Abstract
BORIS /CTCFL er medlem av kreft testis antigen familie vanligvis uttrykt i kjønnsceller. I svulster, er det abnormt uttrykt selv om dens funksjoner er ikke helt godt definert. For bedre å forstå funksjonene til BORIS i kreft, valgte vi de embryonale kreftceller som modell. Ved hjelp av en molekylær fyrtårn, som spesifikt retter seg mot
BORIS
mRNA, viste vi at BORIS positive celler er en liten undergruppe av tumorceller (3-5% av totalen). De BORIS-positive celler isolert ved hjelp BORIS-molekylær fyrtårn, uttrykt høyere telomerase
hTERT
, stamcelle (
Nanog, OCT4, SOX2
) og kreft stamcellemarkørgener (
CD44
og
ALDH1
) sammenlignet med de BORIS-negative tumorceller. For å definere den funksjonelle rollen BORIS, ble stabile BORIS-utarmet embryonale kreftceller generert.
BORIS
stanse sterkt nedregulert uttrykk for
hTERT
, stamcelle og kreft stamcellemarkørgener. Videre BORIS knockdown økt cellealdring i embryonale kreftceller, avslører en antatt rolle BORIS i senescence biologiske programmet. Våre data indikerer en sammenslutning av BORIS uttrykke celler undergruppe med uttrykk for stemness gener, fremhever den kritiske rollen BORIS i embryonale neoplastisk sykdom
Citation. Alberti L, Renaud S, Losi L, Leyvraz S, Benhattar J (2014) Høy Expression of
hTERT Hotell og Stemness Gener i BORIS /CTCFL Positive celler isolert fra embryonale kreftceller. PLoS ONE 9 (10): e109921. doi: 10,1371 /journal.pone.0109921
Redaktør: Gabriele Saretzki, University of Newcastle, Storbritannia
mottatt: 20 juni 2014; Godkjent: 12 september 2014; Publisert: 03.10.2014
Copyright: © 2014 Alberti et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering: Denne forskningen ble støttet av den sveitsiske National Science Foundation (tilskudd Nummer: 31003A-113505, www.snf.ch.); og Emma Muschamp Foundation (www.s-a-v.org/-Fondations-associees-.html). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. En av forfatterne (JB) er ansatt i en molekylær patologi laboratorium (Biopath Lab ). Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Brother av regulatoren av imprinting nettsteder (BORIS) også utformet som CTCFL, CCCTC bindende faktor lignende, er et DNA-bindende protein med funksjoner i kreft ikke fullt ut forstått. CTCF er en svært konservert, allestedsnærværende uttrykt, multifunksjonell kromatin faktor som spiller en rolle som en tumor suppressor gen [1] – [3]. BORIS er en pattedyr paralog av CTCF, de har samme 11-sink finger domene, men skiller seg på N- og C- termini. Innenfor denne sink-finger domene, BORIS og CTCF vise 70% av homologi [4]. I normalt vev,
BORIS
ekspresjon er begrenset til kjønnsceller, hvor det er involvert i epigenetisk omprogrammering [4], [5].
BORIS
er uttrykt i spermatocytter løpet mannlige kjønnsceller utvikling, tilsynelatende i fravær av CTCF [4]. I tumorer, er BORIS avvikende uttrykt og dens transkripsjon ble detektert ved forskjellige nivåer i flere kreftcellelinjer og i primære tumorer [6]. På grunn av sin begrensede ekspresjon i normalt vev og germinale sin re-ekspresjon i en rekke forskjellige tumorer, tilhører BORIS til kreft testis antigen (CTA) familien. Det har vist seg at BORIS indusert ekspresjon av andre CTA-gener, som MAGE-A1, NY-ESO-1 [7], [8] og Spanx [9], men ikke i alle tumorer [10], [11]. I tillegg har vi tidligere vist at BORIS aktivert
hTERT
uttrykk ved å binde seg til den første ekson av
hTERT
telomerase-genet i embryonale og ovarietumorceller [12]. Videre er det i undersøkelser av eksogene BORIS ekspresjon i normale BORIS-negative celler, demonstrerte vi at disse transfekterte celler utviste høye nivåer av
hTERT mRNA
[12]. Alle disse resultatene avdekket en viktig rolle BORIS i immortalization prosessen i løpet tumorigenesis. Interessant, aktuelle rapporter viser en sammenheng mellom
hTERT
