Abstract
Bakgrunn
Problemet med prostatakreft progresjon til androgen uavhengighet har blitt grundig studert. Flere studier systematisk analysert genekspresjonsprofiler i forbindelse med biologiske nettverk og trasé, avdekke nye aspekter av prostatakreft. Til tross for betydelige forskningsinnsats, er mekanismene bak tumorprogresjon dårlig forstått. Vi søkte en ny tilnærming for å rekonstruere hele systemet molekylære hendelser etter stimulering av LNCaP prostata kreft celler med syntetisk androgen og å identifisere potensielle mekanismer for androgen-uavhengig utviklingen av prostatakreft.
metodikk /hovedfunnene
Vi har utført samtidige målinger av genekspresjon og proteinnivåer etter behandling ved hjelp av mikromatriser og iTRAQ proteomikk. Sett med up-regulerte gener og proteiner ble analysert ved hjelp av vårt nye konsept for «topologisk betydning». Denne fremgangsmåte kombinerer high-throughput molekylære data med det globale nettverket av protein interaksjoner for å identifisere noder som opptar betydelig nettverks posisjoner med hensyn til differensielt uttrykte gener eller proteiner. Vår analyse identifiserte nettverket av vekstfaktor regulering av cellesyklus som den viktigste reaksjon modul for androgen behandling i LNCaP-celler. Vi viser at majoriteten av signalerings noder i nettverket oppta betydelige posisjoner med hensyn til den observerte genekspresjon og proteomic profiler fremkalt av androgen stimulus. Våre resultater tyder på at ytterligere vekstfaktor signale representerer sannsynligvis en «andre fase» respons, ikke er direkte avhengig av den opprinnelige androgen stimulus.
Konklusjoner /Betydningen
Vi konkluderer med at det i prostatakreftceller av proliferative signaler er sannsynlig å bli overført fra flere vekstfaktorreseptorer av et mangfold av signalveier konvergerende på flere viktige regulatorer av celleproliferasjon så som c-Myc, syklin D og CREB1. Dessuten er disse reaksjonsveier ikke isolert, men utgjør et sammenkoplet nettverk-modul inneholdende mange alternative ruter fra innganger til utganger. Hvis hele nettverket er involvert, kan en presist formulert kombinasjonsbehandling være nødvendig for å bekjempe svulstvekst effektivt
Citation. Vellaichamy A, Dezső Z, JeBailey L, Chinnaiyan AM, Sreekumar A, Nesvizhskii AI, et al . (2010) «Topological Betydning» analyse av genuttrykk og proteomikk profiler fra prostata kreft celler avslører Viktige mekanismer Androgen Response. PLoS ONE 5 (6): e10936. doi: 10,1371 /journal.pone.0010936
Redaktør: Patrick Tan, Duke-NUS Graduate Medical School, Singapore
mottatt: 13 november 2009; Godkjent: 06.05.2010; Publisert: 03.06.2010
Copyright: © 2010 Vellaichamy et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av Michigan proteomikk Alliance for kreftforskning ved National Institutes of Health (NIH) tilskudd CA134175-01, gi R01CA126239 og ved GeneGo, Inc. de bevilgende myndighet hadde noen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Andrej Bugrim, Zoltan Dezső og Lellean JeBailey er ansatte i GeneGo, Inc., som delvis har finansiert studien. Forfatterne bekrefte at dette faktisk ikke endrer sin tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Prostatakreft er en av de mest diagnostisert kreft og andre ledende årsaken til kreft-relaterte dødsfall i Nord-amerikanske menn [1]. Mens androgen tilbaketrekking terapi er ofte effektive innledningsvis, de fleste tilfeller videre til mye mer aggressiv androgen-uavhengig fenotype. Til tross for betydelige forskningsinnsats, er mekanismene bak tumorprogresjon dårlig forstått. Roller for flere signalveier er etablert, men ikke en systemisk bilde. For eksempel har IGF-signalisering vært implisert i progresjonen fra androgen-avhengige til androgen-uavhengig tilstander [2], men også er blitt vist å undertrykke AR trans-aktivering via FoxO1 og således ha hemmende virkning på vekst av prostata kreftceller [ ,,,0],3], ble EGF rapportert å etterligne virkningene av androgen på genekspresjon og uavhengig stimulere vekst av androgen-avhengig prostata kreftceller [4]. Andre studier har produsert bevis for samspill mellom androgen signalisering og TGF-beta [5], [6], FGF [7], [8] og VEGF [9].
