Abstract
Bakgrunn og mål
Prostatakreft (PCA) er en av de vanligste kreftformene og ledende årsak til kreft dødsfall hos menn. Mass screening har blitt gjennomført siden 1990-tallet ved hjelp av prostataspesifikt antigen (PSA) nivåer i serum som PCA biomarkør. Imidlertid, selv om PSA er et utmerket organspesifikk markør, er det ikke en kreft-spesifikk markør. Derfor er målet med denne studien var å finne nye biomarkører for diagnostisering av PCa.
Materialer og metoder
Vi har fokusert på urinprøver annullert etter prostata massasje (digital rektal undersøkelse [DRE]) og gjennomførte en peptidomic analyse av disse prøvene ved hjelp av matrise-assistert laser desorpsjon /ionisering time-of-flight massespektrometri (MALDI-TOF /MS
n). Urin biomaterialer ble konsentrert og avsaltet ved hjelp av CM-Sepharose før den følgende analyser utføres ved MALDI-TOF /MS
n: 1) differensialanalyse av massespektra; 2) bestemmelse av aminosyresekvenser; og 3) kvantitative analyser ved hjelp av en stabil isotop-merket intern standard.
Resultater
multivariat analyse av MALDI-TOF /MS massespektra av urin ekstrakter avdekket en 2331 Da peptid i urinprøver etter DRE. Dette peptid ble identifisert som en C-terminal PSA fragment sammensatt av 19 aminosyrerester. Videre kvantitativ analyse av forholdet mellom isotop-merkede syntetiske og intakte peptider ved hjelp av MALDI-TOF /MS viste at dette peptid kan være en ny karakteristisk for sykdommen biomarkør kandidaten som kan skille PCA-pasienter fra ikke-kreft fag.
Konklusjon
resultatene fra denne studien tyder på at 2331 Da peptid fragment av PSA kan bli en ny patognomonisk biomarkør for diagnostisering av PCa. En ytterligere storstilt etterforskning pågår nå for å vurdere muligheten for å bruke dette peptid i tidlig deteksjon av PCa
Citation. Nakayama K, Inoue T, Sekiya S, Terada N, Miyazaki Y, Goto T, et al. (2014) Den C-terminale fragment av prostataspesifikt antigen, en 2331 Da Peptide, som en ny urin patognomonisk Biomarker Kandidat for diagnose prostatakreft. PLoS ONE ni (9): e107234. doi: 10,1371 /journal.pone.0107234
Redaktør: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, Østerrike
mottatt: 12 juni 2014; Godkjent: 08.08.2014; Publisert: 18.09.2014
Copyright: © 2014 Nakayama et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er innenfor papir
Finansiering:. Denne forskningen ble gitt av Japan Society for Promotion of Science gjennom «Virkemidler for verdensledende Innovativ R D for vitenskap og teknologi (FIRST Program) «, initiert av Rådet for vitenskap og teknologi for personvern. Den Funder hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. Shimadzu Corporation gitt støtte i form av lønn for forfattere, Sadanori Sekiya, Shigeki Kajihara, Shin-Ichiro Kawabata, Shinichi Iwamoto og Koichi Tanaka, men ikke har noen ekstra rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. De spesifikke roller disse forfatterne er formulert i § forfatteren bidrag «
Konkurrerende interesser:. Sadanori Sekiya, Shigeki Kajihara, Shin-Ichiro Kawabata, Shinichi Iwamoto og Koichi Tanaka er ansatt av Shimadzu Corporation. Det finnes ingen patenter, produkter under utvikling eller markedsført produkter å erklære. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer, som beskrevet på nettet i veiledningen for forfatterne.
Innledning
Prostatakreft (PCA) er en av de vanligste kreftformene og den ledende årsak til kreft dødsfall hos menn [1]. Mekanismene bak utviklingen av PCa har ennå ikke blitt fastslått på grunn av sin kliniske og histologiske heterogenitet. Insidensen for PCA har markert økt i Japan nylig [2], [3]. Den store klinisk påvisning av prostata-spesifikt antigen (PSA) nivåer i serum som en PCa biomarkør er blitt utført siden 1990-årene [3] – [7]. Selv om den generelle fordelene og ulempene ved befolkning PSA screening for prostatakreft fortsette å bli vurdert [8], er PSA kjent for å være et utmerket organspesifikk, men ikke en cancer-spesifikk markør [9], som fortsetter å være et klinisk problem . Dette er ytterligere forsterket av den lengre levende, aldrende befolkning og forhøyede PSA nivåer forbundet med økende alder [3], [10].