uttrykk og stamcellelignende egenskaper [13] – [17]. Videre undersøkelser om sammenhengen mellom BORIS funksjoner og de viktigste rollene hTERT i immortalization og stemness egenskaper må utføres. Et annet spørsmål som ennå ikke klart svar på er hvor mange celler, innenfor en svulst cellelinje, uttrykker
BORIS
. I denne artikkelen tar vi opp disse spørsmålene. For dette formål har vi valgt å bruke molekylære radiofyr (MB) bildeteknologi, som det er en godkjent metode for å detektere og også for å visualisere mRNA-ekspresjon [18]. MB er oligonukleotider bygget opp på stammesløyfe hårnål med en fluorescens-quencher i den ene ende og, ved den motsatte enden, et fluorescerende fargestoff også kalt fluoroforen. På grunn av deres spesifikke struktur, MBS avgir fluorescens-signaler bare ved binding til sine mål. For å utforske hyppigheten av BORIS-positive celler i kreftcellelinjer, må vi først laget en
BORIS
mRNA målretting MB, og da har vi analysert
BORIS
uttrykk i menneskelige embryonale og eggstokkreft tumor cellelinjer, henholdsvis NCCIT og OVCAR3. Når du har kontrollert at BORIS-MB aktiver FACS sortering av BORIS-positive celler, viste vi at de isolerte BORIS-positive celler uttrykte høyere mRNA nivå av
hTERT Hotell og stemness gener i forhold til BORIS-negative og ikke-sortert NCCIT celler . Vi ytterligere bekreftet dette resultatet ved å
BORIS
silencing studier. Videre viste vi at BORIS beskytter mot aldringsprosessen. Til sammen våre data bekrefter en direkte rolle BORIS i embryonale neoplastisk sykdom
Materialer og metoder
Cells
De humane cellelinjer (BJ, forhuden fibroblast,. HeLa, cervical adenokarsinom, NCCIT, embryonale karsinom, OVCAR3, eggstokk karsinom) ble kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC). Cellene ble dyrket ved 37 ° C med 5% CO
2 enten i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM; Gibco, Invitrogen) for HeLa og BJ-celler, eller i RPMI-1640 medium (Gibco, Invitrogen) for NCCIT og OVCAR3 , supplert med 10% av varme inaktivert føtalt bovint serum (Invitrogen) og 1% av penicillin-streptomycin (Gibco, Invitrogen).
Molecular beacon (MB) design
Sekvenser av BORIS-MB1 og BORIS-MB2 ble utformet ved hjelp av Beacon Designer (Premier Biosoft).
Boris
mRNA sekundære strukturer ble beregnet med mFOLD programvare (mFOLD, https://www.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/) og spesifisitet ble bestemt av BLAST søk (NCBI). Målet sekvens av BORIS-MB1 ligger på ekson 2, og som av BORIS-MB2 ligger på ekson 11 av
BORIS
mRNA. Disse punkter ble valgt ettersom de er utenfor den sink-fingerdomenet, og ikke kryss-hybridisere med de CTCF homologi regionene. I tillegg har tidligere studie vist at start og slutter regioner av mRNA er mer tilgjengelig for hybridisering MB [19]. RANDOM-MB som ble brukt som negativ kontroll ikke samsvarer med noen pattedyr sekvenser [19]. Sekvenser var følgende: BORIS-MB1 5′-CGCTGTCTCTGCACACTCCGTCTTCAGCG-3 «; BORIS-MB2 5»-CAGCCATTCCTCTTTGACTCTGGCTG-3 «og RANDOM-MB 5′-CGACGCGACAAGCGCACCGATACGTCG-3′ (understreket baser som indikerer de komplementære til målet sekvenser). En fluoroforen (Cy3 eller ATTO647) var 5′-konjugert og et svart hull Quencher (BHQ-2) var knyttet til 3»-enden. MBS ble kjøpt fra Sigma, og de ble renset ved høytrykks-væskekromatografi.
In vitro
fastsettelse av MB spesifisitet
oligonukleotider ble designet for å være spesifikk på MBs mål (BORIS-MB1 bestemt mål: 5′-AAGACGGAGTGTGCAGAGAGA-3 «; BORIS-MB2 bestemt mål: 5′-CAGCCAGAGTCAAAGAGGAA-3′ og RANDOM-MB bestemt mål: 5»-TATCGGTGCGCTTGTCG-3 «). En ikke-spesifikk oligo ble brukt for
in vitro
test av de forskjellige MB. Denne ikke-spesifikk oligo, 5′-CGATGCCGAACCAATTCTCCAC-3 «, svarer til et transkript variant av CTCF. For å teste spesifisiteten i oppløsning, ble 200 nM av MB blandet eller ikke med 1 uM av oligo i 10 ul av OPTI-MEM medium (Invitrogen).