Det meste av forskningen sitert ovenfor har vært hypotesedrevet heller enn data-drevet. Hypotese formulering er utsatt for skjevhet på grunn søkernes preferanser og aktuelle forsknings trender om hva som oppfattes som «interessant». En utfyllende data-drevet tilnærming ved hjelp av høy gjennomstrømming molekylær profilering og avanserte dataanalyse algoritmer kan øke forståelsen av de mange cellulære prosessene som ligger bak utviklingen av prostatakreft til androgen-uavhengig scenen og kunne bane vei for nye behandlingsformer og for å oppnå større effekt fra bedre rettet bruk av eksisterende terapier.
Genome-wide uttrykk profilering haven blitt mye brukt til komplekse sykdommer, inkludert prostatakreft [4], [10], [11], [12], [13], [14]. Flere nyere studier også systematisk analysert genekspresjonsprofiler i forbindelse med biologiske nettverk og trasé, avdekke nye aspekter av prostatakreft [15], [16], [17]. Til tross for denne utviklingen, virkelig systemisk analyse som ville ta hensyn til både genekspresjon og proteomikk data fra den samme prøven er fortsatt en unnvikende mål. En kritisk utfordring er å utføre robust integrert analyse av datasett produsert av så forskjellige molekylære plattformer. Dette er en vanskelig informatikk problem fordi microarray og proteomikk data kan ikke, i de fleste tilfeller være direkte i forhold til hverandre. For eksempel har studier i gjær vist at korrelasjonen mellom nivåer av mRNA og tilsvarende proteiner ble utilstrekkelige for å gi pålitelige anslag protein nivåer fra genuttrykk data [18]. En fersk studie av prostatakreft prøvene viste samsvar mellom proteomikk og genomiske data som strekker seg fra 46% til 68% basert på «fraværende /nåværende» samtaler; imidlertid korrelasjoner var lav når de faktiske nivåer av ekspresjon ble sammenlignet [19]. Som vist i et siste arbeid [20], fører mye mer omfattende kvantitativ karakterisering protein til betydelig forbedring i korrelasjon mellom nivåene av protein og genekspresjon. Likevel, det er flere iboende kilder til disharmoni, inkludert mRNA degradering, alternativ spleising, translasjonsforskning regulering, posttranslasjonelle modifikasjoner og protein degradering [21]. Disse kan ikke overvinnes ved teknologiske forbedringer alene og må tas opp av nye analytiske tilnærminger til dataintegrasjon. Tidligere innsats på dette området utnyttes forhåndsdefinerte sett av gener (trasé, Gene Ontologi kategorier) for å se etter samsvar mellom proteomikk og genomiske data på dette nivået [22], [23].
Nylig har vi utviklet et ny beregningsmetodikk som kan bidra til å fremme integrert analyse av flere typer data ett skritt nærmere [24]. Vår tilnærming kombinerer sykdoms eller tilstand spesifikke, high-throughput molekylære data med det globale nettverket av protein interaksjoner å identifisere noder som opptar betydelige nettverks posisjoner med hensyn til forskjellig uttrykt gener eller proteiner i de presenterte molekylære datasett. Selv når det er betydelig støy og disharmoni i selve dataene, spådommer om algoritmen er sannsynlig å samles på et felles sett av signale proteiner i de banene som er ansvarlige for endringer i uttrykket av målet gener og proteiner. Ofte aktiviteten av slike signaleringsproteiner er modifisert ved subtile post-translasjonelle modifikasjoner, binding til andre budbringere, eller rekrutteringen til en bestemt sub-cellulær sted. Disse hendelsene er ikke eksplisitt til uttrykk i tilsvarende molekylære profiler; Dermed forblir de «skjult» fra standard molekylære analyser. Vår metodikk er i stand til å finne mange slike «skjulte» proteiner ved å identifisere sett med deres sannsynlige nedstrøms mål og vurdere berikelse av slike sett av differensielt uttrykte gener eller proteiner. Vi kaller denne prosedyren «topologisk scoring» (se «Metoder» for mer detaljer).
