Abstract
Telenor (GLI1 /GLI2) transkripsjonsfaktorer har vært innblandet i utvikling og progresjon av prostatakreft selv om vår forståelse av hvordan de faktisk bidrar til biologien til disse vanlige svulstene er begrenset. Vi har observert at GLI rapportøraktivitet, var høyere i normal (PNT-2) og tumorigen (DU145 og PC-3) androgen-uavhengige celler sammenlignet med androgen-avhengig prostata LNCaP kreftceller og, følgelig, GLI mRNA-nivåer ble også forhøyet. Ektopisk uttrykk for GLI1 eller konstitutivt aktiv ΔNGLI2 mutant induserte en tydelig brostein lignende morfologi i LNCaP celler som, om det tidligere, korrelert med økt GLI2 samt uttrykk for basal /stammer lignende markører CD44, β1-integrin, ΔNp63 og BMI1, og redusert ekspresjon av luminal markør AR (androgen reseptor). LNCaP-GLI1 celler var levedyktige i nærvær av det AR-inhibitor bikalutamid og genekspresjon profilering viste at transkriptomet av LNCaP-GLI1 cellene var betydelig nærmere DU145 og PC-3-celler enn til å styre LNCaP-PBP (tom vektor) celler, så samt identifisere LCN2 /NGAL som et sterkt indusert transkript som er assosiert med hormon uavhengighet i bryst- og prostatakreft. Funksjonelt, LNCaP-GLI1 celler vises større klonal vekst og var mer omfattende enn kontrollcellene, men de gjorde ikke danne kolonier i soft agar eller prostaspheres i suspensjon som tyder på at de ikke har iboende stamcelleegenskaper. Videre målrettet undertrykkelse av GLI1 eller GLI2 med siRNA ikke reversere transformert fenotype av LNCaP-GLI1 celler heller ikke doble GLI1 /GLI2 knockdowns aktivere AR uttrykk i DU145 eller PC-3 celler. Som sådan, tidlig målretting av GLI oncoproteiner kan forhindre progresjon til en hormonuavhengig tilstand, men en mer detaljert forståelse av mekanismene som opprettholder denne fenotype er nødvendig for å bestemme om deres hemming vil forbedre effektiviteten av anti-hormonell terapi gjennom induksjon av en luminal fenotype og økt avhengighet av AR funksjon
Citation. Nadendla SK, Hazan A, Ward M, Harper LJ, Moutasim K, Bianchi LS, et al. (2011) GLI1 Konferere Profound Fenotypiske Endringer ved LNCaP prostata kreftceller som består av kjøp av et hormon selvstendige staten. PLoS ONE 6 (5): e20271. doi: 10,1371 /journal.pone.0020271
Redaktør: James McCubrey, East Carolina University, USA
mottatt: 08.02.2011; Godkjent: 18 april 2011; Publisert: 25. mai 2011
Copyright: © 2011 Nadendla et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble hovedsakelig (og sjenerøst) støttes av Middlesex University matchede finansieringsordning (SKN), Prostate Handling https://www.prostateaction.org.uk/(SKN og AH: Grant koder G2007 /55, G2008 /07 og G2009 /30 ) og Barts og The London Charity https://www.bartsandthelondoncharity.org.uk/(GWN). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft (PCA) er den vanligste kreftformen hos menn, og selv om svulster i utgangspunktet svarer godt til anti-hormonell behandling, det faktum at mange svulster utvikler resistens mot denne formen for terapi gir et stort hinder i behandling av avanserte former av sykdommen. Selv om de nøyaktige forhold som setter i gang PCa forblir uklare, har en rekke studier beskrevet genetiske lesjoner og avvikende signaliseringsmekanismer som kan bidra til tumordannelse og progresjon, og de som bidrar til konferere androgen uavhengighet er av spesiell interesse, da de kan representere nye mål for terapeutisk intervensjon ( anmeldt i [1]).
