En immunoblotanalyse av EZH2 protein uttrykk. Tubulin, lasting kontroll. B QRT-PCR analyser av
EZH2
mRNA uttrykk. Data er presentert som fold forskjeller i genuttrykk, normalisert til en husholdningsgenet indeks. Standardavvik fra to revers transkripsjon replikater er indikert. C Modulation av EZH2 protein uttrykk ved RNAi. EZH2 ble bestemt av immunoblot analyse 48 timer etter transfeksjon med
EZH2
for målretting sirnas eller kontroll sirnas, som angitt. siEZH2pool: sammenslåtte
EZH2
for målretting sirnas. Tubulin, lasting kontroll.
EZH2
undertrykkelse resultater i G1 arrest og veksthemming av tykktarm kreft celler
Deretter testet vi effekten av RNAi-mediert
EZH2
undertrykkelse på veksten av HCT116, LoVo, og DLD1 tykktarmskreftceller. siRNA-behandling resulterte i en sterk reduksjon av EZH2 nivåer i alle testet colon carcinoma cellelinjer og, som tidligere er rapportert for andre celler [7], i en samtidig reduksjon av cyclin D1 uttrykket (figur 2A).
A immunoblot analyser av HCT116, DLD1, og LoVo celler som viser effektiv nedregulering av EZH2 uttrykk ved RNAi. Cyclin D1 nivåer indikeres. Tubulin, lasting kontroll. B Cellesyklus analyser av FACS. Cellene ble behandlet med to kontroll sirnas eller med
EZH2
for målretting sirnas. Prosenter av celler i G1, S eller G2 /M-fasene av cellesyklusen, er angitt. C Utarbeidelse av cellesyklus analyser fra tre uavhengige forsøk. Standardavvik er angitt. Stjernene lik p≤0.05, doble stjernetegn lik p≤0.01, N.S. ikke signifikant.
Cellesyklus analyser av fluorescens aktivert celle sortering (FACS) ble utført parallelt. De viste en statistisk signifikant økning i G1 populasjoner og en samtidig reduksjon i S-fasen populasjoner, på
EZH2
undertrykkelse. Typiske FACS-kurver er vist i figur 2B, er en sammenstilling av resultatene fra tre uavhengige eksperimenter er vist i figur 2C. Disse resultatene indikerer at
EZH2
undertrykkelse induserer cellesyklus arrest i G1 /S-grensen og derfor kan opptre antiproliferative i tykktarm kreft celler.
For ytterligere å løse dette problemet, analyser celletall for tykktarmskreft cellelinjer ble utført. RNAi-mediert hemming av
EZH2
uttrykk ført til en betydelig reduksjon av celletall, som var godt synlig 48-72 timer etter transfeksjon av syntetiske siRNAs (figur 3a), noe som indikerer at
EZH2
stanse resulterer i vekst hemming av tykktarm kreft celler.
En celle teller følgende transient transfeksjon med syntetisk kontroll siRNA (sicontr-1) eller
EZH2
for målretting sirnas (siEZH2 basseng). Grafer representerer relative celletall, på de angitte tidspunkter etter siRNA transfeksjon. Celle tall på transfeksjon (tidspunkt 0) ble satt som 1.0. Forsøk ble utført i tre paralleller, er standardavvikene er angitt. Stjernene lik p≤0.05, N.S. ikke signifikant. B kolonidannelse analyser. HCT116, LoVo, DLD1, og RKO celler ble stabilt transfektert med plasmider uttrykker to ulike shRNAs mot
EZH2 plakater (pCEP-shEZH2-1, pCEP-shEZH2-2) eller to kontroll shRNAs (pCEP-shluc eller pCEP- shcontr-1). Forsøkene ble uavhengig gjentas minst tre ganger, med konsistente resultater.