I vårt tidligere arbeid denne metoden ble testet på et sett av microarray gene expression data fra psoriasispasienter hvor det var i stand til å korrekt identifisere mange viktige regulatoriske proteiner hvis forhold til sykdommen er bekreftet av uavhengige studier [24]. I foreliggende studie har vi benyttet det topologiske scoring metode for å undersøke responsen av LNCaP prostatakreftceller for behandling med syntetisk androgen (R1881), som et godt studert modellsystem for prostatakreft progresjon. Vi fant en datadrevet måte, uten å ha noen forutfattet hypotese angående cellulære prosesser som aktiveres av androgen i disse cellene. Vi har samlet og analysert både genekspresjon og proteomikk data for å kryss-validere forutsigelser basert på ulike typer data og vurdere nytten av denne tilnærmingen til integrerende dataanalyse.
Resultater
Gener og proteiner som er berørt av androgen behandling identifisert av microarray og protein massespektrometri
for å kunne avhøre rolle androgen i prostatakreft, androgen-responsive prostatakreft cellelinje LNCaP ble behandlet med syntetisk androgen R1881 (se » metoder «seksjonen for detaljer). LNCaP-celler ble behandlet med androgen viste økt celleproliferasjon, mens kontrollcellene sluttet å vokse i androgen fattig medium. Ved hjelp av statistisk analyse av genekspresjon data vi har identifisert 347 og 257 gener som var opp- og ned-regulert, henholdsvis i behandlede versus ubehandlede celler (FDR≤1%) (Tabell S1). De oppregulert gener inkludert kjente androgen-induserte gener som Kallikrein 3 (
KLK3
, aka
PSA
), FK506 bindende protein 5 (FKBP5), N-myc nedstrøms regulert 1 (NDRG1 ) og fettsyre syntase (FASN). Ved hjelp av iTRAQ 2DLC-MS /MS-baserte proteomikk profilering av androgen-behandlede sammenlignet med ubehandlede LNCaP-celler, har vi identifisert 70 og 39 proteiner som ble forhøyet eller ned-regulert, henholdsvis i behandlede celler sammenlignet med ubehandlede celler (Tabell S1) ( detaljer om massespektrometri og statistiske analyser er beskrevet i [25]). Androgen-regulerte protein datasett inkludert genprodukter for de kjente up-regulerte gener som er nevnt ovenfor, så vel som flere andre proteiner som tidligere er kjent og ukjente for å bli regulert av androgen. Sett av opp-regulerte gener og proteiner har 13 felles medlemmer som er ~17% av det mindre sett. For nedregulert gener og proteiner nivået over samsvars er ~8%.
topologisk betydelige noder i det globale signalnettverk
For å undersøke mulige signalmekanismer som aktiverer genet og protein uttrykk etter androgen stimulering, har vi brukt vår nylig utviklet teknikken med topologisk betydning analyse [24]. Vi sendte inn lister over oppregulert gener og proteiner til den elektroniske versjonen av vår topologisk scoring verktøyet (https://topology.genego.com/zcgi/topology_scoring.cgi) for å identifisere viktige regulatoriske proteiner som aktivitet i behandlede celler makt har stått for endringer i gen- og proteinnivåer. Genekspresjon og proteomikk data ble sendt til bedømmelse separat, noe som resulterer i to sett av topologisk betydelige regulatoriske proteiner. Hver node i det globale nettverket av protein interaksjoner ble tildelt topologiske score (topologiske p-verdier) i forhold til hvert sett av molekylære data. For å kontrollere den falske funnraten (FDR) signifikansnivået filter ble brukt. Bruke FDR≤5% vi identifisert 962 topologisk betydelige proteiner fra genuttrykk data og 577 topologisk betydelige proteiner fra proteomikk data (Tabell S2). Interessant, to sett av topologisk betydelige proteiner inneholder 301 felles elementer (eller 52% av den mindre sett) .Dette resultat står i sterk kontrast med bare 17% overlapping mellom lister over oppregulert gener og oppregulert proteiner.