Selv om følsomheten av PSA i påvisning av kreft er høy, er dens spesifisitet begrenset, og screening friske menn ofte fører til falske kreft alarmer (f.eks på grunn av betennelse eller hyperplasi) og unødvendige prostatabiopsier [3], [11]. Flere problemer har blitt identifisert med hensyn til sub-optimal følsomhet av PSA-testing for PCa screening, noe som fører til unødvendige biopsier, overdiagnoses, og overtreatments [12] – [17]. En betydelig mengde arbeid i forskning blir nå rettet mot å forbedre nøyaktigheten av PCa screening [12]. Dessuten har en sterk lagt vekt på behovet for å identifisere nye biomarkører for diagnostisering av PCa.
proteomikk teknikker som for serum, plasma og urin kan gi verdifull informasjon om biomarkører og merke mønstre, som kan være anvendes for å forbedre deteksjon av kreft [18]. I denne studien har vi fokusert på urinprøver annullert etter prostata massasje (digital rektal undersøkelse [DRE]), som var forventet å inneholde mange peptider og proteinfragmenter skilles fra prostata microenvironments som kan gjøre det mulig å påvise utskilles prostata produkter som potensielle kilder til PCA- spesifikke biomarkører [18], [19]. Derfor gjennomførte vi peptidomic og proteomikk analyser av urinprøver ved hjelp av matrise-assistert laser desorpsjon /ionisering time-of-flight massespektrometri (MALDI-TOF /MS
n) for å oppdage nye potensielle patognomonisk biomarkør kandidater for diagnostisering av PCa.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Denne studien ble gjennomført med godkjenning av etikkomiteen av Kyoto-universitetet Graduate School of Medicine. Informert samtykke ble innhentet fra alle tilfeller for undersøkelser og eksperimenter utført. Kliniske materialer ble brukt etter skriftlig informert samtykke ble innhentet, ifølge protokoller godkjent av Institutional Review Board of Kyoto universitetssykehus.
Pasienter
De individene som urinprøver ble samlet inn følgende prostata massasje ( digital rektal undersøkelse [DRE]) ble klassifisert i 2 grupper; dvs. PCA pasienter og ikke-cancer fag. Den bekreftende diagnostisering av PCa ble gjort av en histologisk diagnose fra prostata biopsi prøver eller prostata glands fjernet etter operasjonen, når utført. Femti Prøver ble oppsamlet fra PCA pasienter, og deres kliniske karakteristika er vist i tabell 1. De kliniske karakteristika for ikke-kreft pasienter ble vist i tabell 2. Alle urinprøver fra ikke-kreft gruppen var samlet før holmium laser enucleation av prostata (HoLEP), transuretral reseksjon av prostata (TURP) og nål biopsi av prostata, når utført. De diagnoser av ikke-kreft fag ble definert som ikke-ondartet ved histologiske diagnoser av prostata kjertler fjernet av HoLEP og TURP og prostata prøver innhentet av nål biopsi, bortsett fra to tilfeller (nr 14 og 15) som ikke fikk nål biopsi på grunn av svært lav serum PSA og normal DRE. Nitten ikke-cancerprøver ble samlet. Alle histologiske diagnoser ble bekreftet av urin patologer i vårt sykehus.
Kjemikalier og reagenser
Tris [hydroksymetyl] aminometan (tris), Triton X-100, og urea var kjøpt fra Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA). Molecular Biology Grade 3 – [(cholamidopropyl) dimetylammonio] -1-propan (CHAPS) ble kjøpt fra Calbiochem (San Diego, California, USA). Alt vann som brukes i dette eksperimentet, med unntak av HPLC-systemet, ble fremstilt ved anvendelse av et Milli-Q-system (Millipore, Bedford, MA, USA). Acetonitril (ACN) med og uten 0,1% maursyre (FA), og vann med og uten 0,1% FA for LC-MS Chromasolv ble kjøpt fra Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA). Alle andre reagenser var av høyeste kvalitet kommersielt tilgjengelig
Urinprøve samling
Urinprøver ble samlet inn som følger:. En urolog utført DRE ved å forsiktig masserer hver side av prostatakjertelen tre ganger, noe som stimulerte bevegelse og frigjøring av prostata fluider inn i urinrøret. Disse prostata væske ble samlet når de fagene annullert urinen etter massasje. Urinprøvene ble samlet inn filtreres med 100-um nylon celle siler (BD Falcon, San Jose, CA, USA) og sentrifugert ved 2000 x g i 10 minutter ved 20 ° C for å utelukke urin rusk. Etter sentrifugering, ble supernatantene filtreres igjen med celle siler. Den filtrerte supernatant av urinprøvene ble lagret ved -80 ° C til senere analyser.