Som med mange kreftformer, har rollen som kreft stamceller (CSC) fått stor oppmerksomhet ved PCA biologi, særlig med hensyn til startfasen, men også progresjon og metastatisk spredning (anmeldt i [2]). Som prostatakreft vise en overveiende luminal fenotype inkludert AR uttrykk, de er antatt å stamme fra luminal sekretoriske celler. Men basert på CD profilering og cytokeratin uttrykk, har basal-lignende egenskaper er identifisert i primærsvulster og kan økes ved metastaserende og hormon ildfast svulster [3], [4]. Videre basal /stilk-liknende celler isolert fra både primære tumorer og kreftcellelinjer vil vise større tumourigenicity i mus xenograft eksperimenter [5], [6], [7], [8], [9], [10]. I motsetning til dette, Vander Griend et al [11] foreslått at kreft initiere Cellen kan være en mellomliggende AR-uttrykkende celle som «kjøper stilk-lignende aktivitet» og heterogeniteten av PCa blir ytterligere fremhevet ved studier av musemodeller: Wang et al [12] er beskrevet en sjelden luminal stamcellepopulasjonen (som uttrykker Nkx3-1) som kan gi opphav til svulster, mens Lawson et al [13] funnet at basale epitelceller stamceller ble transformert mer effektivt.
pinnsvin (HH) signale representerer en stor utviklingsmessig bane som er innblandet i dannelsen og utviklingen av mange tumortyper, inkludert de i huden, bryst, pankreas, hjerne og lunge. HH signalisering, først og fremst formidlet av nedstrøms GLI (henviser til både GLI1 og GLI2) transkripsjonsfaktorer, er knyttet til tumorgenesen gjennom regulering av forskjellige mekanismer som proliferasjon, differensiering, apoptose, migrasjon /invasjon og vedlikehold av CSC populasjoner (oversikt i [14], [15], [16]).
Nyere studier har beskrevet aktivering av HH signalisering i PCa selv om resultatene har ofte vært motstridende og mekanismen (e) ved hvilken GLI bidrar til neoplasi ikke er godt forstått (anmeldt i [17], [18]). For eksempel har flere studier orde som økte epithelial GLI1 ekspresjon fremmer tumordannelse [19], [20], [21]. I motsetning til dette, Fan et al [22] ikke observert noen signifikant forskjell i shh eller GLI1 mRNA-nivåer mellom tumor og sone avstemt godartet vev og, mer vesentlig, at GLI1 ble uttrykt i stromal, men ikke epitelial, komponent av BPH og PCa. Når det gjelder mer avansert sykdomstilstand, har høye nivåer av SHH protein og GLI1 mRNA blitt beskrevet i metastatisk prøver og DHH, GLI1 og GLI2 har blitt koblet med transformasjon til en hormon-ildfast tilstand [21], [23], [24], [25]. Dessuten har nylige studier etablert en forbindelse mellom HH /GLI og AR signalering i den androgen-avhengige (AD), luminal epitelial LNCaP prostatakreft-cellelinje og viste at GLI1 opprettholder cellenes levedyktighet i fravær av AR-aktivitet [25], [26 ], [27], [28].
Her viser vi at høy GLI aktivitet er observert i androgen-uavhengig (AI) DU145 og PC-tre epitelial prostatakreft cellelinjer og at ektopisk GLI1 fremmer androgen uavhengighet LNCaP-celler som korrelerer med deres transformasjon til en fenotype mer karakteristisk for DU145 og PC-3-celler. Men GLI undertrykkelse ikke fremme en AD fenotype i DU145 eller PC-3 celler. Som sådan, tidlig målretting av GLI oncoproteiner kan vanskeliggjøre progresjon til en hormonuavhengig tilstand, men denne metoden kan ikke øke effekten av anti-hormonell terapi hos tumorceller som har mistet AR uttrykk, og som ikke er avhengig av dets signalering for deres levedyktighet .