Utslipps fluorescens-profiler ble oppnådd etter oppvarming av MB-target oligonukleotidet blandingen til en progressiv temperaturstigning fra 15 til 80 ° C ved anvendelse av 1 ° C -trinn. Fluorescens signal ble kjøpt på slutten av hvert økende grad og oppdaget på Cy3 kanal med en Rotor Gene 6000 Real-Time PCR system (Corbett Life Science).
MB levering og celle fluorescens bildebehandling
Cellene ble løsnet ved bruk av 0,05% trypsin-EDTA (Invitrogen) og resuspendert i serumfritt DMEM-medium ved en konsentrasjon på 10
6 celler /ml. For det første ble Cy3-BORIS-MB eller Cy3-RANDOM-MB (200 nM) ble inkubert ved romtemperatur i nærvær av 1 pl /ml av Lipofectamine RNAiMAX siRNA transfeksjon reagens (Invitrogen) ved anvendelse av Opti-MEM medium. Den Lipofectamine RNAiMAX reagens ble anvendt som leverings kjøretøy siden i våre betingelser ga det mindre bakgrunn sammenlignet med andre reagenser som streptolysin (data ikke vist). Etter 10 minutter ble transfeksjon blandingen tilsatt til de suspenderte celler og sammen inkubert i 1 time ved 37 ° C. Hoechst 33342 (Invitrogen) ble tilsatt i en konsentrasjon på 5 pg /ml i løpet av de siste 10 min med inkubasjon. Deretter ble cellene vasket ved bruk av fosfatbufret saltvann (PBS, Invitrogen) og resuspendert i PBS med 5 mM EDTA. Transfekterte celler ble cytocentrifugated på glass lysbilde ved hjelp av en cytospin sentrifuge og undersøkt under fluorescerende mikroskop (Axioplan2 Imaging, Zeiss). Fluorescens signalet fra Cy3-coniugated MB ble analysert ved hjelp av den røde kanalen og Hoechst 33342 fluorescens utslipp ble observert under blå kanal.
FACS analyse og sortering ved hjelp MB
For FACS analyse og celle sortering, vi brukte MBs konjugert med ATTO 647, et fargestoff preget av sin høye fotostabilitet [20]. Celler ble preparert og inkubert med MB som beskrevet ovenfor (bortsett fra at Hoechst 33342 ikke ble tilsatt), og ble direkte analysert ved hjelp av Gallios strømningscytometer (Coulter Beckman). Minst 10.000 hendelser ble samlet og analysert ved hjelp av Kaluza Software. De BORIS-positive og BORIS-negative populasjoner ble sortert etter utelukkelse av døde celler av propidium jodid (PI) farging hjelp FACSAria I (Becton Dickinson) instrument på flowcytometri Facility av UNIL (University of Lausanne, Sveits). Utvalgene av 2 × 10
4-9 × 10
4 BORIS-positive celler og 2 × 10
5-9 × 10
5 BORIS-negative celler ble sortert.
BORIS knockdown av induserbar shRNA lentiviral systemet
stabile cellelinjer med induserbare uttrykker shRNAs rettet mot menneskelig
BORIS
mRNA ble generert ved hjelp av doksycyklin-induserbar shRNA lentiviral systemet, pINDUCER [21]. De lentiviral vektor pINDUCER11 konstitutivt uttrykker EGFP fluorescerende reporter protein, som gjør det mulig å spore celler transduced av viruset. Denne vektoren inneholder også en kassett med en doksycyklin-induserbar promoter som kontrollerer transkripsjonen av et reportergen TRFP sammen med shRNA, som tillater deteksjon av celler med doksycyklin aktivert shRNA transkripsjon [21]. Fire forskjellige shRNAmiR (shRNA) spesifikt rettet mot
BORIS
, og ikke dens parolog
CTCF plakater (BORIS-SH1: 5′-ATTCACCAAGATCAAAGAACTC-3 «, BORIS-sh2: 5»-GTTCTCACAGTTTCAAATTCAA-3 «, BORIS-SH3: 5′-TTCATCCCGACTGTTTACAAAT-3», BORIS-SH4: 5’TCCGACAGAAGCAACTTCTAAA-3 «) og en kontrollgruppe shRNA med egge sekvens (CTR sh: 5’CAGAGCTAACTCAGATAGTACT3» ble) syntetisert (Sigma). De ble PCR forsterket og klonet inn i pINDUCER11 ryggrad ved hjelp av
EcoRI Kjøpe og
Xhol
restriksjonsenzymer. Sekvensene til alle konstruksjoner ble verifisert ved sekvensering. Lentivirus ble dannet ved ko-transfeksjon av den passende shRNA konstruerer sammen med emballasje vektorene (pMD2G-VSVg, pCMV-dR8.74) inn i HEK-293T-celler ved anvendelse Fugene 6-reagens (Roche Diagnostics) i henhold til produsentens protokoll. Virale supernatanter ble høstet 48 timer etter transfeksjon, filtrert gjennom et 0,45 pm pore-filter, ultracentrifugated i 1,5 timer ved 19 500 rpm i en Beckman SW28 rotor og resuspendert i RPMI-medium. Den virale suspensjon kombinert med 8 ug /ml polybrene (Sigma) ble brukt til å infisere målceller (NCCIT). Tjuefire timer etter infeksjon mediet ble erstattet og stabilt infiserte celler ble EGFP-sortert ved hjelp FACSAria Jeg instrument (Becton Dickinson) ved flowcytometri Facility av UNIL. Induksjon av ekspresjon shRNA ble oppnådd ved tilsetning til mediet av 2 ug /ml doksycyklin (Sigma). For å opprettholde knockdown, ble doksycyklin-inneholdende medium fornyet hver 3. dag.
