Abstract
Bakgrunn
Eggstokkreft er fortsatt en ledende dødsårsaken hos kvinner og utvikling av nye terapier er viktig. Sekund mitokondrier avledet aktivator av caspase (SMAC) er blitt beskrevet for å sensibilisere for apoptose. Vi har utforsket den pro-apoptotiske aktivitet av LBW242, en etterligner av SMAC /DIABLO, på eggstokkreft cellelinjer (A2780 celler og dens kjemoresistent derivat A2780 /ADR, SKOV3 og HEY celler) og i primær eggstokkreft celler. Effektene av LBW242 på eggstokkreft cellelinjer og primære eggstokkreft celler ble bestemt av celleproliferasjon, apoptose og biokjemiske analyser.
hovedfunnene
LBW242 lagt alene fremkalte bare en moderat pro-apoptotisk effekt ; Men det sterkt synergizes med tumornekrosefaktor-relatert apoptose inducing ligand (TRAIL) eller kreft narkotika i indusere apoptose av både eggstokkreft cellelinjer og primære eggstokkreft celler. Mekanistiske studier viser at LBW242-indusert apoptose i eggstokkreft celler er forbundet med aktivering av caspase-8. I tråd med denne mekanismen, hemmer c-FLIP overekspresjon LBW242-mediert apoptose.
Konklusjon
LBW242 sensitizes eggstokkreft celler til antitumor effektene av TRAIL og kreft narkotika som vanligvis brukes i klinikken. Disse observasjonene tyder på at SMAC /DIABLO ligne LBW242 kunne være av verdi for utvikling av eksperimentelle strategier for behandling av eggstokkreft
Citation. Petrucci E, Pasquini L, Bernabei M, Saulle E, Biffoni M, Accarpio F, et al. (2012) et lite molekyl SMAC Mimic LBW242 forsterker Trail-og kreft narkotika-mediert celledød av eggstokkreft celler. PLoS ONE 7 (4): e35073. doi: 10,1371 /journal.pone.0035073
Redaktør: Irina V. Lebedeva, Enzo Life Sciences, Inc., USA
mottatt: 5 juli 2011; Godkjent: 09.03.2012; Publisert: 25 april 2012
Copyright: © 2012 Petrucci et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av tilskudd fra det italienske helseMinisteriet, Progetto Oncotecnologico til UT. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
kreft er svært kompleks flertrinns lidelse som involverer progressive opphopning av genetiske og epigenetiske forandringer, som til slutt fører til transformasjon av normale celler i ondartede celler som viser de grunnleggende egenskapene til kreft: motstand mot apoptotiske mekanismer, uavhengighet fra vekstsignaler , ufølsomhet til negative vekstsignaler, invasive og metastatisk kapasiteter, ubegrenset replicative potensial og vedvarende angiogenese [1]. Blant disse forskjellige egenskaper for kreftceller, motstanden mot apoptose absolutt spiller en meget relevant rolle i tumorutvikling og progresjon. Evnen til kreftcellene for å unngå apoptose er relatert til forskjellige biokjemiske egenskapene til disse celler, og spesielt, for å opp-regulering av antiapoptotic gener som for eksempel enkelte medlemmer av Bcl-2-familien av proteiner og medlemmer av Inhibitor av apoptose (IAP ) familie av proteiner [2]. Spesielt, tre linjer med bevis støtter en rolle for IAP-proteiner i kreft: (i) forhøyet uttrykk nivåer av IAP-proteiner, spesielt XIAP, c-IAP1 og c-IAP2, i en rekke humane kreftformer korrelert med tumor karakter og prognose [ ,,,0],3]; (Ii) et antall av
in vitro
og
in vivo
studier har vist at nedregulering av XIAP eller c-IAP1 ved hjelp av forskjellige midler resulterer i sensitivisering av kreftceller til chemotherapy- og gamma bestrålings apoptose [4]; (Iii) kromosomal region 11q21-Q23 inneholder c-IAP1 og c-IAP2 gener er gjenstand for kromosom forsterkning i ulike svulster [3], [4].