Resultater
Analyse av GLI uttrykk i prostatakreftceller
for å undersøke en antatt rolle for Telenor i prostata kreft, må vi først bestemmes nivået av GLI reporter aktivitet i ulike prostatacellelinjer. GLI reporter aktivitet var høyere i AI DU145 og PC-3 prostata cancer-cellelinjer sammenlignet med AD LNCaP prostatakreft-cellelinje og rapportøraktivitet, var også høyere i AI PNT-2 normal epitelial prostata cellelinje (Fig. 1A). Følgelig GLI1 og GLI2 mRNA-ekspresjon var høyere i alle AI cellelinjer sammenlignet med LNCaP-celler (Fig. 1B). Som sådan, analyserte vi effekten av over-uttrykker GLI1 og den aktive ΔNGLI2 mutanten på LNCaP cellebiologi. Den mest slående virkning av ektopisk GLI1 (eGLI1) og ΔNGLI2 relatert til cellemorfologi: i motsetning til den karakteristiske spindellignende morfologi av foreldre eller kontrollere LNCaP-PBP (tom vektor) celler, i løpet av få dager etter transduksjon celler /kolonier med en brostein lignende morfologi var tydelig i LNCaP cellene over uttrykker eGLI1 eller ΔNGLI2 (fig. 1C). Etter narkotika utvalg, hadde både LNCaP-GLI1 og LNCaP-ΔNGLI2 celler fullstendig forvandlet vedta en morfologi minner om PNT-2 eller DU145 cellene (se Fig. 5A for å se fullt forvandlet morfologi). Ektopisk GLI1 og ΔNGLI2 protein aktivitet ble bekreftet ved induksjon av PTCH1 mRNA (Fig. 1 D). I tillegg ble det endogene GLI2 mRNA induseres i LNCaP-celler, mens GLI1, uventet, endogene GLI1 mRNA ble undertrykket i LNCaP-celler ΔNGLI2 avslører at den morfologiske forandring kan være mediert ved GLI2 (fig. 1E). Som DU145 og PC-3 celler uttrykker høye nivåer av både GLI1 og GLI2 forhold til LNCaP celler (Fig. 1B), valgte vi å ytterligere undersøke biologi LNCaP-GLI1 celler.
(A) Analyse av GLI luciferase reporter aktivitet i forskjellige androgen-uavhengig cellelinjer og i forhold til androgen-avhengige LNCaP-cellelinjen. (B) Kvantitativ PCR analyse av GLI1 og GLI2 mRNA-nivåer i androgen-uavhengig cellelinjer og i forhold til LNCaP-celler (C) Brosteins-lignende celler /kolonier som oppstår i LNCaP-celler med ektopisk GLI1 eller ΔNGLI2 uttrykket (angitt med pilene). (D) qPCR analyse av PTCH1 mRNA uttrykk i LNCaP-GLI1 og LNCaP-ΔNGLI2 celler. (E) qPCR analyse av GLI2 mRNA uttrykk i LNCaP-GLI1 celler og GLI1 mRNA uttrykk i LNCaP-ΔNGLI2 celler. (F) Den morfologi LNCaP celler uttrykker EGFP endres ikke ved samtidig dyrket med LNCaP-GLI1 celler.
I utgangspunktet var GLI reporter aktivitet målt i LNCaP-GLI1 celler og vist å være på et nivå sammenlignbart med PC-3 og DU145-celler (fig. 1B, jf kolonnene 2-4). Deretter vi adressert om muligheten for eGLI1 å indusere brostein lignende morfologi i LNCaP cellene var gjennom selvstyrte midler, eller om dette er nødvendig parakrint /juxtacrine signaliserer gjennom molekyler utskilt av LNCaP-GLI1 celler eller ikke. Den morfologi LNCaP celler uttrykker EGFP endret seg ikke ved samtidig dyrket med LNCaP-GLI1 celler avslører at brostein lignende morfologi induseres autonomt (Fig. 1F). Vi kan imidlertid ikke utelukke at induksjon av brostein-lignende morfologi er formidlet gjennom reseptorer som er uttrykt i LNCaP-GLI1 celler (innledningsvis med en normal morfologi) og som deretter bindes til molekyler utskilles av den samme (eller en annen) LNCaP- GLI1 celler virker gjennom parakrint /juxtacrine signale
GLI1 overfører androgen-uavhengighet til LNCaP celler
uttrykk for epiteliale markører ble undersøkt for å finne ut om luminal fenotype av LNCaP celler ble endret av eGLI1.: AR ble sterkt undertrykt i LNCaP-GLI1 celler mens basal /stilk-lignende markører CD44, β1-integrin, ΔNp63, og BMI1 ble alle økt (figur 2A.); Dette ble bekreftet ved Western blot-analyse av AR og CD44, med økt celleoverflate-ekspresjon av den sistnevnte bekreftet ved FACS (fig. 2B og C). På grunn av uniformen globale skift i CD44 uttrykk vi valgte å ansette heterogen befolkning for videre studier. Når det gjelder androgen avhengighet, mens eksponering for AR-inhibitoren bikalutamid potent trykkes spredning av LNCaP-celler PBP, den økte proliferativ potensialet i LNCaP-celler GLI1 var upåvirket, og dette ble bekreftet ved flowcytometri (fig. 2D, kolonnene 1-4 og E ). Derfor, som bestemt ved epithelial markør ekspresjon og ufølsomhet for bikalutamid, tyder disse data på at eGLI1 induserer regresjon (eller de-differensiering) av LNCaP-celler til en basal /stilk lignende form som er naturligvis uavhengig av AR signalisering for levedyktighet.