ektopisk BORIS ekspresjon i HeLa-celler
Dagen før transfeksjon, HeLa-celler ble sådd ut ved en tetthet på 2 x 10
5-celler /brønn i 12-brønners /plater. Cellene ble transfektert med 3 mikrogram av den tidligere beskrevet pCMV-BORIS vektor [12] med Lipofectamine 2000 transfeksjon reagens (Invitrogen) etter produsentens anvisninger. Cellene ble høstet 2 dager etter transfeksjon for celle fluorescens-avbildning.
Kvantitativ RT-PCR
Total RNA ble isolert ved anvendelse av RNeasy Mini Kit (Qiagen) med mot-kolonne DNAse behandling ifølge produsentens instruksjoner. RNA-konsentrasjonen ble bestemt ved hjelp av Nanodrop 2000 (Thermo Scientific) og qubit Fluorescent Technology (Invitrogen).
En stor begrensende trinn var lav mengde total RNA isolert fra cellesortering. For å løse dette teknisk begrensning, søkte vi en metode som allerede er beskrevet og godkjent [22], [23]. For det første ble 200 ng total-RNA retrotranscribed ved hjelp av tilfeldige heksamerer og Superscript III revers transkriptase (Invitrogen) i et sluttvolum på 20 ul. Deretter 2 ul av cDNA ble anvendt for en preamplification reaksjon som består i en multipleks PCR laget med en blanding av primere (tabell S1) ved 0,1 uM sluttkonsentrasjon, 0,5 enhet av platina Taq DNA-polymerase (Invitrogen), 1X PCR-buffer, og 2 mM MgCl
2 i et totalvolum på 25 ul
for preamplification, PCR sykkelBetingelsene betingelsene~~POS=HEADCOMP var:. ett denatureringstrinn ved 95 ° C i 5 minutter etterfulgt av 15 sykluser med amplifikasjon (45 sek ved 95 ° C , 30 sek ved 60 ° C, 1 minutt ved 72 ° C). Til slutt, for kvantitativ PCR, den preamplification reaksjonen ble 20-ganger fortynnet og 2 ul av denne fortynningen ble brukt som templat. Reaksjonsblandingen ble supplert med 0,5 enheter platina Taq DNA-polymerase (Invitrogen), 1X PCR-buffer, 2,5 mM MgCl
2, 2,5 uM SYTO9 grønn (Invitrogen) og 0,1 uM av hvert gen spesifikk primer (Sigma) i et sluttvolum på 20 ul. PCR-betingelsene var: 95 ° C i 5 minutter etterfulgt av sykluser (5 sek ved 95 ° C, 30 sek ved 60 ° C, 45 sek ved 72 ° C). Smelte kurve analyser ble utført ved slutten av forsterkningen for å kontrollere renheten av amplikonene. PCR-produktene ble også lastet på agarosegel for å bekrefte riktig størrelse på amplifiserte produkter. Sykling og fluorescens oppkjøpet ble gjort i Rotor-Gene 6000 Real-Time PCR system (Corbett Life Science). Dataanalyse ble utført ved anvendelse Rotor-Gene 6000 programvare. Relative uttrykk nivåer ble bestemt ved ΔΔCt metode med uttrykk nivåer normalisert til
GAPDH
nivå. PCR effektivitet varierte 94-101%, med korrelasjonskoeffisient (r
2) i området 0,96 til 1,0, for alle de amplifiserte mål-gener. De Ct-verdier på
GAPDH
var omtrent det samme (Ct = 10,07 ± 0,25) for alle cellene som brukes i de kvantitative RT-PCR eksperimenter.