For å validere antiproliferative effekt av
EZH2
hemming i tykktarm kreft celler av en uavhengig metode, utførte vi kolonidannelse analyser. To forskjellige
EZH2
for målretting sirnas ble stabilt uttrykt fra valg ekspresjonsvektorer i HCT116, LoVo, DLD1, og RKO celler, for 13 til 15 dager. Begge
EZH2
for målretting sirnas ført til en klar reduksjon av kolonidannelse kapasitet på alle testede tykktarmskreft cellelinjer versus kontroll siRNA-behandlede celler (Figur 3B). Morfologiske aspekter, FACS profiler, og terminal deoksynukleotidyltransferase dUTP nick slutten merking (tunel) analyser ikke gir bevis for økt apoptose av tykktarmskreftceller ved RNAi-mediert
EZH2
undertrykkelse (data ikke vist).
samlet utgjør disse resultatene indikerer at EZH2 utarming induserer cellesyklus arrest i G1 fasen og hemmer veksten av tykktarmskreftceller.
Tissue Micro Array analyse av EZH2 uttrykk i tykktarm adenomer og kreft
Tidligere studier har vist at EZH2 er betydelig overuttrykt i coloncancere sammenlignet med normal tykktarm vev [19] – [22]. Men data sammenligne EZH2 uttrykk i godartede kolon adenomer versus tykktarmskreft er, så vidt vi vet, ikke tilgjengelig ennå. Vi utførte derfor immunhistokjemiske analyser ansette en vev microarray omfatter 24 adenomer, 25 G1 karsinom, 24 G2 karsinom, og 24 G3 karsinomer. I forhold til kolon adenomer ble EZH2 uttrykk betydelig økt i kolon karsinom (fig. 4A og 4B). Analyser av coloncancere som representerer forskjellige grader av histologisk dedifferentiation (økende fra G1-G3) viste en trend for en ytterligere økning av EZH2 uttrykk for mindre differensierte kreftformer, som imidlertid var ikke statistisk signifikant (figur 4B).
En Immunhistokjemisk analyser av kolon adenomer og tykktarmskreft biopsier representerer økende grad av histologisk dedifferentiation (G1-G3). Svarte piler: karsinom; hvite piler: bindevev. Skala barer, 50 mikrometer. B Box tomt på EZH2 protein uttrykk. Expression nivåer av EZH2 ble betydelig økt i karsinom sammenlignet med adenomer (p 0,001). Forskjeller for EZH2 uttrykk mellom G1, G2 og G3 karsinom var ikke signifikant (p = 0,185).
EZH2 og p27 uttrykk korrelerer ikke i tykktarmskreft
cyclin-avhengige kinase inhibitor p27 (også kalt Kip1) er en vekst hemmende protein som blokkerer cellesyklusprogresjon på G1 /S overgang [25]. I tykktarm kreft, P27 nivåene er ofte lav [26], [27]. Interessant nok var det nylig rapportert at EZH2 uttømming førte til p27 re-uttrykk i kreft i bukspyttkjertelen celler, noe som indikerer at EZH2 kan bidra til tumor celleproliferasjon ved å undertrykke
p27 product: [4]. I lys av våre funn at EZH2 fremmer celledeling og stimulerer G1 /S cellecyklusprogresjonen av tykktarmskreftceller, vi tok opp spørsmålet om
p27
blir undertrykt av EZH2 i tykktarmskreft i tillegg.
Immunhistokjemisk analyser viste at tykktarm kreft viste signifikant redusert kjernekraft p27 og en trend for reduserte cytoplasma p27 proteinnivå (figur 5A), sammenlignet med kolon adenomer. Innenfor kreft gruppen økende grader av kreftcelle dedifferentiation (G1-G3) viste en statistisk ikke-signifikant trend for en ytterligere reduksjon av p27 ekspresjon (figur 5A). Generelt er disse resultatene er motsatt til de funn som oppnås for EZH2 uttrykket (figur 4B), øke muligheten for at EZH2 nivåer kan negativt korrelert med P27 nivåer. Imidlertid EZH2 og P27 nivåene ikke signifikant korrelert i enkelte krefttyper (n = 68) på en per pasient basis, dvs. i tumorer avledet fra den samme pasient (figur 5B). Denne mangelen på sammenheng søkt om å analysere EZH2 utgjør både i forhold til kjernefysiske eller cytoplasmatiske p27 uttrykk nivåer (Spearmans rank korrelasjon koeffisienter r = 0,187, p = 0,572 og r = -0,0623, p = 0,613, henholdsvis).