Urinprøve forberedelse
I denne studien, urin peptider og proteinfragmenter fanget ved ionebytting Sepharoseresin ble analysert ved hjelp av MALDI-TOF /MS
n. CM-Sepharose Fast Flow (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) ble anvendt som et ione-bytterharpiks for å fange opp og konsentrere de peptider og proteinfragmenter i urinprøven, så vel som for å avsalte konsentrerte prøver. En in-house bygget MALDI digital ionefelle (DIT) TOF /MS
n produsert av Shimadzu Corporation (Kyoto, Japan) ble benyttet for masse spektrum analyse. Differential analyser av urinmassespekter data mellom 2 faggrupper (ikke-kreft og PCA) ble utført ved hjelp av ion-fellen reflectron måte MALDI-DIT-TOF /MS. Peak identifikasjoner ble også utført i reflectron ion-felle modus. Peak lister hentet fra MS
2 spektra ble brukt til å identifisere aminosyresekvens med Mascot MS
søk 2 motor (Matrix vitenskap, London, UK).
Frosne urinprøver (1,0 ml) ble tint ved sentrifugering ved 1000 x g i 15 minutter ved 20 ° C. Fire hundre pl av lyseringsbuffer (9 M urea, 2% CHAPS, 50 mM Tris, pH 9) ble tilsatt til hver urinprøve og blandingene ble inkubert i 30 minutter ved 4 ° C med rotasjon. De denaturerte urinprøver ble tilsatt til 3,6 ml bindingsbuffer (100 mM ammoniumacetat, pH 4, 0,05% Triton-X). Nitti mL av 30% aktivert CM-Sepharose ble tilsatt til hver av de ovennevnte bindingsbuffer blandinger og virvlet godt. Rørene ble inkubert i 30 minutter ved 4 ° C med rotasjon. Etter å ha blitt inkubert ble rørene sentrifugert ved 1000 x g i 10 minutter ved 20 ° C. Supernatantene ble forkastet med en 5-ml Finnpipette F1 (Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Finland). Bunnfallet, CM-Sepharose-fangede peptider og proteinfragmenter, ble overført til 1,5 ml mikrorør.
Harpiksene ble vasket tre ganger med bindingsbuffer og destillert vann for LC-MS. Vasking involverte sentrifugering (3000 x g i 3 minutter ved 20 ° C med bindingsbuffer og 5000 x g i 3 minutter ved 20 ° C med destillert vann), forkaste supernatantene, og tilsetning av vaskeløsninger. I det siste vasketrinn, ble rørene sentrifugert ved 10.000 x g i 5 minutter ved 20 ° C og så mye vasking destillert vann som mulig ble trukket tilbake. Tjuefem ul av 1% trifluoreddiksyre (TFA) oppløsning ble tilsatt til CM-Sepharose-harpiks for å eluere de fangede peptider og proteinfragmenter, og pipettert godt i 2 min. Rørene ble sentrifugert ved 12000 x g i 5 minutter ved 20 ° C. Bare supernatanter ble tatt ut og overført til andre mikrorør. Rørene ble sentrifugert ved 14000 x g i 5 minutter ved 20 ° C, og supernatantene ble overført til andre mikrorør. Disse supernatanter fungert som urinprøve ekstrakter.
Vi målrettet intakte peptider og proteinfragmenter mellom 1000 og 5000 Da i urinprøver fordi deres aminosyresekvenser kan være direkte bekreftet av MALDI-DIT-TOF /MS
2 i dette molekylvektområde.