Den menneskelige spesifikke primere (Tabell S1) ble utformet ved hjelp Primer3 (https://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/) og OLIGO Primer analyse programvare. Spesifisitet ble bekreftet ved hjelp av BLAST søk (NCBI). De designede primerpar krysse intron-exon grenser for å unngå genomisk DNA forurensning. BORIS primere ble valgt (mellom ekson 8 og 9) basert på resultater tidligere innhentet [24] for å forsterke den mest tallrike
Boris
isoformer.
DNA metylering analyse
DNA ble ekstrahert ved bruk av DNeasy kit (Qiagen). Et område på 200 ng (fra sorterte celler) og 500 ng av DNA ble brukt til å bisulfit-reaksjon under anvendelse EpiTect Bisulfite kit (Qiagen) ifølge produsentens instruksjoner. Den modifiserte DNA ble brukt til å forsterke en 123 bp fragment av BORIS arrangøren.
metylering analysen er designet med PyroMark analysen Design Software 1.0 (Qiagen). Denne analysen tillot sekvensering av 50 bp (fra posisjon -968 til -918) på innsiden av arrangøren B av
BORIS product: [25] og inkluderte 10 CpG. For å utføre sekvensering, ble 3 mL av sulfitt behandlet DNA først forsterket av PCR. Sekvenser av PCR-primere var: BORIS-pyro Forward 5 «TGGTTTGTGGGTTTTGT 3» og BORIS-pyro BIO Reverse 5 «CCCTTCACCCCCCCTCTTT 3». PCR-betingelsene var som følger: 95 ° C i 5 min; 45 sykluser med 95 ° C i 30 s, 58 ° C i 15 s og 72 ° C i 1 min; og en avsluttende forlengelsestrinn ved 72 ° C i 10 min. Deretter, rensing og påfølgende behandling av den biotinylerte enkeltkjedet PCR-fragment ble utført i henhold til produsentens anbefalinger. Pyrosekvensering av dette PCR-fragmentet ble utført på en PyroMark Q24 instrumentet med Pyro Gull Q24 Reagenser (Qiagen). Den pyrosekvensering primer (5 «GTGTTGTAGTTTATAGT 3») ble anvendt ved en sluttkonsentrasjon på 0,3 uM. Resulterende dataene ble analysert og kvantifisert med PyroMark Q24 programvare (Qiagen) som beregner metylering prosentandel for hver CpG stedet, slik at kvantitative sammenligninger.
Celleproliferering analysen
Celleproliferering ble vurdert ved MTT-analyse . MTT (3- (4,5-dimetyl-2-tiazol) -2,5-difenyltetrazoliumbromid, Sigma) reagens ble anvendt i henhold til produsentens instruksjoner. Kort sagt ble stabilt infiserte celler sådd med en tetthet på 25 x 10
3 celler /brønn i 24-brønners /plater med doksycyklin-inneholdende medium. Etter 3 dager ble celler inkubert med MTT-reagens (200 ug /ml endelig konsentrasjon) i 3 timer ved 37 ° C. Deretter ble cellene lysert tilsetning av isopropanol /HCl i 10 minutter, og platene ble forsiktig ristet i 5 min. Absorbans verdier ble bestemt ved anvendelse av en mikroplateleser (Synergy Mx, BioTek) ved 570 nm. Hvert forsøk ble utført i triplikat og 3 uavhengige eksperimenter ble utført.
Apoptose analyse
Apoptose ble målt in triplo ved bruk av Annexin V Apoptose Detection Kit (BD Bioscience) i henhold til produsentens protokoller. Kort, 5 × 10
4 celler /brønn ble sådd i 12-brønners /plater og ble dyrket i nærvær av doksycyklin til Confluence (5-7 dager). De flytende celler og trypsinert celler ble samlet opp, vasket med PBS og resuspendert i 100 ul bindingsbuffer. Deretter ble 5 ul av Annexin V-V500 og 5 ul 7AAD tilsatt og inkubert med cellene i 30 minutter ved romtemperatur. Etter tilsetning av 400 ul av bindingsbuffer prøvene ble umiddelbart analysert ved Gallios strømningscytometer (Beckman Coulter). Minst 5 × 10
4 arrangementer ble talt for alle prøvene. Prosentandelen av apoptotiske celler ble beregnet etter gating på EGFP og TRFP (omformet og doksycyklin-indusert, henholdsvis) positive celler.