Vekst faktor signale nettverk er sterkt innblandet i androgen respons
for funksjonsanalyse, både sett av topologisk betydelige proteiner ble lastet inn i MetaCore ™ programvarepakke (GeneGo, Inc.) der vi beregnet berikelse i ontologi av funksjonelle prosesser som er definert av «GeneGo prosessnettverk». Vi brukte alle proteiner i (innstillingen «default») MetaCore nettverk som referanseliste for beregning berikelse p-verdier. Som forventet, er det topp-scoring prosess «androgen reseptor kjernesignale» (Figur 1a). Overraskende har imidlertid denne prosessen er høyt anriket bare på proteiner som topologisk score er avledet fra genekspresjon profil; 82 av 126 noder i denne prosessen nettverket anses vesentlig med hensyn til å over-uttrykte gener. I motsetning til dette, er det bare 19 noder anses signifikant med hensyn til opp-regulerte proteiner fra den iTRAQ datasett. Den neste høyanriket prosess nettverk er «vekstfaktor regulering av cellesyklus». I motsetning til androgen signalisering, er dette nettverket sterkt anriket på proteiner som er topologisk betydning for både genekspresjon og proteomic data. Av 186 noder i dette nettverket, er 95 svært scoret med hensyn til over uttrykte gener, mens 63 er sterkt scoret med hensyn til iTRAQ-identifiserte proteiner oppregulert etter androgen behandling. Til sammen er 49 noder bekreftet som topologisk betydelig fra begge settene med molekylære data. Lukk undersøkelse av denne prosess viser at topologisk vesentlige proteiner er til stede på alle nivåer av signalering hierarkiet, inkludert flere vekstfaktorer (EGF, FGF, VEGF-A), reseptorer (IGFR, EGFR, ActRIIB, VEGFR-2), signale kinaser (AKT , gsk3, PI3K, JNK, ERK1 /2, PKC), transkripsjonsfaktorer (c-myc, IRF1, Tcf (Lef), SMAD3, SMAD4, STAT1, STAT3) og, til slutt, cyclin kinaser (Cyclin D, Cyclin E) som direkte regulerer cellesyklusen (figur 2). Viktigere var topologisk betydning for mange av disse proteiner bekreftet for begge datasettene. Til sammenligning har vi også gjort sti anrikning analyse av de opprinnelige sett av opp-regulerte gener og proteiner. Interessant, er de fleste av identifiserte pathway kart for både genekspresjon og proteomikk sett relatert til metabolske prosesser, de fleste av dem til fettsyremetabolisme (tabell S3). I tillegg er flere signalveier avslørt av denne analysen, særlig vekstfaktor signalering via MAPK og PIK3, regulering av lipid metabolisme og en sti kart relatert til cellesyklusen. Imidlertid har ingen av de signalveier er meget høyt rangert og generell betydning for anrikning er lav sammenlignet med resultatene erholdt for proteiner som er identifisert av topologisk forsøket. Anrikning av GeneGo nettverk med opp-regulerte proteiner avslører Androgen aliserte nettverk, men det er også på bunnen av listen (p = 0,007). Med unntak av insulinsignale det synes å være noen sammenheng mellom nettverkene anriket på oppregulert gener og opp-regulerte proteiner. Totalt ser det ut til at funksjonsanalyse av forskjellig uttrykt gener og proteiner har en tendens til å identifisere sentrale mål trasé, slik som metabolisme, mens anaylysis av topologisk betydelige proteiner avslører nøkkelen signale behandlet aktivert i androgen-stimulerte celler.