A Box plott av kjernekraft og cytoplasmatic p27 protein uttrykk i kolon adenomer og karsinomer (G1-G3). Ekspresjonsnivåene av kjerne p27 var signifikant lavere i karsinomer enn i adenomer (p = 0,026), cytoplasmatiske P27 nivåer viste en lignende trend, som imidlertid ikke var statistisk signifikant (p = 0,173). Forskjeller for p27 uttrykk mellom G1, G2 og G3 karsinom var ikke signifikant. B Immunhistokjemisk farging av sammenkoblede prøver av tykktarm kreft viste ingen signifikant korrelasjon mellom EZH2 og p27 uttrykk nivåer. Eksempler på 4 forskjellige kreftformer (I-IV) farget for EZH2 (øverste panelene) og P27 (nedre paneler), henholdsvis. Skala barer, 50 mikrometer.
I tråd med disse
in vivo
funn, basalnivåer EZH2 protein uttrykk ikke konsekvent korrelerer med p27 protein eller mRNA nivåer i tykktarmskreft celle linjene
in vitro plakater (Figur 6A og 6B). Vi undersøkte også om p27 uttrykk nivåer påvirkes av EZH2 uttømming i HCT116, LoVo, og DLD1 tykktarmskreftceller. Hvis EZH2 blokker p27 uttrykk, stanse av
EZH2
bør knyttes til en re-økning av p27 uttrykk, som har blitt observert i kreft i bukspyttkjertelen celler [4]. I kontrast, men effektiv inhibering av ekspresjon EZH2 ikke forbundet med en betydelig økning av p27 ekspresjonen, hverken på proteinet (figur 6C) og heller ikke på mRNA (figur 6D) nivå, i kolon kreftceller. Cellular fraksjoneringsstudier viste at p27 er praktisk talt utelukkende lokalisert i cytoplasma, i HCT116, LoVo, og DLD1 celler. Denne subcellulære distribusjonen ble heller ikke påvisbart endret av EZH2 mangel (Figur S1).
En EZH2 og p27 protein uttrykk i tykktarm kreft cellelinjer, vurderes av immunoblot analyser. Tubulin, lasting kontroll. B
p27
mRNA uttrykk, målt ved QRT-PCR-analyser. Data er presentert som de fold forskjeller i genuttrykk, normalisert til en husholdningsgenet indeks. Standardavvik fra to revers transkripsjon replikater er indikert. C Immunoblot analyser etter EZH2 uttømming av RNAi. EZH2 og P27 nivåer indikeres. Tubulin, lasting kontroll. D QRT-PCR-analyser etter EZH2 uttømming av RNAi.
p27 Hotell og
EZH2
mRNA nivåer indikeres i forhold til sicontr-en-behandlede celler (vilkårlig satt til 1,0). Standardavvik av tre uavhengige forsøk er angitt.
transkriptomet Analyser av Colon kreft celler ved EZH2 uttømming
For å identifisere mulige målgener berørt av EZH2 uttømming i tykktarm kreft celler, transkriptom analysene ble utført. For å oppnå dette, ble LoVo og DLD1 celler behandlet enten med siRNA bassenget lyddemping
EZH2
uttrykk eller med kontroll siRNA. Endringer i uttrykket nivåer av cellulære gener ble vurdert ved hjelp av et genom-wide microarray på ca 25 000 gener. Vi har observert signifikante endringer av 2,235 gener i DLD1 (1,095 oppregulert, 1140 nedregulert) (Tabell S1) og av 379 gener i LoVo (280 oppregulert, 99 nedregulert) (tabell S2). Overlappingen besto av 139 gener som ble berørt av EZH2 reduksjon i både tykktarm kreft cellelinjer (100 oppregulert, 39 nedregulert). En heatmap visualisere disse 139 differentially regulerte gener er gitt i Figur 7A, som indikerer høy samsvar mellom de biologiske replikater. En detaljert liste over disse genene er gitt i tabell S3.