DHB matriks og MALDI plate
DHB (2,5-dihydroksybenzosyre) matriseoppløsning ble fremstilt ved å oppløse 5 mg av DHB (LaserBio Labs, Sophia- Antipolis Cedex, Frankrike) i 500 pl av 50% acetonitril /0,1% TFA. I DHB matrise analyse ble en 0,5 pl prøve av eluatet blandes med et likt volum av DHB matriseoppløsning. De forhåndsblandede Prøvene ble prikket på følgende plater og lufttørket ved romtemperatur; μFocus MALDI plate 900 mikrometer (384 sirkler, HST, Inc., Newark, NJ, USA) for differensial analyser av massespektra eller en 384-stilling i rustfritt stål sikteplate (Shimadzu Biotech, Kyoto, Japan) for kvantitative analyser av en potensiell biomarkør for diagnostisering den av PCa.
massespektrometrisk Målinger
i MALDI-DIT-TOF /MS
n, argongass ble brukt for kollisjon-indusert dissosiasjon fragmentering, og heliumgass ble brukt for ion kjøling. MS og MS
n analyser ble utført på positive ion utvinning modus. Alle analyser ble utført i høyvakuum tilstand (5 x 10
-5 Pa eller mindre).
Massespektra ble eksternt kalibrert med en manuelt fremstilt 7-peptid standard bestående av angiotensin II ([M + H]
1046,54), angiotensin I ([M + H]
1296,69), Glu-fibrinpeptid B ([M + H]
1570,68), N-acetyl-renin-substrat ([M + H]
1800,94), ACTH (1-17) ([M + H]
2093,09), ACTH (18-39) ([M + H]
2465,20), og ACTH ( 7-38) ([M + H]
3657,93)
Målebetingelsene betingelsene~~POS=HEADCOMP i differensialanalyse av massespektra ble fiksert på følgende måte:. 1) en μFocus plate ble brukt som skyteskiven, 2 ) den laserbestråling-posisjonene ble manuelt fokusert til prøve-matriks-blanding fra hver brønn, 3) antall bestrålingspunkter var 100, 4) antall bestrålings skudd var 64, og 5) den lasereffekten ble løst ved 85 vilkårlige enheter. Totalt 6400 spektra ble målt per brønn. Analyser ble utført i duplikat og en uttrukket prøve ble plassert i 2 brønner. Derfor, ble dataene i en urinprøve som består av 4 rådatapunkter med 6400 spektra. Variasjonskoeffisienten om intensiteter på flere store topper, spesielt på en biomarkør kandidat topp, ble mindre enn 10% under disse analysebetingelsene (data ikke vist).
Data behandling av MS spektrum data og multivariat analyse
Massespektrum spektrum~~POS=HEADCOMP rådata ble eksportert gjennom DIT-FP Console-programvaren (Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan) for MALDI-DIT-TOF /MS som mzXML filer og importert til MATLAB programvareversjon 7.11 (The Mathworks Inc., Natick, MA, USA). MATLAB ble støttet av Bioinformatikk Toolbox og statistikk Toolbox. Følgende databehandling ble utført ved hjelp av verktøykasse funksjoner for å oppdage og justere topper fra flere spektra. 1) En jevn spektrum ble oppnådd ved bruk av lokalt vektet spredningsplott glatting (mslowess funksjon [20]). 2) Basis ble subtrahert fra spekteret ved anvendelse av en spline tilnærmelse (msbackadj funksjon [21]). 3) Spekteret ble normalisert ved å dividere med den totale ionestrøm. 4) topper ble påvist ved å filtrere støy med undecimated diskrete wavelet-transformasjon (mspeaks funksjon [22]). 5) Peak lister ble samlet inn flere spektra ved å gjenta behandlingen fra 1) til 4). 6) Peak lister ble justert for å matche topper over spektra (mspalign funksjon [23]). CSV-formaterte topplistene ble deretter eksportert fra MATLAB og importert inn i en multivariat analyse programvare, dvs. Simca 13.0.3 (Umetrics AB, Umeå, Sverige, [24], [25]). Alle importerte data var Pareto skalert før multivariat analyse. Hovedkomponentanalyse (PCA) ble anvendt for uten tilsyn multivariate analyser, og ortogonale Partial Least Squares diskriminant analyse (OPLS-DA) ble brukt for korrekt multivariate analyser. PCA og OPLS-DA modellene ble avbildet som rille tomter (hovedkomponent [PC1, PC2]), som viste noen iboende gruppering av prøvene basert på spektrale variasjoner. I OPLS-DA-analyse, ble potensielle biomarkører velges basert på S-plot. Plottet av kovarians versus korrelasjonen i forbindelse med de variable trendplottinger resulterte i lettere visualiseringen av data. Variablene som forandret de fleste ble plottet på toppen eller bunnen av «S» formet tomten, og de som ikke varierer betydelig ble plottet i midten.