(A) anriking av GeneGo prosess nettverk ved topologisk betydelige proteiner identifisert ved hjelp av alle oppregulert gener og proteiner. (B) Anrikning av GeneGo prosessnett ved topologisk vesentlige proteinene identifisert ved å bruke avkortede sett av data (med unntak av gener og proteiner direkte regulert av androgen-reseptor). Orange barer-berikelse av betydelige proteiner identifisert ved hjelp av proteomikk datasett. Blå barer-berikelse av betydelige proteiner identifisert ved hjelp av genuttrykk data.
Røde prikker angir proteiner identifisert som topologisk betydelig ved hjelp av genuttrykk profil. Blå prikker indikerer proteiner identifisert som topologisk betydelig ved hjelp av proteomikk-profil. Røde bokser-proteiner identifisert som topologisk betydelig fra begge datasettene.
For å undersøke om signifikante forskjeller i størrelser av settene som benyttes i vår analyse kan ha påvirket resultatene vi samplet tilfeldig trekning av gener og proteiner og lagt dem til forskjellig uttrykt sett. Dette trinn ble etterfulgt av anrikning analyse av de utvidede settene. Imidlertid viser resultatene at ingen nye kart eller nettverk blir betydning for større apparater og dessuten betydningen av tidligere identifiserte over og nettverk stadig synker som mer tilfeldige gener tilsettes. (Se tabell S4).
opptegning androgen-avhengige og androgen-uavhengig aktivitet
Resultatene er presentert ovenfor tyder på at et flertall av proteiner i signaleringsnett som forbinder flere vekstfaktorer til regulering av cellesyklus kan bli aktive etter androgen stimulering. Den resulterende aktivering av celleproliferasjon kan bli en viktig medvirkende mekanisme for overgangen til androgen uavhengighet i prostatakreft. For ytterligere å bekrefte dette formodning vi må undersøke hvorvidt dette resultatet avhenger direkte aktiviteten til androgen reseptor. Dermed vår neste skritt var å avgrense signaliserer effekter som er uavhengige av direkte aktivering av androgen reseptoren.
Først brukte vi MetaCore ™ for å identifisere hvilke av de over-uttrykte gener og oppregulert proteiner er direkte mål for transkripsjonsregulering av androgen reseptoren. For å oppnå dette bygget vi «nærmeste naboer» nettverk rundt androgen reseptoren med samspillet filter i MetaCore satt til å tillate bare «transkripsjonsregulering» typen koblinger. Lister over up-regulerte gener og proteiner ble kartlagt på den resulterende nettverket. Ved hjelp av dette nettverket vi videre valgt noder som både er: «nedstrøms» av androgen reseptor og har eksperimentelle data knyttet til dem. Vi fant 45 direkte mål av androgen reseptor blant over-uttrykte gener og 9 mål blant settet av oppregulert proteiner. Disse molekylene ble ekskludert fra de opprinnelige listene og avkortede sett ble gjen analysert med den topologiske betydning verktøyet med påfølgende funksjonsanalyse av topologisk scoret noder i MetaCore ™. Vi identifiserte 565 signifikante proteiner på basis av iTRAQ data og 668 signifikante proteiner på basis av genekspresjon datasett (med FDR mindre enn 5%, tabell S5). En observasjon umiddelbart merkbar fra undersøkelse av anrikningen diagrammet er fravær av androgen signaleringsnett (figur 1b). Dette fravær bekrefter at mange proteiner i androgen veien mottatte høye topologiske score på styrken av over-ekspresjon av et stort antall direkte mål for androgen reseptor. Når disse målene er eliminert fra vurdering, score for proteiner i androgen-regulert vei sunket under signifikansnivå. I motsetning til dette, høy anrikning for nettverket av vekstfaktor regulering av cellesyklusen forble praktisk talt intakt. Mens antall noder i dette nettverket scoret på grunnlag av mikroarray data redusert 95-78, antall noder scoret basert på iTRAQ data økte fra 63 til 71. Overlappingen mellom de to sett av store proteiner også øket til 54 (eller 76% av det mindre sett). Dette funnet støtter forslaget om at aktiviteten av denne veien er uavhengig av direkte androgen action og kan representere viktige mekanismer for bryteren til androgen-uavhengig spredning i prostatakreft.
