Abstract
Pediatric glioblastomas (pGBM), selv om sjeldne, er en av de viktigste årsakene til kreft dødsfall hos barn, med svulster i hovedsak ildfaste til eksisterende behandlinger. Her beskriver vi bruk av konvensjonell og avansert
in vivo
magnetic resonance imaging (MRI) teknikker for å vurdere en roman orthotopic xenograft pGBM mus (IC-3752GBM pasient-avledet kultur) modell, og for å overvåke effekten av antikreftmiddel OKN-007 som en inhibitor av pGBM tumorvekst. Immunhistokjemi støtte data blir også presentert for celleproliferasjon og tumorvekst signalering. OKN-007 ble funnet å betydelig redusere tumorvolum (
p
0,05) og øke dyr overlevelse (
p
0,05) i alle OKN-007-behandlede mus sammenlignet med ubehandlede dyr . I en forståelses kohort av behandlede dyr, OKN-007 var i stand til å betydelig redusere tumorvolum (p 0,0001), øker overlevelse (p 0,001), og øke diffusjon (
p
0,01) og perfusjon priser (
p
0,05). OKN-007 også signifikant reduserte tumor lipid metabolisme i responderende dyr [(Lip1.3 og Lip0.9) -to-kreatin-forhold (
p
0,05)], så vel som en signifikant reduksjon tumorcelleproliferasjon (
p
0,05) og microvessel tetthet (
p
0,05). Videre i forhold til PDGFRα vei, OKN-007 var i stand til å betydelig redusere SULF2 (
p
0,05) og PDGFR-
α plakater (platelet-derived growth factor receptor
-α
) (
p
0,05) immunoexpression, og betydelig øke decorin uttrykk (
p
0,05) i responsive mus. Denne studien indikerer at OKN-007 kan være et effektivt middel mot kreft for noen pasienter med pGBMs ved inhibering av celleproliferasjon og angiogenese, eventuelt via den PDGFR
α
vei, og kan anses som en tilleggsbehandling for pediatrisk hjernesvulst pasienter
Citation:. Coutinho de Souza P, Mallory S, Smith N, Saunders D, Li XN, McNall-Knapp RY, et al. (2015) Hemming av Pediatric Glioblastoma tumorvekst av Anti-Cancer Agent OKN-007 i ortotopiske Muse xenografter. PLoS ONE 10 (8): e0134276. doi: 10,1371 /journal.pone.0134276
Redaktør: Marta M. Alonso, Universitetssykehuset i Navarra, SPANIA
mottatt: 6 mars 2015; Godkjent: 08.07.2015; Publisert: 6. august 2015
Copyright: © 2015 Coutinho de Souza et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (P20 GM103639, KMF) https://nih.gov/, Oklahoma State University (AE-1-50060, PCS) http : //go.okstate.edu/, Musella Foundation (No. nummer, RAT) https://www.virtualtrials.com/musella.cfm, og barndommen hjernesvulst Foundation (nr nummer, RAT) http: //www .childhoodbraintumor.org /
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
introduksjon til
Høy klasse hjernesvulst (HGG) representerer en av de mest vanlige. sentralnervesystemet (CNS) svulster blant voksne. Dette står i kontrast betydelig til den pediatriske populasjonen hvor HGGs utgjør bare ca 8-12% av alle primære CNS svulster [1]. Disse svulstene er klassifisert av Verdens helseorganisasjon (WHO) som enten klasse III eller IV som betyr at de er svært ondartede svulster med karakteristiske funksjoner som hypercellularitet, kjernekraft atypi, og høy mitotisk aktivitet med eller uten mikrovaskulær spredning og nekrose [2]. De vanligste pediatriske HGGs inkluderer anaplastisk astrocytom (WHO grad III) og glioblastom (GBM, WHO grad IV). Pediatric glioblastom (pGBM) er en av de viktigste årsakene til kreft dødsfall hos barn [3] med en median total overlevelse for pasienter i 11 måneder [4]. Til tross for forbedringer i nevrokirurgi, strålebehandling og kjemoterapi, utfallet for barn med pediatrisk HGG forblir fattige [5]. Ingen effektive kjemoterapiregimer er identifisert for alle pediatriske HGG ennå [5]. Videre har nye molekylært målrettede midler vist liten effekt i tidlig fase kliniske studier [6-8], fremhever behovet for nye behandlingsmetoder.