(A) qPCR analyse av epithelial markør uttrykk i LNCaP-GLI1 celler i forhold til LNCaP-PBP celler (nb dataene blir presentert som naturlige logaritmer så den relative induksjon av CD44 er nesten 7000 ganger). (B) Western blot analyse av AR og CD44 uttrykk i LNCaP-PBP, LNCaP-GLI1 og DU145-celler (pilene betegne CD44 isoformer felles for LNCaP-GLI1 og DU145 cellene). (C) FACS-analyse av CD44-ekspresjon i LNCaP-PBP og LNCaP-celler GLI1. (D) proliferasjonsanalyse for å sammenligne og å bestemme effekten av bikalutamid på formeringshastigheten av LNCaP-PBP og LNCaP-GLI1-celler, så vel som effekten av AG1478 (EGFR-inhibitor) og U0126 (MEK-inhibitor) på sistnevnte. (E) Analyse av cellesyklus ved flowcytometri i LNCaP-PBP og LNCaP-GLI1 celler eksponert for bikalutamid.
For å undersøke dette videre, LNCaP-PBP, LNCaP-GLI1, DU145 og PC- 3 celler ble analysert ved DNA-mikromatriser: global matrise profilering viste at transkriptomet av LNCaP-GLI1 celler var mer lik DU145 og PC-3-celler enn til LNCaP-PBP-celler og dermed avsløre hvorvidt LNCaP-GLI1 celler har endret fenotype ( fig. 3A). I direkte sammenligning til LNCaP-PBP celler, uttrykket av 260 transkripsjoner avvek mer enn 10 ganger (144 opp og 116 ned) i LNCaP-GLI1 celler (Fig. 3B og figurene S1 og S2). Funksjonell klassifisering av disse transkripsjoner produsert 15 ontologiske grupper, inkludert de som er forbundet med tumorbiologi eksempel celle-celle adhesjon, cellemotilitet, EMT (epitelial-mesenchymale overgang) og hormon uavhengighet (figur S3); den sistnevnte gruppen inkludert LCN2 (lipokalin 2) og CAV2 (caveolin 2) som tidligere ble identifisert som en del av en felles signatur for hormon uavhengighet i bryst og prostata kreft [29]. De fleste av de 144 økte transkripsjoner ble uttrykt på samme nivå i LNCaP-GLI1 celler når sammenlignet med DU145 og /eller PC-3-celler ( 3-gangers forskjell), mens ekspresjonen av 12 transkriptene (inkludert LCN2) var 3-ganger høyere i LNCaP-celler GLI i forhold til begge celletyper (fig S1 og tabell 1). Gjensidig, av 116 redusert transkripter bare en, MRPL23, ble uttrykt . Tre ganger lavere i LNCaP-celler GLI1 i forhold til både DU145 og PC-3-celler (fig S2)
(A) En statistisk sammenligning av globale genuttrykk profiler for å finne ut hvor stor prosentandel av vitnemål som er uttrykt på betydelig forskjellige nivåer i LNCaP-PBP, DU145 og PC-3 celler i forhold til LNCaP-GLI1 (Pearson korrelasjon koeffisient ≥0.7, p 0,05) (B ) Heat kartet betegner transkripsjoner i LNCaP-GLI1 celler der endringen i uttrykket er både 10 ganger og svært signifikant forskjellig i forhold til LNCaP-PBP celler (studentens
t
-test, p 0,01): venstre panel lister økt gener, høyre panel lister redusert gener og DU145 og PC-3 celler er vist for sammenligning (* betyr transkripsjon varianter av samme gen). (C) Western blot-analyse å sammenligne ekspresjon av enkelte signaliseringsproteiner mellom LNCaP-PBP og LNCaP-celler med GLI1 DU145 og PC-3-lysater er inkludert for sammenligning. (D) Fosforylering av cytoskeletal protein MLC2 formidles av ROCK i LNCaP-GLI1 celler (nb antistoffet for total MLC ikke fungerte i våre hender).