En Venn-diagram og heatmaps av 139 gener som påvirkes nevneverdig på karakterutskriften nivå ved EZH2 reduksjon i både LoVo og DLD1 celler. Heatmaps ble generert ved hjelp av hierarkisk clustering. Celler ble enten behandlet med siEZH2pool eller sicontr-2. Fire biologiske replikater ble analysert for hver prøve. Betydelig oppregulert gener er indikert i gult, betydelig nedregulert gener i blått. B QRT-PCR-analyser for å vurdere uttrykket av fem gener som ble berørt av EZH2 laget i transkriptomet analyse (se ovenfor). Indikert er resultatene fra tre uavhengige eksperimenter utført i DLD1 celler. mRNA-nivåer er vist i forhold til sicontr-2-behandlede celler (vilkårlig satt til 1,0). Standardavvik er angitt. Stjernene lik p≤0.05, dobbel stjerne lik p≤0.01.
Funksjonell annotering av de 139 gener ved Oppfinnsomhet Pathway Analyse viste at 37 genprodukter har blitt assosiert med kreft (tabell 1). Med tanke på de molekylære og cellulære funksjoner, ble EZH2 uttømming funnet å påvirke flere gener som er involvert i kontrollen av cellulær utvikling, vekstkontroll, cellulær bevegelse, og signalering (tabell 1).
For å validere array-data, analyserte vi ekspresjonen av 5 cancer-assosierte gener, som ble indusert av EZH2 uttømming i transkriptomet analyser, ved QRT-PCR: (i)
Dag1 plakater (Dystroglycan 1) som koder for et adhesjonsmolekyl, hvilken ofte underexpressed i tykktarmskreft [28], (ii)
MageD1 plakater (Melanoma-assosiert antigen familie protein-D1) som koder for en inhibitor av proliferasjon og tumorcelle-invasjon [29], (iii)
SDC1 product: (Syndecan 1), som koder for et celleoverflate proteoglykan som hemmer celle invasjon [30], (iv)
Timp2 plakater (TIMP metallopeptidase inhibitor 2), som koder for en inhibitor av matriks-metalloproteinaser som nedregulering korrelerer med invasiv potensialet av LoVo tykktarmskreftceller [31], og (v)
Tob1 plakater (Svinger av ErbB2), som koder for et protein med antiproliferativ tumorundertrykkende potensial [32]. Som observert for microarray, ble alle 5 gener også betydelig indusert av EZH2 laget i QRT-PCR-analyse (figur 7B), ytterligere bekreftende transkriptom data.
Diskusjoner
I denne undersøkelsen viser vi at EZH2 uttømming i tykktarm kreft celler (i) reduserer cellecyklusprogresjonen på G1 /S-grensen, (ii) reduseres celle tall i kortsiktige vekstmålinger, og (iii) blokkerer cellevekst i langsiktige kolonidannelse analyser . Disse resultatene er i samsvar med en vekstfremmende rolle for EZH2 i tykktarmskreft, og er i motsetning til en fersk rapport som viser at veksten av tykktarmskreftceller ikke er påvirket av siRNA-mediert EZH2 uttømming [22].
En mulig forklaring på denne forskjell kan være relatert til analysene brukes til å måle cellevekst. Den tidligere studie var avhengig av MTT-assay som måler en metabolsk aktivitet (reduksjon av MTT (3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid til formazan) [22]. Denne analysen kan påvirkes av mange forhold, f.eks metabolske forandringer, og kan føre til undervurdering av veksthemmende effekter [33] -. [35] i motsetning til i denne studien, antiproliferative effekter etter
EZH2
lyddemping ble konsekvent observert i tre . uavhengige analyser Våre funn indikerer således at EZH2 stimulerer spredning av tykktarm kreft celler, som har blitt rapportert i flere andre kreft enheter [2] -. [9], [11]
de nøyaktige molekylære mekanismer hvordan EZH2 stimulerer celleproliferasjon er fortsatt i stor grad ukjent. som en viktig del av den PRC2 transcriptional repressor komplekse, kan EZH2 føre til undertrykkelse av antiproliferative gener. en interessant studie nylig vist at EZH2 fører til undertrykkelse av den veksthemmende
p27
cellesyklus regulator gen i kreft i bukspyttkjertelen celler [4]. Siden P27 virker på G1 /S overgangen – som vi har funnet for å være påvirket av
EZH2
stanse i tykktarm kreft celler – og siden P27 nivåer er ofte lav i tykktarm kreft [26], [27], vi testet en mulig sammenheng mellom EZH2 og p27 nivåer
in vivo Hotell og
in vitro
.