Peptidrensning og Edman degradering
i Edman degradering analyser av den N-terminale aminosyresekvens til
m /z
2332 peptidet, rensing av peptidet ved omvendt-fase HPLC ble utført ved bruk av en Shimadzu LC-20AD serie HPLC-system utstyrt med en SPD-M20A diode array detektor (Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan). En Luna C-18 kolonne (5 um partikkelstørrelse; 4,6 mm ID x 250 mm, Phenomenex, Torrance, CA, USA) ble benyttet for renseprosessen. HPLC-betingelser var som følger: kolonne ovnstemperatur den var 40 ° C, strømningshastigheten var 1,0 ml /min, vann med 0,1% FA og ACN med 0,1% FA ble anvendt som løsningsmidler A og B, henholdsvis gradienten tilstanden ble opprettholdt ved 10%, som løsningsmiddel B, i 2 minutter etter en 20-mL prøveinjeksjon og var lineær fra 10% til 80% i 15 minutter. Eluerte peptider ble overvåket ved 276 nm. Peptidet eluerte mellom 6,6 minutter og 6,9 minutter ble slått sammen i en microtube.
automatisert Edman-degradering av den N-terminale aminosyre-sekvens ble utført på RP-HPLC-rensede peptider ved hjelp av en Procise Model 491 sequencer (Applied Biosystems , Inc., Foster City, CA, USA).
AQUA peptider og kvantitative analyser
Vi har fått ikke-merkede syntetiske peptider og stabile isotop-merkede syntetiske peptider fra Sigma-Aldrich Japan (Ishikari , Japan). En tilpasset AQUA peptid satt for massespektrometri ble syntetisert ved Sigma-Aldrich Japan til mer enn 95% renhet, ble porsjon i 1,0 nmol, og ble lagret som lyofilisert pulver ved -30 ° C inntil bruk. Aminosyresekvensen av den AQUA isotop-merkede peptid ble YTKVVHY [R-
13C
6 –
15N
4] KWIKDT [I-
13C
6 –
15N] VANP. Deretter molekylvekten økning i den isotop-merkede peptid (i forhold til den ikke-merkede peptid) ble 17 Da. Dette peptid ble anvendt som en indre standard (ISTD) for de kvantitative analyser av en potensiell kandidat biomarkør for diagnostisering av PCa. Aqua peptider ble oppløst til 1,0 pmol /ul bruker 1000 mL 10% (v /v) eddiksyre av LC-MS grade (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Stamløsning var (100 ul) ble anbragt i 500 mL mikrorør og ble lagret i -30 ° C inntil bruk.
Tyve pmol (20 pmol) av ISTD peptid (20 ul løsning) ble tilsatt i den blandingen oppløsning av urinprøven og lyseringsbuffer, og deretter inkubert i 30 minutter ved 4 ° C med rotasjon. De følgende fremgangsmåter ble utført i henhold til urinprøven fremstillingsmetode. Kvantitative analyser ble utført ved hjelp av MALDI-TOF-DIT /MS. I kvantitative analyser ved hjelp av MALDI-DIT-TOF /MS ble de målebetingelser løst som følger: 1) en rustfri stål målplate ble benyttet, 2) laserbestrålings posisjonene ble manuelt fokusert til prøve-matriks-blanding for hver brønn, 3) antall bestrålingspunkter var 200, 4) antall bestrålings skudd var 16, og 5) lasereffekt ble satt til 85 arbitrære enheter. En total på 3200 spektra ble målt per brønn. Analyser ble utført i duplikat og en uttrukket prøve ble plassert i 2 brønner. Derfor, ble dataene i en urinprøve som består av 12800 spektra. Denne fremgangsmåten ble henvist til og modifisert fra de metoder som er rapportert av Sogawa K., et al. [26] og Tyan YC., Et al. [27]. Konsentrasjonene av den biomarkør kandidaten ble beregnet på grunnlag av forholdet mellom topp-området på
m /z
2332 mot den ved
m /z
2349.