IAP, og spesielt c-IAP1, c- IAP2 og X-bundet IAP (XIAP), virker til å inhibere apoptose ved å forhindre aktivering av kaspaser-8 eller inhibere aktiviteten av caspaser-9, -3 og -7, henholdsvis [5], [6]. C-IAP1 og c-IAP2 ha en E3 ubiquitin ligase domene som fremmer proteasome avhengig nedbrytning av c-IAP1 og c-IAP2 [7]. Aktiviteten av IAP antagoniseres av SMAC /DIABLO (andre-mitokondrier-avledet aktivator av caspaser /direkte hemmer av apoptose-bindende protein med lavt pI) som, etter frigjøring fra mitokondrier i respons til apoptotiske utløsende, gjennomgår modning og spalting av dets N -terminal region, med derav følgende eksponering av AVPI sekvensen [8]. Dette tetrapepetide binder XIAP og konkurrerer med de samme bindingsseter som er involvert i samspillet med caspases [9]. Gjennom denne mekanismen, hindrer SMAC /DIABLO beslaglegging av caspases av IAP, og dermed tilrettelegge for den apoptotiske sti. Siden AVPI sekvensen er i stand til å fremme apoptose, forbindelser i stand til å etterligne dette tetrapeptid, kollektivt kjent som SMAC-mimetika, har representert målet for intensiv forskningsinnsats og flere av disse midler har blitt utviklet i løpet av de siste årene [10] – [15 ].
Det er viktig å merke seg at en deregulering av IAP kan bidra til tumorutvikling ikke bare gjennom kaspaser inaktivering, men også gjennom ulike mekanismer som ikke er avhengig av caspaser inaktivering. Dermed vil en fersk studie viste tydelig at: XIAP bidrar til metastaser
in vivo Hotell og celle invasjon
in vitro
, uavhengig av caspases bindende og hemming; XIAP i kompleks med survivin driver aktivering av NF-kB å fremme celle invasjon og metastasering; c-IAP1 og c-IAP2 er også involvert i kreftcelle invasjon [16].
Dermed inaktivering av IAP, særlig i kombinasjon med andre behandlinger (som chemotherapic narkotika, død ligander inkludert TNF-alfa og TRAIL ), resulterer i døden for de fleste tumorceller, i det minste i henhold til vevs kulturbetingelser [11], [13], [16], [17]. Viktigere, betyr inaktivering av IAP ikke synes å være skadelig for normale celler. Ensemblet av disse observasjonene har støttet utvikling av små farmakologiske hemmere av tilgangspunkter som har blitt innført i fase I kliniske studier [5].
LBW242 er en peptidomimetisk rettet mot IAP nylig rapportert av Zawel og kolleger som konkurrerer med høy slektskap med SMAC /DIABLO for innkvartering av XIAP BIR3 bindende lomme [17]. Denne forbindelse ble vist å være i stand til å indusere apoptose av forskjellige celletyper, inkludert multippel myelom, akutt myelogen leukemi, glioblastom og melanom [18] -. [21]
I den foreliggende undersøkelse har vi undersøkt kapasiteten LBW242 til å indusere apoptotisk celledød av eggstokkreft celler tilsatt alene eller i kombinasjon med enten TRAIL eller anticancer legemidler. Våre resultater tyder på at LBW242 forbedrer følsomheten av eggstokkreft celledød indusert av enten TRAIL eller antikreftmidler så som Topotecan ved effekt knyttet til en forsterkning av caspase-8-aktivering. Disse observasjonene støtte fremtidige studier for å undersøke en mulig rolle LBW242 i eggstokkreft behandling.
1A- A2780WT, A2780ADR, HEY og SKOV3 cellene har blitt dyrket i 48 timer enten i fravær eller i nærvær av TRAIL (50 ng /ml) og enten i fravær eller i nærvær av økende konsentrasjoner av LBW242 (fra 1 til 10 pM), og på slutten av kulturen antallet av levende celler ble bestemt. Forskjellen mellom kontroll og TRAIL var statistisk signifikant: p = 0,001 for A2780WT og HEY; p = 0,01 for SKOV3; p = 0,05 for A2780ADR. 1B- A2780WT og SKOV3-celler har blitt dyrket som ovenfor, og etter 48 timer av kulturen andelen av apoptotiske celler ble bestemt ved Annexin V-bindingsanalysen og propide jodid farging. Prosentandelen av apoptotiske celler ble bestemt ved flow-cytometri. Resultatene representerer middelverdier ble observert i tre separate eksperimenter. Forskjellen mellom kontroll og TRAIL var statistisk signifikant. P = 0,01 for både A2780WT og SKOV3 celler
Metoder
Etikk uttalelse
Denne studien var spesielt godkjent av Institutional Review Board av Istituto Superiore di Sanita og var i samsvar med prinsippene i Helsinkideklarasjonen II. Den skriftlig informert Innholdet ble oppnådd fra hver pasient.