Topp rangerte regulatoriske proteiner og deres veier
Neste vi undersøkte de topprangerte molekyler i sett av topologisk scoret proteiner. Vårt mål var å bestemme spesifikke transkripsjonsfaktorer som driver genuttrykk respons etter androgen behandling og identifisere regulatoriske kaskader som aktiverer dem. Det er flere transkripsjonsfaktorer som kan regulere ekspresjon av et betydelig antall av «mål» blant over-uttrykte gener eller opp-regulerte proteiner eller begge deler (tabell 1). For eksempel c-myc har 25 mål blant 70 oppregulert proteiner identifisert av iTRAQ og 63 mål blant 347 over-uttrykte gener identifisert ved microarray analyse. c-myc er rangert som nr 1 i topologiske score basert på iTRAQ data og # 11 i scoring basert på genuttrykk (fortsatt i toppen 2%). Andre transkripsjonsfaktorer som fikk høye topologiske score med hensyn til begge datasett er SREBP1 og YY1, som er viktige regulatorer av enzymer involvert i lipid- og fettsyrer metabolisme. I kontrast, CREB1 og ATF-4 er topp-scoring transkripsjons regulatorer med hensyn til microarray data, men de får ikke noen poeng basert på iTRAQ data. Grunnen for en slik uoverensstemmelse er mangel på betydelig antall CREB1 og ATF-4 målene mellom opp-regulert proteinene identifisert ved masse-spektrometri (tabell 1). Dette kan tyde på aktivitet av enkelte posttranskripsjonelt prosesser blokkerer syntesen eller induserer nedbrytning av disse proteinene på tidspunktet for prøvetaking. Mens transkripsjonsfaktorer ofte får høy topologisk scoring på grunn av betydelig antall av sine direkte mål i de eksperimentelle datasett, er oppstrøms signalmolekyler scoret basert på anriking av sett med sine «avsidesliggende mål» -genes og proteiner noen skritt nedstrøms på signale trasé.
Undersøkelse av enkelte signalkaskader som fører til de beste transkripsjons regulatorer avslører at PI3K signalering støttes av gjennomgående høy topologiske score avledet fra både proteomikk og microarray datasett. Figur 3 viser denne kaskade i sammenheng med IGF signalering. Den PI3K kaskade er markert med rød linje, mens alle dens elementer som oppnår høye topologiske score med hensyn til begge settene er merket med røde bokser. En slik konsekvent scoring antyder den sentrale rollen av denne veien i å regulere hendelser som følge androgen behandling. Mest sannsynlig, dens rolle i dette systemet er inhibering av GSK3p-kinase og dens evne til å fosforylere c-Myc og cyklin D (fig. 3). Normalt slik fosforylering kan målrette disse molekyler for proteolyse, og dermed begrense celleproliferasjon. I denne situasjonen synes imidlertid c-myc å bli vedvarende aktivert dømme etter det høye antallet av sine direkte mål til stede i begge settene. En sannsynlig årsak til den vedvarende aktivitet av PI3K signalering er homozygot mutasjon av PTEN i LNCaP-celler som fører til mangel på dets ekspresjon i dette system [26]. Denne effekten kan forsterkes ved en kombinasjon av høyt nivå av Kallikrein 3, over-ekspresjon av IGF-reseptor, og under-ekspresjon av IGF-bindende proteiner (uavhengige aktører). Kallikrein 3 (også kjent som PSA) er sterkt oppregulert i prostatakreft og er gjennomgående over-uttrykkes på både mRNA og proteinnivåene i våre eksperimentelle data. Det ble tidligere vist at PSA har proteolytiske potensial med hensyn på IGF-bindende proteiner [27], [28]. Videre ble det foreslått at dette kan være en mekanisme ved hvilken biotilgjengeligheten av IGF økes, noe som bidrar til vekst av prostata kreftceller [29], [30].