I tillegg til DNA microarray profilering, omfanget av store signalveien aktivering ble vurdert ved Western blotting i LNCaP-celler GLI1. Hormon uavhengighet er forbundet med EGFR sti aktivering og selv om det er fastslått at EGFR mRNA uttrykk ikke er betydelig økt i AI cellelinjer ([29] og våre microarray data), en sterk økning i EGFR protein uttrykk ble observert i LNCaP-GLI1 celler til et nivå sammenlignbart med DU145 og PC-3-celler (fig. 3C). ERK (Ekstracellulær signal-regulert Kinase) aktivitet ble også øket i LNCaP-GLI1 celler (fig. 3C) og farmakologisk inhibering av EGFR eller ERK trykkes deres høye proliferative potensial (fig. 2D, jfr kolonnene 1, 3, 5 og 6) . Når det gjelder AKT, selv om økt aktivitet er forbundet med mutasjonsinaktivering av PTEN i LNCaP-celler [30], [31], [32], eGLI1 reduserte den til et nivå sammenlignbart med DU145-celler tyder på at det finnes mekanisme (r) som kan utnyttes å unngå tap av dette viktige tumorsuppressorgen (fig. 3C). Når det gjelder cytoskjelettet, viste LNCaP-celler GLI1 en økning av MLC2 (myosin lettkjede-2) fosforylering som var lik både DU145 og PC-3-celler (fig. 3C og data ikke vist). MLC2 regulerer aktin cytoskjelettet (blant annet stress fiberdannelse) og er selv regulert av MLCK (myosin lett kjede kinase) og ROCK (Rho-assosiert kinase); eksponering for ROCK hemmer Y27632 men ikke MLCK inhibitor ML-7 redusert MLC2 fosforylering selv om dette ikke reversere brostein lignende morfologi av LNCaP-GLI1 celler (Fig. 3D og upubliserte observasjoner). Oppsummert disse dataene ytterligere demonstrere i hvilken grad LNCaP-GLI1 celler ligne DU145 og PC-3 celler.
LNCaP-GLI1 cellene ikke vise forankringsuavhengig vekst
HH /GLI signale regulerer normal og kreft stamcellepopulasjoner og nyere studier har beskrevet hvordan EMT er en iboende egenskap av slike celler [15], [16], [33]. Interessant, til tross for deres brostein-lignende morfologi, resultatene av microarray viste at eGLI1 induserer EMT i LNCaP-celler (Figur S3). Faktisk, redusert E-cadherin og øket vimentin ekspresjon ble bekreftet ved Western-blotting, selv om dette ikke var avhengig av EGFR eller MEK-ERK-signalering [34] (fig. 4A). Følgelig LNCaP-celler ble GLI1 meget inngripende gjennom en Matrigel ™ substrat (fig. 4B), og de viste også større klonal vekst når de ble sådd ut ved lav tetthet (fig. 4C). Men til tross for ekspresjon av «stemness» markører (inkludert CD44, β1-integrin og BMI1), EMT og større klonal vekst (fig. 2A, 4A og 4C), i motsetning til kontrollcellene LNCaP-GLI1-celler ble ikke dannet prostaspheres i suspensjon eller kolonier i myk agar (fig. 4D). For å undersøke muligheten for at LNCaP-GLI1 cellene ikke prolifererer i 3-D kultur fordi de ikke er i stand til å differensiere til en luminal fenotype (dvs. på grunn av konstitutiv ekspresjon eGLI1), DU145-celler ble også dyrket under de samme betingelser. Det er ingen kolonier ble observert i noen av analysen med DU145 celler antyder at AR
– celler er dårlig klonogene i forankrings-uavhengig
in vitro
kultursystemer (data ikke vist); dette er støttet av Thiyagarajan et al [35] som observert at DU145 (og PC-3-celler) var mye mindre proliferativ i myk agar i forhold til LNCaP-celler, selv om noen kolonivekst var tydelig i deres studie.