A2780WT, A2780ADR og SKOV3 celler har blitt stabilt transfektert med enten tom vektor (Pinco) eller med vektoren inneholdende cDNA av c-FLIP (FLIP) og den resulterende celler ble dyrket enten i fravær (kontroll) eller i nærvær av LBW242 (10 uM) eller TRAIL (50 ng /ml) eller begge disse midler i de ovenfor angitte konsentrasjoner. Prosentandelen av apoptotiske celler ble bestemt ved hjelp av strømningscytometri ved bruk av Annexin V-/PI bindingsbestemmelse. Dataene representerer middelverdier ± SEM observert i tre separate eksperimenter. Statistisk analyse: * p = 0,05; ** P = 0,01; *** P =. 0,001
Cell Culture
Cisplatin følsomme menneskelig eggstokkreft epitelial karsinom cellelinje A2780WT ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC); adriamycin-resistent cellelinje A2780ADR, avledet fra dets paren eggstokk-kreft cellelinje A2780 ved påføring av trinnvise økninger i konsentrasjonene av adriamycin ble oppnådd fra European Collection of Cell Cultures (ECACC). De A2780ADR Cellene ble behandlet med 10 pM adriamycin hver 10 passasjer. SKOV3 og HEY cellelinjer ble innhentet fra ATCC.
A2780WT, A2780FLIP, A2780ADR, A2780ADR FLIP, SKOV3 og SKOV3 FLIP cellene har blitt dyrket som rapportert i fig. 2 enten i fravær eller i nærvær av 40 pM zVAD-FMK eller zIETD-FMK og etter 48 timers inkubering, ble prosentandelen av apoptotiske celler ble bestemt ved Annexin V-/PI bindingsbestemmelse. Resultatene representerer middelverdier ± SEM observert i tre separate forsøk.
Cellene ble dyrket ved 37 ° C i en atmosfære av 5% CO
2 i Advanced MEM med 3% føtalt bovint serum (FBS, Euroclone, Milano, Italia), 50 IU /ml penicillin, 50 ug /ml streptomycin, 50 ug /ml gentamicin og 0,3 ug /ml glutamin. Cellene ble rutinemessig sjekket for tilstedeværelse av mykoplasma.
I panelet C både i full lengde (FL) og det spaltede form (CF) av caspase-3 er vist. PARP-immunoblotting viser to band, hvorav de øvre tilsvarer en full-lengde form av PARP og den nedre bandet til en kløyvde form av PARP. På figuren er angitt representative data som er observert i en av de tre eksperimenter utført.
Isolering og in vitro dyrking av primære eggstokkreft celler
Intra-operasjonslys biopsier er oppnådd fra 9 ovarian kreftpasienter, som er berørt av serøs adenokarsinom, gjennomgår debulking kirurgi for enten primære eller residiverende sykdom. Tumorvev ble mekanisk dissosiert med en saks og en tumorcellesuspensjon er blitt oppnådd ved spaltning i vevskulturmedium (RPMI 1640) som inneholder kollagenase, deoksyribonuklease I og hyaluronidase. Den endelige tumorcellesuspensjon ble kontrollert for andelen av tumorceller ved standard cytologi og prosentandelen av epitelceller ved flowcytometri (bestemt etter farging med Ber-EP4-mAb, Dakopatt, Copenaghen, Danmark). Kort beskrevet for vurdering av Ber-EP4 reaktivitet celle aliquoter ble farget i 30 minutter ved 4 ° C med 5 ug /ml FITC-merket anti-Ber-EP4 mAb, vasket og analysert for fluorescens-emisjon ved anvendelse av en Becton Dickinson strømningscytometer. Tumorcelle alikvoter (1 x 10
6 celler) har blitt sådd ut i 25 cm
3 vevsdyrkingskolber i 10 ml cellekulturmedium inneholdende 10% føtalt kalveserum. Etter en dag med
in vitro
kultur, ikke-adherente celler (inneholdende vev avfall og døde celler) er fjernet og friskt medium ble tilsatt til kulturen og deretter inkubert i ytterligere 24 timer, enten i fravær eller i tilstedeværelsen av TRAIL, eller LBW242 eller begge reagenser. Etter 24 timers dyrkning ble cellene sammenflytende. Tumor kulturer inneholdt minst 80% av kreftceller.