Red nivå i «termometre» representerer relativ rang (persentil) av et protein i tilsvarende liste over topologisk betydelige proteiner. Tallet identifiserer datasettet som signifikans ble beregnet: 1-iTRAQ, 2-Affymetrix. Røde bokser og uthevet banen illustrerer signalkaskade med sterkest støtte fra begge settene.
I vår analyse har vi fått flere andre stykker av bevis som støtter denne hypotesen. Først IGF-bindende proteiner fikk høye topologiske score basert på både microarray og iTRAQ data. Dette resultatet bekrefter at de er svært relevant for observerte endringer i gen- og proteinuttrykk følgende androgen behandling av LNCaP celler. For det andre, ved å androgen behandling vi funnet at ekspresjonsnivåene av i det minste en av de IGF-bindende proteiner (IBP3) og av IGF-reseptor forskyvning i motsatte retninger. IBP3 er 30% under uttrykt i behandlede celler, mens IGF-reseptoren er 46% over-uttrykt. Nedregulering av IBP3 på det genomiske nivå i tillegg til proteolytisk aktivitet av PSA vil bidra til lavere konsentrasjon av IBP3 protein og økt tilgjengelighet av IGF. Den resulterende høyere nivå av IGF er avstemt med over-uttrykk for sin reseptor, som fører til høy aktivitet av nedstrøms trasé.
Diskusjoner
Vekst faktor nettverk som hoved respons modulen til androgen stimulering i LNCaP cellene
topologiske analyse identifiserte nettverket av vekstfaktor regulering av cellesyklus som den viktigste reaksjon modul for androgen behandling i LNCaP-celler. Som beskrevet i innledningen, har forskjellige aspekter av vekstfaktor signale blitt grundig undersøkt i sammenheng med prostatakreft bryteren til androgen-uavhengig modus. Våre resultater støtter disse tidligere observasjoner fra en komplementær systemer-nivå, data-drevet perspektiv. I stedet for å fokusere på aktivitet av individuelle proteiner, viser vi at et flertall av signalerings knutepunkter i nettet forbinder flere vekstfaktorer til viktige regulatorer av cellesyklus oppta betydelige posisjoner med hensyn til den observerte genekspresjon og proteomic profiler fremkalt av androgen stimulus. Dette nettverket inneholder flere vanlige «veier» som sender signaler fra vekstfaktor-reseptorer. Disse inkluderer signalering via MAP kinaser, PI3K veien og signalering via SMADs og krysstale mellom disse systemene. Dermed er det rimelig å konkludere med at i prostatakreftceller proliferative signalene overføres fra vekstfaktor-reseptorer av en rekke signalveier konvergerende på flere viktige regulatorer av celleproliferasjon som c-myc, Cyclin D og CREB1. Dessuten er disse reaksjonsveier ikke isolert, men utgjør et sammenkoplet nettverk-modul inneholdende mange alternative ruter fra innganger til utganger.
Våre resultater tyder på at ytterligere vekstfaktor signale representerer sannsynligvis en «andre fase» celle respons på androgen stimulus. Når alle direkte mål for androgenreseptoren er fjernet fra betraktning, er de fleste proteiner i vekstfaktor-nettverket fremdeles høyt mottok i forhold til de øvrige sett av over-uttrykte gener og proteiner. Denne responsen kan være mediert av kombinerte effekter av høye nivåer av PSA og vekstfaktorreseptorer og lave nivåer av vekstfaktor-inhibitorer, så som IGF-bindende proteiner (uavhengige aktører) (Fig. 3). Proteolytisk virkning av PSA kan ytterligere bidra til senking av aktørene kan nivåer. På samme tid, kan PSA-ekspresjon opprettholdes uavhengig av androgen reseptoren ved CREB1 og noen andre transkripsjonsfaktorer [31]. Når disse faktorene blir aktivert via vekstfaktor-signalveier, oppstår det en positiv tilbakekoplingssløyfe som kan opprettholde høye nivåer av PSA og celleproliferasjon, selv i fravær av aktivt androgen reseptor. Vi har registrert at CREB1 er rangert som nr 1 i topologiske scoring av genuttrykk data, noe som tyder på at det er svært aktiv i dette systemet.