Men komparative analyser av EZH2 og p27 uttrykk viste ikke statistisk relevant positiv eller negativ kobling i tykktarm kreft
in vivo
, på en per pasient. Videre gjorde EZH2 uttømming ikke resultere i en re-uttrykk for p27 i tykktarm kreft cellelinjer
in vitro
, på tidspunkter hvor det resulterte i svært økt p27 uttrykk i bukspyttkjertelen kreft cellelinjer [4]. Disse funnene tyder på at – i motsetning til situasjonen i kreft i bukspyttkjertelen celler – P27 nivåene er ikke kritisk regulert av EZH2 i tykktarm kreft celler. Således kan spektret av EZH2 målgener variere i et vevs- eller cellespesifikk måte.
For å få innsikt i spekteret av gener, som er påvirket av EZH2 uttømming i kolon kreftceller, utførte vi hele genomet transkriptomet analyser i DLD1 og LoVo celler. Blant de 139 gener, som ble signifikant påvirket i begge cellelinjer, over en fjerdedel er kjent for å være kreftrelatert. Spekteret av berørte gener er i overensstemmelse med hypotesen om at EZH2 er en viktig faktor for utvikling, kontroll spredning, signalering, og bevegelse /invasjon [1], [36]. Ytterligere arbeid er nødvendig for å analysere de nøyaktige mekanismene som EZH2 kan endre uttrykket av disse genene, og for å studere i detalj deres mulige bidrag til veksten deregulering av tykktarmskreftceller. Vi bekreftet tabelldata ved uttrykk analyse av 5 gener ved QRT-PCR:
Dag1
,
MageD1
,
SDC1
,
Timp2
, og
Tob1
. I tråd med transkriptomet analyse,
EZH2
stanse økt uttrykk av alle 5 gener i QRT-PCR-analyser også. Disse funnene tyder på at EZH2 kan undertrykke disse genene enten direkte eller indirekte, i tykktarm kreft celler. Alle 5 gener er rapportert å ha antiproliferativ og /eller antiinvasive potensiell [28] – [32] og deres downregulation vil derfor være i samsvar med en mulig onkogen effekt av EZH2 i tykktarmskreft
På grunn av den vekstfremmende. rollen til EZH2 i ulike kreftformer, er hemming av EZH2 for tiden diskutert som et attraktivt ny strategi for kreftterapi [1], [12]. Faktisk
EZH2
hemming av sirnas, eller uttømming av PRC2 komponenter av stoffet 3-deazaneplanocin A (DZNep), utøves antioncogenic effekter, ved å blokkere celledeling og /eller indusere apoptose [2] – [7], [11], [37], [38], ved å motvirke invasjon og metastasering [9], [10], og ved å hemme tumor angiogenese [8].
funnene i vår studie at EZH2 bidrar til spredning av tykktarm kreft celler utvider spekteret av kreft enheter som kan terapeutisk nytte EZH2 hemming til tykktarmskreft. Vurderer EZH2 som en potensiell terapeutisk mål, men må ta hensyn til at EZH2 er også uttrykt i normalt vev, inkludert den proliferative celle laget av kolon krypter [22]. Viktigere, EZH2 er blitt funnet å utøve viktige regulatoriske funksjoner i en rekke vev, som for eksempel styring av differensiering av vev-spesifikk forløper- og stamceller [39] – [42]. Videre er den nylige observasjon at EZH2 kan virke som en tumor suppressor i visse hematologiske lidelser [14], [15], [16] tyder på at EZH2 inhibering kan selv fremme tumorgenese, i noen vev. Dermed forstyrrer EZH2 fungere som en terapeutisk strategi bærer risikoen for å indusere uønskede bivirkninger, og er sannsynligvis kreve meget spesifikk levering av EZH2 hemmere til sine målceller.