Transduksjon av A2780WT, A2780ADR og SKOV3 celler
A2780WT, A2780ADR og SKOV3 celler som uttrykker enten tom vektor Pinco-GFP (Pinco) eller vektor Pinco-GFP inneholder c-FLIP
L (FLIP) menneskelige genet har blitt fremstilt som tidligere rapportert [22]. Transduced celler ble rutinemessig analysert for GFP uttrykk ved hjelp av et strømningscytometer og for c-FLIP
L uttrykk ved Western blotting.
Apoptose vurdering av Annexin-V flekker
Etter medikamentell behandling, celler ble resuspendert i 200 ul fargeløsning (inneholdende Annexin V-fluorescein og propidium jodid i en Hepes-buffer, Annexin V-FITC-apoptose Detection Kit, Pharmingen, San Jose, CA, USA). Etter inkubering ved romtemperatur i 15 min., Ble celler analysert ved flow-cytometri. Annexin-V binder seg til disse celler som uttrykker fosfatidylserin på det ytre laget av cellemembranen, og propidiumjodid flekker det cellulære DNA i disse celler med en cellemembran kompromittert. Dette åpner for diskriminering av levende celler (ufargede med enten fluorokromkonjugerte) fra apoptotiske celler (farget bare med annexin V) og nekrotiske celler (farget med både Annexin-V og Propidium jodid).
Kvantifisering av apoptose og celle syklus analyse av propidiumjodid /fluorescens-aktivert cellesortering
Cellene ble høstet med trypsin, vasket, inkubert først med en spermin-tetrahydroklorid vaskebuffer inneholdende trypsin for å fordøye cellemembraner og cytoskeletons, deretter med en citratbuffer inneholdende en trypsininhibitor og ribonuklease A for å inhibere trypsin-aktivitet og å fordøye RNA, og til slutt resuspendert i 400 ul av propidiumjodid (PI) løsning (50 ug /ml PI, 0,1% Triton X-100 og 0,1% natrium-citrat i PBS) (Cycle Plus DNA Farging Kit, Becton Dickinson, USA). Cellene ble deretter analysert ved flowcytometri å bruke en programvare dedikert for DNA-analyse (ModFit LT programvare, Verity Software House, Topsham, ME, USA). Cellene med subdiploid DNA-innhold ble kvantifisert for å bestemme prosentandelen av celler som inneholder apoptotiske, fragmentert DNA.
reagenser som brukes for å indusere apoptose av tumorceller
eggstokk-kreft-celler ble preinkubert med et pan-caspase -inhibitor, N-benzyloksy-karbonyl-Val-Ala-Asp (OMe) -fluoromethylketone (zVADfmk) eller N-benzyloksy-karbonyl-Ile-Glu (OMe) Thr-Asp (OMe) -fluoromethylketone (zIETDfmk), (begge fra Sigma, St. Louis, USA) før tilsetting av de forskjellige forbindelser stimulerende apoptose.
agonistiske monoklonale antistoffer til TRAIL-R1 (MAPATUMUMAB) og TRAIL-R2 (LEXATUMUMAB) er fullt humane antistoffer av IgG1 isotype [23 ], [24] og ble sjenerøst gitt av human Genome Science (Rockville, MD, USA).
Behandling med kreft narkotika
I noen eksperimenter eggstokkreft celler har blitt inkubert med noen kreft narkotika som vanligvis anvendes i eggstokk-kreft terapi: cis-diamineplatinum (II) klorid (CPLAT); paclitaxel (TAXOL); Topotecan Hydrichloride hydrat (TOPO); Etoposide (Etopo); Doksorubicinhydroklorid (DOXO). Alle disse medikamentene ble kjøpt fra Sigma Co (St. Louis, USA) og ble tilsatt
in vitro
ved to doser: en lav dose som svarer til den gjennomsnittlige plasmatoppnivået observert i løpet av legemiddelinfusjoner til kreftpasienter (dvs. 1,67 uM for CPLAT; 2,45 uM for Taxol, 0,21 uM, 8,5 uM for Etopo;. 0,17 uM for DOXO) og en høy dose, svarende til et fem ganger høyere dose enn den lave dosen
Western blot-analyse
Hele celleekstrakter ble erholdt lysering av cellene i en buffer inneholdende 20 mM HEPES, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 2 mM EGTA, 0,5% NP-40, 1 mM DTT, 0,1 mM PMSF, 2 ug /ml leupeptin, 2 ug /ml aprotinin, 25 mM NaF, og 10 mM Na
3VO
4. Etter inkubering i 30 minutter på is, ble proteinlysatene tømmes for avfall ved sentrifugering ved 10.000 g i 10 min. Proteinkonsentrasjonen i den oppløselige supernatanten, ble bestemt ved bruk av Bio-Rad proteinanalyse (Bio-Rad, Richmond, VA, USA).