Western blot analyse
Hele cellelysater ble oppnådd ved hjelp av RIPA buffer (Sigma ) i nærvær av proteasehemmer cocktail (Sigma) og kvantifisert ved hjelp av BCA assay (Thermo Scientific). Tretti mikrogram protein ble applisert på en 10% SDS-polyakrylamidgel, fulgt av blotting på en nitrocellulosemembran ved hjelp av en semi-tørr overføring apparat (BIO RAD). Ikke-spesifikk binding ble blokkert ved inkubering over natten i 5% ikke-fettholdig tørrmelk i TBS-T-buffer (0,1% Tween 20 i Tris-bufret saltoppløsning, TBS) ved 4 ° C. Membranene ble deretter probet med monoklonale muse-anti-human BORIS /CTCFL-antistoff (fremstilt og vennligst tilveiebrakt av dr Dmitri Loukinov, NIH /NIAD) som brukes ved 1: 1000 fortynning i 1% blokkeringsbuffer (1% lav-fett tørrmelk i TBS -T-buffer) og inkuberes ved romtemperatur i 1,5 timer. Som lasting kontroll, muse-anti-human β-aktin-antistoff (Sigma) ved 1: 5000 fortynning i 1% blokkerende buffer ble anvendt og inkubert ved romtemperatur i 45 min. Membranene ble vasket 3 x med TBS-T, og inkubert ved romtemperatur i 1 time med pepperrot peroksidase (HRP) -merket kanin-anti-muse-IgG (Sigma) fortynnet 1: 5000 i 5% blokkeringsbuffer. Etter 3 × vasking med TBS-T ble membranene utviklet ved hjelp WesternBright Quantum (Advansta) og visualisert med Fusion FX Chemiluminescence System (Vilber Lourmat).
Senescence-forbundet β-galaktosidase flekker
senescens-assosiert β-galaktosidase (SA-β-gal) farging ble utført ved anvendelse av β-galaktosidase farging kit (BioVision), i henhold til produsentens instruksjoner. Kort, 5 × 10
4 celler /brønn ble sådd i 12-brønners /plater i nærvær av doksycyklin og ble dyrket frem i Confluence (5-7 dager). Deretter ble cellene vasket med PBS, fiksert i 15 min, og inkubert med nyfremstilt SA-β-Gal fargeløsning ved 37 ° C i 24 time. Etter vasking med PBS, ble SA-β-gal aktivitet observert ved bruk av invertert mikroskop (Nikon) ved påvisning av blå fargede celler. Minst 10 separate felt ble valgt. For hvert felt antallet blå fargede celler og totalt antall celler ble tellet. Resultatene er uttrykt som prosent av SA-β-gal-positive celler beregnet som: (antallet blå celler /antall totale celler) x 100.
Telomerase aktivitet
Telomerase-aktiviteten ble målt under anvendelse av TRAPEZE RT telomerase deteksjon kit (Millipore). Denne analysen kvantifiserer telomerase aktivitet ved SYBR Grønn real-time kvantitativ PCR [26]. I korthet ble cellene lysert i 200 ul av CHAPS-buffer og proteinkonsentrasjoner ble bestemt med Nanodrop 2000. Aliquoter av cellelysat (1,5 ug protein /prøve) ble anvendt. Inaktiverte prøver, ingen-mal reaksjoner, og positiv kontroll ble også analysert for kvalitetskontroll. En standardkurve ble utarbeidet av serie fortynning av TSR8 kontroll mal å følge produsentens instruksjoner. Sanntids amplifikasjoner ble utført ved anvendelse av platina Taq DNA-polymerase (2 enheter /prøve, Invitrogen). Sykling og fluorescens oppkjøpet ble gjort i Rotor Gene 6000 real-time PCR system (Corbett Life Science). Telomerase-aktivitet ble beregnet ved å sammenligne gjennomsnitts Ct-verdiene fra hver prøve mot standardkurven generert av TSR8 styremalen.
Statistisk analyse
Statistisk signifikans ble evaluert ved anvendelse av to-halet student t-test analyse. P-verdi 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
In vitro
validering av de molekylære beacons (MBS)
To forskjellige MBs bestemt. til
BORIS
mRNA (BORIS-MB1 og BORIS-MB2) og en RANDOM-MB ble brukt i dette eksperimentet. Hybridiserings temperaturer og spesifisitet av MBS ble først testet i oppløsning. Fluorescensemisjonen av disse MBS ble overvåket ved temperaturer fra 25 til 80 ° C, under forskjellige betingelser: MB alene, MB i nærvær av det spesifikke mål, i nærvær av et ikke-spesifikt mål eller i nærvær av et plasmid som inneholder BORIS cDNA (pCMV-BORIS). Som vist i fig S1, ble merkbar fluorescens-signalet detektert bare når MBS ble blandet med deres spesifikke mål. Optimal fluorescensemisjonen med akseptabelt signal-til-bakgrunnsforhold ( 4) ble observert under 40 ° C. Analysen viste også at BORIS-MB diskriminere enkle og dobbelt-trådede strukturer, ettersom de ikke avgir fluorescens når inkubert med pCMV-plasmid BORIS. Resultatene viste at MBs spesifikt hybridiserer til sine mål sekvenser og sterkt antydet at disse MBs ville være i stand til å spesifikt binde mRNA og ikke genomisk DNA.