Materialer og metoder
Cells og transfections
HCT116, DLD1, LoVo, WiDr, SW620, HCT15, RKO, T84, Caco-2, og COLO205 tykktarmskreft cellelinjer var en slags gave fra Dr. M. von Knebel Döberitz (Universitetet i Heidelberg ), SW480 fra Dr. S. Wiemann (tysk Cancer Research Center, Heidelberg), og HT29 fra cellen og vev kultur kjernen innretningen av den tyske Cancer Research Center, Heidelberg. Celler ble opprettholdt i enten DMEM (pH 7,2), RPMI, eller McCoys medium, supplert med 10% FCS, 50 enheter /ml penicillin og 50 ug /ml streptomycin sulfat.
Plasmider ble transfektert ved kalsiumfosfat-kopresipitering [43] inn HCT116 cellene, eller ved Fugene HD (Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland) inn DLD1, LoVo, og RKO celler. Syntetiske sirnas ble transfektert med Dharmafect (Dharmacon, Thermo Fisher Scientific, Lafayette, CO, USA) i henhold til produsentens protokoll. I korte trekk ble cellene sådd ut i 6-cm skåler ved 15% til 25% konfluens. Dharmafect 4 og sirnas (sluttkonsentrasjon på 100 nM) ble begge fortynnet i Opti-MEM I-redusert serummedium (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) og blandet i et volum på 400 ul transfeksjon løsning.
Plasmider og syntetiske sirnas
sirnas var enten kjemisk syntetisert (Dharmacon) eller uttrykt som shRNAs fra pCEPsh, som tidligere beskrevet [44]. Følgende
EZH2
for målretting for sirnas ble anvendt: siEZH2-1 5′-GAAUGGAAACAGCGAAGGA-3 «(forhåndsutformet siRNA fra Dharmacon), siEZH2-2 5′-GACUCUGAAUGCAGUUGCU-3′ [7], og siEZH2-3 5»-GCUGAAGCCUCAAUGUUUA-3 «(forhåndsutformet siRNA fra Dharmacon). Den siEZH2pool besto av alle tre sirnas blandet i ekvimolare konsentrasjoner. Følgende kontroll sirnas ble anvendt: sicontr-1 5»-CAGUCGCGUUUGCGACUGG-3 «[45], sicontr-2 5′-UAGCGACUAAACACAUCAA-3′ (forhåndsutformet siRNA fra Dharmacon, inneholdende minst fire mistilpasninger til alle kjente humane gener), og siluc 5»-CAUCACGUACGCGGAAUAC-3 «(målretting
Photinus pyralis
luciferase [46]).
RNA ekstraksjon, kvantitativ real-time revers transkripsjon polymerase chain reaction (QRT-PCR), og protein analyser
RNA ble isolert som tidligere beskrevet [47] og resuspendert i RNAse fritt vann. RNA-konsentrasjoner ble målt med Nanodrop ND-1000 (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE USA), ved 260 nm. Revers transkripsjon av en mikrogram RNA ble utført ved hjelp av oligo-dT primer og ProtoScript M-MuLV Taq RT-PCR Kit (New England Biolabs, Frankfurt, Tyskland) i henhold til produsentens protokoll. Expression nivåer ble bestemt ved real-time PCR med en 7300 Real-Time PCR System detektor (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA), ved hjelp av SYBR grønn PCR Master Mix (Applied Biosystems), supplert til 500 nM av hver forover og bakover primer.
EZH2 plakater (NM_004456) ekspresjon ble bestemt ved anvendelse av forover primer 5′-TTGTTGGCGGAAGCGTGTAAAATC-3 «og revers primer 5′-TCCCTAGTCCCGCGCAATGAGC-3» [48]. For påvisning av
p27
Kip1 plakater (NM_004064) uttrykk 5′-GCCAGACGGGGTTAGCGGAG-3 «ble brukt som frem og 5′-GAGGCCAGGCTTCTTGGGCG-3» som reverse primer.