statistikker
Alle statistiske analysene i denne studien ble utført ved hjelp av JMP 10.0.2 statistisk programvare (SAS Institute Japan Inc., Tokyo, Japan). Mann-Whitney-Wilcoxon, også kalt Mann-Whitney U test ble benyttet for å identifisere en ikke-parametrisk signifikant forskjell mellom to grupper. Forskjeller med
p
verdier på mindre enn 0,05 ble ansett for å være betydelig. Receiver Operating karakteristiske (ROC) kurver estimert av statistisk programvare ble brukt for å vurdere nøyaktigheten av diagnostiske tester som ga kontinuerlig testresultater. Videre ble ROC-kurver benyttes til å vurdere prediktiv kraft av patognomonisk biomarkør identifisert i denne studien [28].
Resultater
Alder og serum PSA nivå er ikke signifikant forskjellig mellom ikke-kreft individer og pasienter PCA brukes som en oppdagelse angitt
for å vurdere masse~~POS=TRUNC forskjeller mellom urinprøver med 12 ikke-cancer fag og 15 PCA pasienter, de følgende analyser ble utført som en oppdagelse sett. Som vist i figur 1 a og b, ble ingen signifikante forskjeller observert i alders eller serum PSA-fordelinger mellom den ikke-kreft og PCA-grupper. Disse resultatene indikerte at alderstilpassede urinprøver kan anvendes i etterfølgende analyser.
Alder (a) og serum PSA (b) fordelte ikke-cancer fag og prostatakreft (PCA) pasienter som var vist. Ingen signifikante forskjeller ble observert i alder eller serum PSA mellom ikke-kreft pasienter (n = 12) og PCA pasienter (n = 15). Deres
p
verdier var 0,255 og 0,464, henholdsvis.
Masse spektra ved hjelp av MALDI-DIT-TOF /MS analyser
Høy oppløsning og høy følsomhet MALDI -DIT-TOF /MS
n ble benyttet for å analysere urin peptider og proteinfragmenter i den foreliggende undersøkelse. Den typiske massespektra av urin peptider og proteinfragmenter analysert ved anvendelse av ione-fellen reflectron måte MALDI-TOF DIT-/MS er vist i figur 2. Etter konsentrering og avsaltning av urinprøver av CM-Sepharose, ble elueringsmidlet ekstrahert med 1,0% TFA-løsning. DHB ble anvendt som MALDI matriks. Den massespektra av ekstraherte prøver fra a) ikke-kreft fag og b) PCA pasienter ble sammenlignet. Flere forskjeller ble påvist i disse massespektra mellom de to gruppene. Den mest markante toppen ble oppdaget på
m /z
2332,3.
Etter å konsentrere seg og avsalting urinprøver av CM-Sepharose ble elueringsmiddel ekstrahert med 1,0% TFA løsning. DHB ble anvendt som MALDI matriks. Figur 2a og 2b viser analyseresultatene av urin utdrag fra ikke-kreft fag og PCA pasienter.
Multivariate analyser av massespektra av urin ekstrakter hjelp Simca programvare
eksporteres peak-matrix-filer ved MATLAB ble importert til en multivariat analyse programvare, dvs. Simca 13.0.3. Alle importerte data ble Pareto skalert for multivariate analyser. Et hovedkomponentanalyse (PCA) ble først gjennomført på spektra av urinprøver for å bestemme hvorvidt massespektrum forskjell forelå mellom de ikke-kreft og PCA-grupper. En ortogonal partiell minste kvadraters diskriminant analyse (OPLS-DA) ble deretter anvendt for å maksimere kovarians mellom de målte data (topposisjonene og toppintensiteter) og sykdom klassifikasjon. En S-tomten ble brukt til å velge og vise til potensielle biomarkører kandidater av betydelige biomaterialer relatert til gruppen separasjon.