Påvisning av
BORIS
mRNA ved hjelp BORIS-MB
Vi først kontrolleres at BORIS-MBs kunne være i stand til å se forskjell på positive og negative BORIS uttrykke celler i levende celler. Kvantitativ RT-PCR oppdaget sterke nivåer av
BORIS
mRNA i NCCIT og OVCAR3 cellelinjer, mens dette nivået var svært lav i HeLa-celler og ikke påvises i BJ celler (Figur 1a), i henhold til tidligere studier [12 ]. Derfor, for å undersøke spesifisiteten av MB, NCCIT ble benyttet som en positiv kontrollceller og BJ som en negativ kontroll. NCCIT-celler ble transfektert med BORIS-MB1 eller BORIS-MB2 og fluorescensemisjoner ble målt ved strømningscytometri. De midlere fluorescente signalene fra cellene transfektert med BORIS-MB var høyere sammenlignet med den midlere fluorescente signalet fra cellene transfektert med RANDOM-MB. En økning på 23,2 og 4,7 ble observert for BORIS-MB1 og BORIS-MB2, henholdsvis (figur 1B-C). Men siden BORIS-MB1 gitt høyere (5 ganger) mener fluorescens signal i forhold til BORIS-MB2, BORIS-MB1 ble valgt for nærmere analyse. Herfra videre BORIS-MB1 omtales som BORIS-MB. Som forventet, når BORIS negative BJ celler ble transfektert med BORIS-MB, de viste ingen fluorescens signal (figur 1D).
(A)
BORIS
uttrykk i humane cellelinjer. Total RNA ble isolert fra humane tumorcellelinjer: NCCIT (embryoniske), OVCAR3 (ovarie), HeLa (cervikal) og normale BJ (fibroblast) celler. mRNA nivåer av
BORIS
ble analysert ved QRT-PCR. Resultater ble normalisert til
GAPDH
og relatert til NCCIT celler. BJ og NCCIT ble betraktet som negative og positive kontroller, henholdsvis. Feilstolpene representerer gjennomsnittet ± SD av 3 uavhengige eksperimenter. (B) Fluorescent signaler målt ved flowcytometri av NCCIT celler transfektert med ATTO647-BORIS-MB1 (mørk grå topp) og med ATTO647-RANDOM-MB (hvit topp). (C) Fluorescent signaler målt ved flowcytometri av NCCIT celler transfektert med ATTO647-BORIS-MB2 (svak grå topp) og med ATTO647-RANDOM-MB (hvit topp). (D) Fluorescent signaler målt ved flowcytometri av BJ celler behandlet med ATTO647-BORIS-MB1 (herfra videre henvist til BORIS-MB, grå topp) og med ATTO647-RANDOM-MB (hvit topp). (E)
BORIS
uttrykk i HeLa celler ved hjelp BORIS-MB. Representative bilder av HeLa-celler forbigående transfektert med ekspresjonsvektoren BORIS, pCMV-BORIS (nederst) og ikke-transfekterte kontrollceller (øverst), 20 x forstørrelse. (F)
BORIS
uttrykk i humane cellelinjer som oppdages ved hjelp BORIS-MB. Representative bilder av BJ, NCCIT og OVCAR3 celler, 20 × forstørrelse. For fluorescensavbildning, 1 x 10
6-celler ble inkubert ved 37 ° C i 1 time i serumfritt DMEM-medium med Cy3-BORIS-MB (200 nM). Hoechst 33342 5 ug /ml ble tilsatt i løpet av de siste 10 min med inkubasjon. Slides ble analysert ved fluorescens mikroskopi.
For ytterligere å utfordre spesifisiteten av BORIS-MB, HeLa-celler som uttrykte
BORIS
mRNA på lavt nivå, ble transient transfektert med pCMV- BORIS ekspresjonsplasmid, som inneholder det humane BORIS cDNA fusjonert til grønt fluorescerende protein (GFP) genet. Som forventet, de transfekterte cellene present høye fluorescens signaler om både GFP og BORIS (figur 1E). Tilsammen bekrefter disse resultatene kapasiteten til BORIS-MB til på en pålitelig og spesifikt å påvise
BORIS
mRNA i levende celler.