MageD1 plakater (NM_001005333) ble bestemt med primere 5′-GGCTGTCCTCTGGGAGGCACT-3 «og 5′-GGGTTGCTGTTGGGCACTCGT-3»,
Timp2 plakater (NM_003255) uttrykk med primere 5′-TCTACACGGCCCCCTCCTCG-3 «og 5′-TGGGGCAGCGCGTGATCTTG-3»,
SDC1 plakater (NM_001006946) uttrykk med primere 5′-CGGCCCTGCCGCAAATTGTG-3 «og 5′-CCTCCAGGCCGGTGGGTTCT-3»,
Tob1 plakater (NM_005749) uttrykk med primerne 5′-TGCAGCCTATGGAGGCCTCAA-3 «og 5′-CCCCTTGGGCCCGTGCATTTT-3», og
Dag1 plakater (NM_001165928) ekspresjonssystemer med primerne 5′-GTCGTCGGGCGCTCATTTCGA-3 «og 5′-CCAGCCGTGTAGCGCTCACTG-3». GAPDH og HPRT1 primer sekvenser og sykkelforhold har tidligere blitt beskrevet [49]. Størrelsen på PCR-produktene ble først bekreftet ved agarosegelelektroforese og deretter kontrolleres ved å smelte punkt-analyse etter hver reaksjon. Relativ kvantifisering ble utført ved hjelp av sammenlignende Ct (2
-ΔΔCt) metoden [50]. Data er presentert som den ganger forskjell i genekspresjon normalisert til en husholdningsgenet indeks (geometrisk gjennomsnitt av
GAPDH Hotell og
HPRT1
uttrykk nivåer), og i forhold til en kalibrator prøve. Renhold genene ble valgt blant flere testede housekeeping gener for normalisering av genuttrykk, siden de viste like forsterkning effektivitet som våre gener av interesse. Statistisk signifikans av forskjeller i variabler målt mellom kontroller og behandlede gruppene ble bestemt av en tosidig paret t-test ved bruk av Sigma Plot programvare (Systat Software Inc., San Jose, California). Forskjeller ble betraktet som signifikant ved p≤0.05.
Totalt proteinekstrakter ble utarbeidet 48 til 96 timer etter transfeksjon, som beskrevet tidligere [51]. For cytosolisk og kjerneekstrakt forberedelse, ble cellene resuspendert i lyseringsbuffer (10 mM Tris, 10 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5% Nonidet® P-40, pH 7,4) og inkubert på is. Intakte kjerner ble pelletert ved sentrifugering og cytosolisk ekstrakt i supernatanten ble overført. Cellekjernene ble vasket to ganger med lyseringsbuffer inneholdende 0,05% Nonidet® P-40 og de nukleære proteiner ble ekstrahert som beskrevet for total proteinekstrakter. For Western blot-analyser, ble 20-30 ug protein ekstrakt separeres ved 12,5% SDS-PAGE, overført til en Immobilon-P-membran (Millipore, Bedford, MA, USA), og analysert ved hjelp av forsterket kjemiluminescens (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK ). De følgende antistoffer ble anvendt: anti-EZH2 antistoff (AC22, Cell Signaling, Danvers, MA, USA), anti-p27-antistoff (# 610242, BD Transduction Laboratories, Franklin Lakes, NJ, USA), anti-Cyclin D1-antistoff (DSC6 , Cell Signaling), og anti-alpha-tubulin antistoff (CP06, Calbiochem, Darmstadt, Tyskland).
celler og cellesyklusanalyser
For legemer analyser totale celletall ble bestemt 48-72 timer etter transfeksjon. Totale celler per milliliter ble målt, ved anvendelse av en grevinne celleteller (Invitrogen).
For cellesyklusanalyse, ble cellene trypsinert 48 timer etter transfeksjon, ble vasket i iskald fosfat-bufret saltvann (PBS), og faste i 80% kald etanol over natten ved -20 ° C.