A- HEI-celler er blitt inkubert i 24 timer enten i fravær ( kontroll) eller i nærvær av LBW242 (30 uM) eller av enten Cisplatin (CPLAT ved 1,6 eller 8 mm) eller Paclitaxel (TAXOL ved 2,5 eller 12,5 uM) eller Topotecan (TOPO ved 0,2 eller 1 uM) eller Etoposid (Etopo ved 8 eller 40 uM) eller Doxorubicin (DOXO på 0,17 eller 0,85 um) alene eller i kombinasjon med LBW242 og analysert for induksjon av celledød ved strømningscytometri. Dataene representerer middelverdier ± SEM observert i tre separate eksperimenter. Statistisk analyse: * p = 0,05; ** P = 0,01; *** P = 0,001. B – HEI-celler er blitt inkubert i 24 timer i nærvær av økende konsentrasjoner av LBW242either i fravær (kontroll) eller i nærvær av Cisplatin (1,6 pM) eller Paclitaxel (2,5 pM) eller Topotecan (0,2 uM) og analysert for induksjon av celledød ved strømningscytometri. Dataene representerer middelverdi ± SEM observert i tre separate eksperimenter. Forskjellene mellom kontroll og Topotecan (p = 0,001), kontroll og paclitaxel (p = 0,001) og kontroll og Cisplatin (p = 0,05). Var betydelig
A- LBW242 forsterker proapoptotiske effekten av topotekanhydroklorid, en topoisomerase inhibitor. A2780WT Pinco og FLIP (
toppfeltene
) og SKOV3 Pinco og FLIP (
bunnplater
) celler har blitt inkubert i 24 timer enten i fravær (kontroll) eller i nærvær av enten DMSO 0,01% eller zVAD-FMK 40 mikrometer, topotekanhydroklorid 1fiM, TRAIL 50 ng /ml eller LBW242 + zVAD-FMK, LBW242 + topotekanhydroklorid, TRAIL + zVAD-FMK, TRAIL + topotekanhydroklorid, topotekanhydroklorid + zVAD-FMK, LBW242 + TRAIL, LBW242 + TRAIL + zVAD-FMK, LBW242 + topotekanhydroklorid + zVAD-FMK og analysert for induksjon av apoptose ved flowcytometri. Dataene representerer middelverdier ± SEM observert i tre separate eksperimenter. I A7280 WT Pinco og SKOV3 Pinco celler LBW242 + TOPO indusert en andel av døde celler som er høyere enn det som ble observert med enten LBW242 (p = 0,05) eller TOPO (p = 0,05). B og C – Evaluering av caspaser-8-aktivering i A2780 og A2780ADR celler inkubert enten i fravær (kontroll) eller i nærvær av LBW242 eller av Topotecan eller av begge deler LBW242 og Topotecan. Caspase-8-aktivitet i intakte celler ble målt ved anvendelse av en caspaser-8 spesifikk fluorigenic substrat. Opprinnelige resultater fra en representativ analyse er gjengitt i B, mens de midlere verdier ± SEM av prosentandelen av celler som viser kaspase-8-aktivering er angitt i C. Prosentdelen av celler som oppviser aktivert caspaser-8 var høyere både for WT og ADR celler i LBW242 enn i NT celler (p = 0,05) og i LBW242 + TOPO enn i LBW242 eller TOPO-behandlede celler (p = 0,05)
Antistoffer
Anti. -caspase -9, -3 ble kjøpt fra Upstate (Upstate Bioteknologi Lake Placid NY, USA og R D Systems Inc. Minneapolis, Minnesota, USA); Anti-XIAP og anti-BCL-2 ble kjøpt fra BD Pharmigen (BD Pharmigen, San Diego, USA); anti-Survivin og anti-PARP ble kjøpt fra R D System (R D System Inc., Minneapolis, MN); anti-FADD ble kjøpt fra Biosource (Biosource, Camarillo, CA, USA); anti-c-FLIP (klone Sf6) og anti-c-IAP ble kjøpt fra Alexis (Alexis Biochemicals, San Diego, CA, USA); anti-aktin fra Oncogene (onkogen forsknings Products, Cambridge, MA), ble brukt som lasting kontroll.