Derfor ble cellelinjene transfektert med BORIS-MB å visualisere
BORIS
mRNA uttrykk av fluorescens bildebehandling. Som det kan ses fra figur 1F, fluorescenssignalet av BORIS-MB var klart synlig i NCCIT og OVCAR3 celler, hvor bare et undersett av celler som var fluorescerende. Prosentandelen av BORIS positive celler i disse cellelinjer ble funnet å være mellom 3 og 5%. Som forventet i BJ normal cellelinje ingen fluorescerende celler ble observert. I HeLa-celler, antallet BORIS positive celler var ekstremt lav, mindre enn 0,1% (figur 1E). Samlet disse forsøkene viste at innen tumorcellelinjer,
BORIS
mRNA ikke finnes i alle celler, men heller forekommer bare i en undergruppe av celler.
Isolering av cellepopulasjon som uttrykker
BORIS
mRNA ved hjelp av BORIS-MB
NCCIT cellelinje ble anvendt til isolering av BORIS-positive celler. FACS sortering ble utført etter celle transfeksjon med BORIS-MB. De BORIS-positive og BORIS-negative celler (8,4 ± 1,5 og 41,5 ± 7,2% av total, henholdsvis; gjennomsnitt ± SD) ble sortert (figur 2A)
(A) NCCIT celler ble transfektert med ATTO647-. RANDOM-MB (hvit topp) og ATTO647-BORIS-MB (grå topp). De to subpopulasjoner, BORIS-negative og BORIS-positive celler ble valgt ved å sammenligne det fluorescente signalet fra RANDOM-MB den for BORIS-MB. Etter utelukkelse av døde celler ved PI farging ble de to fraksjoner sorteres. (B)
BORIS
uttrykk for de isolerte BORIS-negative og BORIS-positive fraksjoner ble analysert ved QRT-PCR. Resultatene ble normalisert til
GAPDH Hotell og relatert til ikke-sortert NCCIT celler. Feilstolpene representerer gjennomsnittet ± SD av 3 uavhengige eksperimenter. Stjerne indikerer statistisk signifikant forskjell (p 0,05). Mellom BORIS-positive og ikke-sortert celler
BORIS
uttrykk analyse viste at
BORIS
mRNA nivå av sortert BORIS-positive celler var 20 ganger høyere sammenlignet med de ikke-sortert celler (figur 2B). Dette resultatet viste effektiviteten av sorteringsfremgangsmåten og vellykket berikelse av en cellepopulasjon som uttrykte
BORIS
mRNA.
De isolerte BORIS-positive og BORIS-negative celler som har lignende metylering mønster av BORIS promoter B
i en tidligere studie har vi vist at
BORIS
uttrykket styres av tre alternative arrangører, tilsvarende transkripsjonsstartsider -1447, -899 og -658 bp oppstrøms for første ATG og betegnet promotorer som A, B og C, henholdsvis [25]. Interessant nok har det blitt observert at i tumorer, demetylering av BORIS promoter B, vanligvis er forbundet med uttrykk for
BORIS
, som ikke er tilfelle for arrangører C og A [25]. Derfor forhørte vi den mulige sammenhengen mellom metylering av arrangøren B og
BORIS
uttrykk i de sorterte celler. BORIS metylering nivå av denne promotor ble målt ved pyrosekvensering, etter bisulfitt modifikasjon av DNA ekstrahert fra BORIS-positive og BORIS-negative celler. Pyrosekvensering Resultatene viste at i begge fraksjoner ble CPGs tungt metylert (85-100% metylering) og ingen forskjeller ble påvist (figur 3A). Dette bekreftet at i NCCIT celler,
BORIS
uttrykk ble ikke regulert av arrangøren B og foreslo at de forskjellige uttrykk for
BORIS
blant de sorterte fraksjoner ble ikke styrt av DNA metylering status for arrangøren B, men snarere involvert andre nivåer av kontroll.
(A) Metylering analyse av 10 CpG øyer i
BORIS
promoter-regionen (B promoter). Representanten grafisk viser prosentandelen av metylering av hver CpG øy for den isolerte BORIS-positive (hvit), -negativ (grå) og ikke-sortert (svart) NCCIT celler. (B) Ekspresjon analyse av det isolerte BORIS-positive (hvitt) og BORIS-negative (grå) fraksjoner.