Selv om videre eksperimentelt arbeid, slik som siRNA studier er nødvendig for å bekrefte disse slutninger, hvis viste seg riktig kan de føre oss til å revurdere vår tilnærming til å finne målrettet terapi for prostatakreft. Biologiske nettverk er robust i en forstand at det finnes mange alternative måter å overføre en molekyl signal fra et punkt til et annet. Gitt høye mutasjons forekomst av gener i kreftceller, er det sannsynlig at selv om vi blokkere en viss kaskade med en målrettet medikament, vil det være minst en sub-populasjon av celler i en tumor som kan omgå en slik blokk ved hjelp av en alternativ signale rute. Hvis hele nettverket er involvert, vil en nøyaktig formulert kombinasjonsterapi være nødvendig for å bekjempe tumorvekst effektivt. Dessuten kan slike kombinasjonsterapier må være spesifikke for en liten undergruppe av pasienter eller til og med enkeltpasienter gitt pasientspesifikke egenskaper onkogene nettverk.
Dynamisk natur cellulære responser og integrasjon av data som genereres av ulike teknologier
i denne studien ble samtidige målinger av genekspresjon og proteinnivåer etter behandlingen med syntetiske androgen utført, og hundrevis av gener og flere titalls proteiner som har nivåer øket som følge av stimulus ble identifisert. Men det er bare beskjeden overlapping (omtrent 17%) observert mellom settene av oppregulert gener og proteiner. Selv om utgangspunktet dette høres overraskende, bør dette resultatet kan forventes. Cellene er komplekse dynamiske systemer i hvilke prosesser oppstår på flere tidsskalaer. Når vi analysere en biologisk prøve tar vi en statisk øyeblikksbilde av denne dynamiske oppførsel. For eksempel kan nivåene av mRNA kan øke etter 20-60 min etter behandlingen, men proteinsyntesen kan bli ytterligere forsinket, og statistisk signifikant forandring i proteinkonsentrasjoner vil ta mye lengre tid å utvikle og har mindre forhold. Etter den tid proteiner syntetiseres noen mRNA kan bli redusert, uten å etterlate spor av gen over-uttrykk. Dermed når studere microarray eller proteomikk data, har vi å gjøre med fragmenterte spor av aktivitet som er igjen av forbigående dynamiske prosesser på ulike nivåer av mobilnettet maskineri. Selv i forsøkene hvor prøvene er analysert på flere ulike tidspunkter vi fortsatt ser på en liten samling av individuelle øyeblikksbilder i stedet for hele bildet av mobilnettet dynamikk.
Her brukte vi begrepet topologiske betydning å rekonstruere oppstrøms trasé som kan ha resultert i disse spor av dynamisk aktivitet som vi oppdaget som observer molekylære profiler. Resultatene tyder på at denne fremgangsmåten var vellykket i å forutsi viktige regulatoriske proteiner og veier så som androgen signalering, vekstfaktor signalering og regulering av cellesyklusen som medierer responser i LNCaP-celler til behandling med syntetisk androgen (R1881). Viktigst, har vi oppdaget at graden av overlapping mellom sett av regulatoriske proteiner forutsies fra genekspresjon og proteomic data er mye høyere enn overlappingen mellom den eksperimentelle setter seg (52% vs. 17%). Videre, for vekstfaktor regulering av cellesyklusen som synes å være en viktig prosess i dette system, når det overlapp 76%.