Statistical Analysis
Statistisk analyse ble utført ved hjelp av Graph Pad Program. Alle parametre ble rapportert som betyr ± SEM. Å sammenligne forskjell mellom gruppene, ble robust ANOVA utført. P-verdiene rapportert var tosidig. En P-verdi på mindre enn 0,05 indikert statistisk signifikans. Isobologram analyse ble utført ved hjelp av CalcuSyn programmet (Biosoft, MO, og Cambridge, UK). En kombinasjon indeks (CI) mindre enn 1,0 indikerer synergisme, en en CI på 1,0 indikerer additiv aktivitet [25].
Resultater
LBW242 forbedrer TRAIL-mediert celledød av eggstokkreft cellelinjer
i våre tidligere studier viste vi den pro-apoptotiske effekt av SMAC /DIABLO mimetisk forbindelse 3 i eggstokkreft cellelinjer A2780WT og deres motstandsdyktig motstykke A2780DDP og A2780ADR [26]. I denne studien undersøkte vi effekten av en annen SMAC /DIABLO mimetisk, LBW242, på eggstokkreft modeller. Først må vi utforsket celleproliferasjon på en dose-responstest av LBW242 alene og i kombinasjon med TRAIL (fig. 1A). Cellelinjen A2780WT (
øvre venstre panel
) ble bare litt hemmet i sin vekst ved LBW242 lagt alene; Men den kombinerte behandling av LBW242 med TRAIL resulterte i en markert synergistisk inhibering av cellevekst. Samme type sensitivitet ble observert for HEY cellelinje (
nederst i venstre panel
). Isobologram analyse bekreftet synergistisk anti-tumor aktivitet av LBW242 pluss TRAIL (for A2780WT CI = 0,77 og HEY CI = 0,80). Den synergistiske interaksjonen av LBW242 og TRAIL i A2780WT og Hei cellelinjer kan intuitivt visualisert ved å plotte cellevekst data ved hjelp av målinger ved LBW242 0 uM med og uten TRAIL som 100%, og alle etterfølgende målinger uttrykt i forhold til sin egen kontroll (se fig. S1). Denne figuren viser en ytterligere reduksjon i celletallet på grunn av tilsetning av LBW242 på toppen av det indusert av TRAIL alene (Fig. S1).
grå søyler representerer middelverdier ± SEM. Eggstokkreft celler isolert fra tumor biopsier har vært dyrket i 24 timer, enten i fravær eller i nærvær av LBW242 (10 mm) eller av TRAIL (50 ng /ml) eller begge agenter i de ovennevnte konsentrasjoner.
Nedre panel på høyre
: Andelen av døde celler var høyere i LBW242 eller TRAIL eller LBW242 + TRAIL-behandlede celler enn i kontroll ikke-behandlede celler (p = 0,01); Videre er andelen av døde celler var lavere i LBW242 + TRAIL enn i TRAIL eller LBW242-behandlede celler (for både p = 0,05).
Nedre panel på venstre
: Celle antallet var betydelig lavere i LBW242 + TRAIL enn i TRAIL eller LBW242-behandlede celler (for både p = 0,05)
A2780ADR og SKOV3 (
høyre panel
) cellelinjer var det mest fornuftige å hemmende effekt LBW242 på celleproliferasjon, som moderat ble økt med TRAIL tillegg. Isobologram-analyse viste en additiv effekt av LBW242 pluss TRAIL til å inhibere veksten av disse cellelinjer (for A2780ADR KI = 0,97; for SKOV3 KI = 1,0).
Den samme behandling ble utført på A2780WT og SKOV3 cellelinjer til evaluere effekten av LBW242 på prosentandelen av apoptotiske celler (fig. 1B). De A2780WT Cellene ble neppe følsomme for de enkelte behandlinger med enten LBW242 eller TRAIL alene, men svært følsomme for den kombinerte behandling (CI = 0,70). SKOV3 celler var følsomme for den pro-apoptotiske effekt av LBW242, men neppe følsomme for TRAIL; den kombinerte tilsetningen av de to legemidlene ytterligere øket frekvensen av apoptose (CI = 0,79) (figur 1B).
Disse data indikerer at:. ovarie cancer-cellelinjer er følsomme for LBW242 effekter, spesielt ved kombinert behandling med STI; LBW242 utøver en synergistisk eller additiv anti-tumor aktivitet med TRAIL i eggstokkreft cellelinjer.