(A ) Western blot-analyse å sammenligne ekspresjon av det EMT markører E-cadherin og vimentin mellom LNCaP-GLI1 og LNCaP-PBP-celler (nb reduksjon av E-cadherin i LNCaP-GLI1 celler blir delvis tilbakeført i nærvær av EGFR inhibitor AG1478 og til en mindre grad MEK-inhibitor U0126). (B) Transwell invasjon analyse som sammenligner invasiv potensialet i LNCaP-PBP og LNCaP-celler GLI1 gjennom en Matrigel substrat. (C) Clonogenicity assay vurdering av kolonidannende evne av LNCaP-PBP og LNCaP-celler GLI1 når sådd ut ved lav tetthet. (D) Anchorage uavhengig vekst er observert i LNCaP-PBP celler, men ikke LNCaP-GLI1 celler (øverste panel – soft agar koloni analysen, bunnpanel – prostasphere assay).
GLI undertrykkelse ikke fremme en luminal-like fenotype i androgen-uavhengig prostatakreftceller
til slutt har vi ønsket å finne ut om målrettet undertrykkelse av GLI var tilstrekkelig til å reversere transformert fenotype av LNCaP-GLI1 celler eller å indusere en luminal-like fenotype DU145 eller PC-3 celler. Transfeksjon av LNCaP-celler med GLI1 GLI1 eller GLI2 siRNA ikke påvirke morfologi av LNCaP-celler GLI1 heller ikke var det noen forandring i ekspresjonen av ΔNp63 eller AR mRNA (figurene 5A-C og fig S4A.); Dette indikerer at den fenotypiske omdannelsen indusert ved eGLI1 i LNCaP-celler er irreversibel og at vedlikehold av AI fenotype ikke er avhengig av GLI2. Når det gjelder DU145 og PC-3-celler, ble effekten av doble GLI1 /GLI2 knock-out bekreftet ved en reduksjon av GLI rapportøraktivitet, men det var ingen forandring i cellemorfologi og heller ikke var det noen forandring i ekspresjonen av ΔNp63 eller AR mRNA (fig. 5D -F, Figur S4B og upubliserte observasjoner). Vi har også ansatt GLI inhibitor GANT61 (30 mm) [36], men dette var mindre effektiv i å undertrykke GLI reporter aktivitet enn RNAi (data ikke vist). Som sådan, selv om AI prostatakreftceller vise høy GLI mRNA uttrykk og aktivitet og eGLI1 er i stand til å fremme en AI fenotype i LNCaP celler, GLI undertrykkelse ikke fremme en luminal-like og AD fenotype i AI prostatakreftceller.
(A) Den transform morfologi av LNCaP-celler GLI1 ikke omvendt ved transfeksjon med GLI1 eller GLI2 siRNA. (B) qPCR analyse av GLI1 og GLI2 mRNA i LNCaP-GLI1 celler transfektert med GLI1 eller GLI2 siRNA. (C) RT-PCR-analyse av ΔNp63 og AR mRNA i LNCaP-celler transfektert med GLI1 GLI1 eller GLI2 siRNA. (D) qPCR analyse av GLI1 og GLI2 mRNA i DU145 og PC-3 celler transfektert med GLI1 og GLI2 siRNA. (E) GLI rapportøraktivitet, undertrykkes i DU145 og PC-3-celler transfektert med GLI1 og GLI2 siRNA (N.B. rapportøraktivitet kan bli påvirket av GLI3 ekspresjon i PC-3-celler [17]). (F) RT-PCR analyse av ΔNp63 og AR mRNA i DU145 og PC-3 celler transfektert med GLI1 og GLI2 siRNA.