PCA scorer tomter i PC1 (R
2 = 0,217) og PC2 (R
2 = 0,148) viste uklare klynger mellom den ikke-kreft og PCA-grupper (R «sup> 2X [cum]: 0,556 og Q
2 [cum]: 0,271; figur 3a). I kontrast til OPLS-DA rille tomter preget PCA gruppen fra ikke-kreft gruppe (R
2X [cum]: 0,309, R
2Y [cum]: 0,722 og Q
2 [cum] : 0,058; figur 3b). Den OPLS-DA var en tilstrekkelig modell for å skjelne PCA-gruppen fra den ikke-kreft gruppen. En S-plot-analyse basert på den OPLS-DA-modellen i forhold til andelen av toppintensitetene av massespektra vedrørende PCa og ikke-kreft er vist i figur 3c. Peak intensiteter rundt
m /z
2332,3 ble isolert fra S-plot som nye potensielle patognomonisk biomarkører for å skille mellom de ikke-kreft og PCA grupper.
(a) PCA poengsum plottet indikerer diskrimineringen mellom ikke-kreft og PCa i oppdagelsen settet. (B) OPLS-DA poengsum plott som viser en klar forskjellsbehandling mellom ikke-kreft og PCa. (C) S-plott som svarer til den OPLS-DA resultatet plottet vist i figur 3b. En potensiell urin biomarkør kandidat ble ekstrahert ved en topp rundt
m /z
2332,3 for diagnostisering av PCA pasienter.
Identifikasjon av peptidfragmenter ved m /z 2332,3
masse~~POS=TRUNC spektret~~POS=HEADCOMP av en urinprøve fra en pasient PCa ved MALDI-TOF-DIT /MS
2 analysen er vist i figur 4a. The Mascot MS
2 søkemotor av MS
2 massespekteret indikerte at
m /z
2332 peptid var en C-terminal fragment av Ptil. Dette resultatet antydet at PSA-fragmentet var sammensatt av de følgende 19 aminosyrerester: YTKVVHYRKWIKDTIVANP. Den MALDI-DIT-TOF /MS
2 massespektrummet det syntetiserte peptid (Medical Biological Laboratories Co., Ltd, Nagoya, Japan) falt sammen med at i urin
m /z
2332 peptid (figur 4b), noe som bekreftet at begge peptider som bestod av den samme aminosyre-sekvens: YTKVVHYRKWIKDTIVANP. Videre har aminosyre- sekvens, som ble bestemt ved Edman-nedbrytning, bekreftet at det var et C-terminalt fragment av PSA som besto av 19 aminosyrerester (data ikke vist). I denne studien har vi fokusert på urinprøver annullert etter prostata massasje, dvs. digital endetarms eksamen (DRE). Opprinnelsen til peptid på
m /z
2332 ble etterforsket, og massespektra ble sammenlignet med de uttrukne fraksjoner fra urinprøver før og etter DRE (figur 5). Toppen på
m /z
2332 ble utelukkende oppdaget etter DRE. Disse resultatene støtter 2331 Da peptidfragmenter blir utskilt fra prostata kjertler av DRE.
(a) aminosyresekvensen
m /z
2332 ble identifisert i urinprøver av PCA pasienter og antatt ved hjelp av MS
2 analysene og Mascot MS
2 søkemotor. De N-terminale aminosyresekvenser av peptidet ble bekreftet fullstendig basert på data oppnådd ved Edman-degradering av det rensede peptidet. Sekvensen ble bekreftet som følger: YTKVVHYRKWIKDTIVANP. (B) MS
2 spektrum sammenligninger av
m /z
2332 peptid mellom en syntetisert materiale (1) og ekstrahert biomateriale fra urinprøver av PCA pasienter (2). Den resulterende to MS
2 spektra av
m /z
2332 peptider matchet helt.
kvantitative analyser av en ny potensiell patognomonisk biomarkør ved hjelp av MALDI-DIT- TOF /MS
som tidligere vist, er toppintensiteten ved
m /z 2332,3
ble isolert fra S-plottet som en potensiell kandidat biomarkør for å skjelne mellom det ikke-kreft og PCA-grupper . Dermed ble urin 2331 Da peptid vurderes kvantitativt ved hjelp av 50 urinprøver annullert fra PCA pasienter (tabell 1) og 19 fra ikke-kreft fag (tabell 2) etter prostata massasje. En del av hver datasettet ble også benyttet i oppdagelsen trinnet.
alder og PSA-fordelinger av alle fag er vist i figur 6a og b. Ingen signifikante forskjeller ble observert i alder eller PSA fordelingen mellom det ikke-kreft (n = 19) og PCA (n = 50) grupper.