Forsøk utført ved hjelp av agonistisk anti-TRAIL-R1 (MAPATUMUMAB) eller anti-TRAIL-R2 (LEXATUMUMAB) mAbs gitt bevis for at sistnevnte legges sammen med LBW242 indusert en høy grad av apoptose av alle de fire eggstokkreft cellelinjer her studert (data ikke vist).
c-FLIP
L overekspresjon hemmer pro-apoptotiske effekt av LBW242
i tidligere studier ble det vist at under TNFa-stimulering, caspase-8 er en kritisk apoptotisk protease i IAP antagonist-indusert celledød [27] – [30]. Å utforske en mulig rolle caspase-8 aktivering i LBW242-mediert celledød, brukte vi cellelinjer stabilt transfektert med c-FLIP
L (A2780WT FLIP, A2780ADR FLIP og SKOV3 FLIP), en naturlig caspase-8-hemmer. A2780WT, A2780ADR og SKOV3 celler uttrykker lave nivåer av c-FLIP, c-FLIP
L som er den eneste isoform påvises i disse cellene (fig. 2 og fig. S2). I motsetning til dette, som det er forventet, A2780WT FLIP, A2780ADR FLIP og SKOV3 FLIP uttrykker høye nivåer av c-FLIP
L (fig. 2 og fig. S2). C-FLIP
S var umulig å oppdage i alle disse cellelinjene (fig. S2).
Spesielt i A2780WT, ADR og SKOV3 celler (fig. 2,
venstre panel
s
) transfektert med tom vektor (Pinco), den eneste behandlingen med LBW242 eller TRAIL induserer en moderat apoptotisk effekt, mens den kombinerte behandlingen av LBW242 med TRAIL induserer en bemerkelsesverdig økning i celledød. I disse cellene overekspresjon c-FLIP
L (fig. 2,
panel midt
s
) effekten av LBW242 behandling alene eller i kombinasjon med TRAIL er svært hemmet, og dermed støtte hypotesen om at SMAC /DIABLO etterligning kan handle gjennom induksjon av en caspase-8 aktiveringsveien
for å oppnå dette celler ble også behandlet med en pan-caspase inhibitor zVAD, eller med en bestemt caspase-8-hemmer, zIETD.; i fig. 3 prosenten av celledød ble rapportert. Som forventet zVAD beskytter cellene fra apoptotisk effekt av både single og kombinasjonsbehandlinger, og dermed indikerer caspaseaktivering engasjement i LBW 242 + TRAIL-mediert celledød. Dessuten er det mulig å merke seg at effekten av zIETD er sammenlignbar med zVAD, og således indikerer en nøkkelrolle av caspase-8-aktivering i henhold til den kombinerte virkning av LBW242 og TRAIL-behandlinger (fig. 3,
venstre panel
s
).
LBW242 lagt sammen med TRAIL indusert caspase-8 aktivering
biokjemiske analyser ble utført ved å undersøke uttrykket av ulike proteiner som er involvert i apoptotiske sti i A2780WT Pinco, A2780ADR Pinco, SKOV3 Pinco og A2780WT FLIP, A2780ADR FLIP og Skov FLIP cellelinjer behandlet som ovenfor nevnt. På fig. 4 A, B og C etter 24 h behandlinger, er det mulig å merke seg at XIAP nivåer ikke blir påvirket av LBW242. Dette funnet er i tråd med tidligere studier som viser at LBW242 hemmer XIAP aktivitet, uten at dette påvirker uttrykket [17] – [21]. Som forventet på grunnlag av tidligere rapporter [17] – [21], LBW242 dramatisk downmodulates c-IAP1 nivåer, et fenomen klart til syne i alle cellelinjer, inkludert de som overuttrykker c-FLIP
L. Behandling av eggstokkreft cellelinjer med LBW242 indusert en effekt på c-IAP2 ekspresjon er svært forskjellig fra den som ble observert for c-IAP1. Faktisk, 24 timers eksponering av cellene til LBW242 induserte en tydelig upmodulation av c-IAP2 nivåer (Fig. 4), i samsvar med en tidligere rapport [31]. Som det er forventet, fikk c-FLIP
L overekspresjon ikke endre effekten av LBW242 på c-IAP2 nivåer (Fig. 4). På den annen side, TRAIL induserte en moderat økning av c-IAP2, et funn i samsvar med tidligere studier [32]. Spesielt, c-FLIP overekspresjon hindret stimulerende effekt av TRAIL på c-IAP2 nivåer (Fig. 4). Den kombinerte behandlingen med LBW242 og TRAIL resulterte i en markant upmodulation av c-IAP2 nivåer (Fig. 4). Videre LBW242 ikke klarte å indusere enten caspase-8, caspase-9 eller caspase-3-aktivering, slik det kan utledes fra det ikke foreligger noen betydelig reduksjon av procaspase-8, -9 og -3 nivåer og av utseendet av aktiv caspase spaltede fragmenter (se fig. 4 A til C og S3 fig.). I samsvar med disse funn LBW242 mislyktes i å fremkalle spaltning av PARP, et følsomt mål på aktivert kaspase-3 (figur 4A til C).