Diskusjoner
Rollen HH signal har vist omstridte ved PCA biologi; dette inkluderer debatt om hvorvidt eller ikke veien bidrar til primærtumordannelse samt selve modusen for signalering (autokrint eller parakrint). I tillegg har det vært motstridende data med hensyn til hvorvidt eller ikke gli uttrykk er mediert gjennom kanoniske eller ikke-anerkjente baner i PCA-cellelinjer (gjennomgått i [18]). Vi har ikke adressert natur GLI regulering, men har vist at AI cellelinjer PNT-2, DU145 og PC-tre visnings høyere nivåer av GLI mRNA enn AD LNCaP prostatakreft cellelinje og dette korrelerer med økt GLI reporter aktivitet (Fiken . 1A og B). Det faktum at GLI1 uttrykk var sammenlignbar mellom normal PNT-2 celler og tumorigen DU145 og PC-3 celler var uventet, men i motsetning til Karhadkar et al [21], fant vi også at GLI1 mRNA ble sterkt uttrykt i kommersielle primære prostata basal epitelceller (PrECs), selv om en trofast sammenligning med de cellelinjene som ble brukt i denne studien var ikke mulig fordi PrECs dyrkes i spesialist medium som ikke inneholder serum (SKN og GWN, upublisert). Til tross for disse observasjonene på proteinnivået GLI1 er sjelden detektert i basale lag av normalt humant prostatavev, mens uttrykket er mer utbredt i hyperplastiske basalceller og karsinomer [20]. Som sådan, på en måte beslektet med GLI2 regulering [37], selv om GLI1 mRNA-ekspresjon er konstant mellom normale og tumorigene celler, kan proteinet bli stabilisert i sistnevnte forbindelse (eventuelt gjennom Fused [38]), og dette, sammen med GLI2, kunne ta hensyn til økningen i GLI rapportøraktivitet.
Våre data antyder at GLI1 induserer androgen-uavhengighet i LNCaP-celler gjennom sin evne til å indusere en basal-lignende fenotype som er forbundet med basalcellepopulasjoner, og det er naturligvis uavhengig av AR aktivitet; Dette støttes av redusert AR uttrykk kombinert med en økning av mange basale /stilk-lignende markører. Chen et al [26] også beskrevet en rolle for GLI1 fremme AI vekst i LNCaP celler, men dette var ikke assosiert med redusert AR uttrykk og kan gjenspeile det faktum at eGLI1 uttrykk var lavere i deres system som bestemmes av en mindre fold-økning på GLI1 reporter aktivitet. Selv om våre studier ble utført på en heterogen cellepopulasjon, fenotype var jevn, og vi har ikke vært i stand til å isolere LNCaP-GLI1 klonale linjer som opprettholder normal LNCaP morfologi indikerer at retroviral eGLI1 fremmer en «alt eller ingenting» respons, men som nivået av GLI reporter aktivitet var sammenlignbar med DU145 og PC-3 celler indikerer dette at systemet vårt har biologisk relevans. Hvor eGLI1 medierer omdannelsen av LNCaP-celler er ikke klarlagt, men kan innebære flere mekanismer: eGLI1 hemming av AR signalering alene er lite sannsynlig å initiere den fenotypiske endring, men kombinert med dets evne til å opprettholde cellelevedyktighet i fravær av AR-signalering [27] , [28], kan dette sammensatte virkninger av dens viktigste rolle som en transkripsjonen aktivator.
som nevnt ovenfor, øker eGLI1 total GLI aktivitet i LNCaP-celler til et nivå sammenlignbart med DU145 og PC-3-celler.