Alder (a) og serum PSA (b) fordelte non-cancer fag og PCA pasienter i validerings settene. Ingen signifikante forskjeller ble observert i alder eller serum PSA mellom ikke-kreft pasienter (n = 19) og PCA pasienter (n = 50). Deres
p
verdier var 0,364 og 0,076, respektivt.
Et representativt urinprøven analyseres med tillegg av den indre standard (ISTD) ble anvendt for å beregne forholdet mellom topparealene på
m /z
2332 for en ikke-merket syntetisk peptid og
m /z
2348 for en stabil isotop-merket syntetisk peptid (YTKVVHY [R-
13C
6, –
15N
4] KWIKDT [I-
13C
6, –
15N] VANP), henholdsvis. De tillegg Innholdet i ISTD (stabile isotop-merkede 2348 Da peptid beløp) ble løst i 20 pmol /1,0 ml urin. En standardkurve for ytterligere mengder av den 2331 Da peptidet er vist i figur 7a. En sterk korrelasjon ble observert mellom topparealforholdet mellom
m /z
2332 og 2349, og de ekstra 2331 Da peptid mengder, med en regresjonsligning av y = 0.0243x + 0,0722 (x-aksen: ekstra mengder den 2331 Da peptid; y-aksen, toppareal forholdet
m /z
2332 /
m /z
2349 [ISTD], R
2 = 0,996). En lineær standardkurve ble oppnådd
(a) Forholdet mellom topparealforholdet mellom
m /z
2332 og 2349 (stabil isotop-merket syntetisk peptid, intern standard [ISTD])., og ytterligere 2331 Da (ikke-merket syntetisk peptid) mengder. De ekstra Innholdet i ISTD ble fiksert i 20 pmol /1,0 ml urin. En standardkurve angående ytterligere mengder av den 2331 Da peptidet er vist. Tilstrekkelig korrelasjoner ble observert i kvantitative analyser av 2331 Da peptid ved hjelp av MALDI-DIT-TOF /MS. (B) En sammenligning mellom patologiske kategorier og urin 2331 Da peptid konsentrasjoner. Det ble observert en signifikant forskjell (
p = 0,0016
) mellom det ikke-kreft (n = 19) og PCa (n = 50) grupper. (C) ROC-kurver ble beregnet ut fra de kvantitative resultatene av de to (dvs. ikke-kreft og PCA) grupper. AUC av serum PSA nivå og urin 2331 Da peptid konsentrasjon var 0,639 og 0,747, henholdsvis. Angående serum PSA, cut-off-nivået på 3,82 ng /mL hadde en sensitivitet på 100% og spesifisitet på 36,9%. Når det gjelder urin 2331 Da peptid, cut-off nivå på 40,6 ng /ml hadde en sensitivitet på 86,0% og spesifisitet på 57,9%.
En signifikant forskjell ble observert i urin 2331 Da peptid-konsentrasjoner mellom den ikke-kreft og PCA grupper (figur 7b). Medianer av den 2331 Da peptid-konsentrasjonen i den ikke-kreft og PCA gruppene var 36,8 og 117 ng /ml, respektivt. Dette resultatet indikerte at det kan være mulig å skille PCA pasienter fra ikke-kreft fag.
ROC-kurver beregnet ut fra disse resultatene av to grupper er vist i figur 7c. Angående serum PSA, et område under kurven (AUC) var 0,639. Cut-off nivå på 3,82 ng /ml hadde en sensitivitet på 100% og spesifisitet på 36,9%. På den annen side, en AUC var 0,747 angående urin 2331 Da peptid. Cut-off nivå på 40,6 ng /ml hadde en sensitivitet på 86,0% og spesifisitet på 57,9%.
Det ble ikke observert samvariasjon mellom 2331 Da peptid konsentrasjon og serum PSA nivåer eller PCA stadier eller Gleason score til pasienter (data ikke vist)
Diskusjoner
diagnostisering av kreft er en stor utfordring for forskning og klinisk ledelse.; omfattende genomisk, transcriptomic, og proteomikk studier blir utført for å oppdage og identifisere biomarkører kandidater for bruk i high-throughput systemer i stand til stor befolkning screening [29].