Når LBW242 ble tilsatt sammen med TRAIL merkbart forsterker virkningen av denne død ligand med caspase-8 og kaspase-3 aktivering og på PARP-spaltning på A2780 WT, A2780 ADR og SKOV tre cellelinjer transfektert med den tomme vektorene, men ikke i de som overuttrykker c-FLIP
L (fig. 4 A til C) . Det er viktig å merke seg at caspase-8-aktivering, utløst av TRAIL, og det meste av LBW242 + TRAIL, fører til degradering BID, og dermed oppnå aktivering av den indre apoptotiske reaksjonsvei (fig. 4 A til C). Bud degradering ble nesten helt forhindret av c-FLIP overekspresjon (Fig. 4 A til C).
LBW242 forbedret pro-apoptotiske effekten av kreftmedisiner på eggstokkreft celler
standard medisinsk behandling av eggstokkreft innebærer i første rekke bruk av Platin og taxol kreft narkotika. Derfor virket det av interesse å vurdere et mulig samarbeid effekt av enkelte kreftmedisiner, slik som cisplatin, taxol, topotekan, etoposid og doxorubicin i kombinasjon med LBW242. Således, i et første sett av eksperimenter vi behandlet HEI celler med cisplatin eller paclitaxel eller Topotecan eller etoposid eller doksorubicin, tilsatt i to doser, en lavere kliniske dosen som tilsvarer den høyeste dosen observert under infusjon av disse stoffene til kreftpasienter og en 5 ganger høyere supraclinical dose, alene eller i kombinasjon med et platå dose av LBW242 (30 uM). Resultatene av dette forsøk viste klart at LBW242 var i stand til å potensiere de cytotoksiske effektene av alle disse stoffene (Fig. 5A). Isobologram analyse viste synergistisk antitumoraktivitet av LBW242 pluss Cisplatin (CI = 0,82), eller i tillegg til paclitaxel (CI = 0,70) eller pluss Topotecan (0,72) eller pluss Etoposid (CI = 0,73) eller pluss Doxorubicin (p = 0,78). I et annet forsøk ble det undersøkt kapasiteten av forskjellige doser av LBW242 for å forsterke cytotoksisiteten indusert av en klinisk dose av cisplatin, taxol eller Topotecan. Dette forsøk viste at LBW242 på en doseavhengig måte økes den cytotoksiske respons på disse stoffene, å oppnå de maksimale virkninger ved 20-30 uM doseringer (Fig. 5B). Isobologram analyse viste synergistisk antitumoraktivitet av LBW242 pluss Topotecan (CI = 0,70) eller Taxol (CI = 0,71), eller cisplatin (CI = 0,82).
basert på disse funnene, i et andre sett forsøk vi fokusert vår oppmerksomhet på kapasiteten til LBW242 å forsterke effekten av Topotecan, et stoff som brukes i eggstokkreft behandling og kjent som en potensiell caspase-8 aktivator [33].
i fig. 6A er det mulig å merke seg at Topotecan utøver en markant pro-apoptotisk effekt da lagt i kombinasjon med LBW242 og TRAIL i A2780WT Pinco celler; celledød av kreftceller forårsaket av disse midler når de brukes i kombinasjon er sterkt hemmet av de pan-kaspaseinhibitor zVAD-FMK og derfor er hovedsakelig formidlet gjennom caspaseaktivering.
I A2780WT FLIP-celler den apoptotiske induksjon forårsaket av sammenhengen mellom LBW242, TRAIL og Topotecan er nesten fullstendig hemmet, og dermed tyder på en stor rolle for caspase-8 i induksjon av tumor celledød (fig. 6A).
Disse observasjonene har blitt bekreftet i SKOV3 Pinco og SKOV3 FLIP-celler (fig. 6A). En rolle for caspases-8 aktivering i topotekanindusert død av eggstokkreft celler ble videre støttet av eksperimenter av kvantifisering av caspases-8 aktivering.