Tilsvarende forbedring av
in vitro Hotell og
in vivo
modeller for pediatriske HGGs er også nødvendig. Tumorcellelinjer og dyremodeller hentet fra CNS svulster er viktige verktøy for å studere biologi av sykdommen, for å forstå mekanismene for resistens mot behandlingen, og å gjennomføre preklinisk terapeutisk testing. Det er rikelig informasjon om dyremodeller av voksen HGG [9-11], herunder kjemisk indusert, genmanipulerte mus, og xenograft modeller [9]. Imidlertid er etablert og /eller preget hittil bare noen få barn GBM modeller [12-14]
Vi har vist at anti-cancer agent OKN-007 (Oklahoma nitron-007,. Dinatrium 4- [(tert-butyl-imino) metyl] benzen-1,3-disulfonat N-oksid eller disufenton) er svært effektiv mot voksen hjernesvulst i prekliniske modeller [11,15,16], og det er for tiden under klinisk utprøving vurdering som ny eksperimentell medisin for tilbakevendende voksen glioblastomas. OKN-007 er et lite molekyl som kan krysse blod-hjernebarrieren og har anti-inflammatorisk, antioksidant, og proapoptotiske egenskaper [17,18]. I en orthotopic rotte F98 glioma modell og en menneskelig U87 xenograft modell i atymiske rotter, OKN-007 betydelig økt overlevelse av behandlede versus ubehandlede rotter [16]. Tumorvolumer i begge disse modellene ble betydelig redusert i behandlet i forhold til ubehandlede dyr basert på magnetisk resonans imaging (MRI) vurdering [16]. Immunhistokjemi (IHC) vurdering av vanlig undersøkte tumormarkører for celleproliferasjon eller differensiering, hypoksi, angiogenese, og apoptose indikerte at OKN-007 var i stand til å betydelig redusere celleproliferasjon (glukosetransportør 1 (Glut-1) og den markør celleproliferasjon, MIB -1) men ikke celledifferensiering (karbonat anhydrase IX), redusere angiogenese (microvessel tetthet (MVD; målt som nivåer av endotelial markør, CD-31), men ikke den vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF)), redusere hypoksi (hypoksi induserbare faktor 1 α (HIF-1α)), og øke apoptose (spaltet kaspase 3) sammenlignet med ubehandlede kontroller [16]. OKN-007-indusert reduksjon i Glut-1 og HIF-1α nivåer så ut til å være lik i begge F98 og U87 glioma-modeller, mens økt apoptose syntes å være mer forhøyet i F98 gliomer forhold til U87-tumorer [16]. Vi konkluderte med at OKN-007 har evne til å forårsake regresjon gliom i aggressive gnager tumormodeller (F98 og U87), så vel som i moderate gliomer (C6) [11,15,16]. Støtte til anti-kreft effekt av OKN-007 via TGFβ1 veien ble nylig rapportert av Zheng
et al
. (2013), hvor de fant ut at OKN-007 formidler sin antitumor effekt i HCC celler (Huh7) via undertrykkelse av TGFβ1 /SMAD2 og Hedgehog /GLI1 signalering ved å hemme sulfatase 2 (SULF2) enzymatisk aktivitet [19].
PDGFR
α
er den hyppigste målet for focal forsterkning i pediatriske HGGs [20-23]. Somatiske mutasjoner av PDGFR
α
har også nylig rapportert hos pediatriske HGGs [22-24]. Det er også kjent at den SULF2 genekspresjon er korrelert med PDGFR
α
uttrykk [25]. I likhet med SULF2 er decorin også knyttet til den PDGFRα sti [26]. Siden det ble tidligere vist at OKN-007 kan påvirke SULF2 aktivitet, tenkte vi at kanskje dette agent kan være effektiv mot barn HGGs.
MR har vært brukt i preklinisk [12] og klinisk [27-32] studier å diagnostisere og forutsi behandlingsresultater for barn GBMS. Teknikkene mest brukte inkluderer
in vivo
1 H magnetisk resonans spektroskopi (
1 H-MRS) [33-35], diffusjon vektet imaging (DWI) [36], og arteriell spin merking perfusjon (ASL) [37].
1H-MRS har vært brukt i forsknings- og kliniske miljøer for å måle metabolitt-nivåer i hjernen, og er godt egnet til å utføre diagnosen, karakterisering og evaluering av tumor respons på behandling [38]. DWI kan kvalitativt og kvantitativt vurdere molekylær bevegelse på grunnlag av organiseringen av vev mikrostrukturer ved å karakterisere vann mobilitet [39], og kan gi en mer fullstendig vurdering av mobilnettet og metabolske informasjon om menneskelige hjerne kreft [40]. ASL tillater vurdering av måle svulst blodstrøm [41], som bistår i karakterisering av tumor grad [37] og respons på kreftbehandling [42].
Her beskriver vi MR karakterisering av en roman orthotopic xenograft pediatrisk HGG mus (IC-3752GBM pasient-avledet primær kultur) modell og effekten av OKN-007 til å hemme
in vivo
pediatrisk glioblastom IC-3752GBM tumorvekst ved hjelp av konvensjonelle (morfologisk imaging) og avanserte MR-teknikker (
1 H-MRS, DWI, og ASL). Immunhistokjemisk farging ble også brukt til å evaluere nivået av tumor-relaterte proteiner, og for å vurdere tumorcelle-proliferasjon. Så langt vi kjenner til, er denne studien den første rapporten om MR karakterisering av en orthotopic xenograft murine modell av pGBM, og vurderingen av anti-kreft agent, OKN-007, i en pGBM modell.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Alle forsøkene i den aktuelle studien ble utført etter en menneskelig protokoll godkjent av Institutional Review Board (IRB) ved Baylor College of Medicine samt et dyr protokoll godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) fra Baylor College of Medicine og IACUC av Oklahoma Medical Research Foundation. For menneskelige vevsprøver, ble signert informert samtykke innhentes fra alle pasienter eller deres foresatte før prøve oppkjøpet.
hjernesvulst prøve
Et nytt kreftprøve (3752GBM), fra et 5-årig -gamle kvinne som gjennomgikk kraniotomi ved Texas Children Hospital, ble innhentet i en kryostat laboratorium med signert samtykke etter en Institutional Review Board godkjent protokollen (H-4844). Endelig patologisk diagnose var i samsvar med pediatrisk glioblastom (pGBM) [43]. Svulsten Prøven ble direkte implantert i høyre cerebral cortex av immunedeficient mus (Baylor College of Medicine IACUC # AN-4548). Xenograft tumor celler høstet fra giver mus ble passert i nakne mus via seks påfølgende implantasjoner som vi tidligere beskrevet [43,44].
Intrakraniell mus hjernesvulst modell
passaged pediatrisk glioblastom kultur IC- 3752GBM ble implantert intracerebralt i atymiske hårløse mus (n = 24) (OMRF IACUC protokoller # 13-51 og # 13-53). Lederne for bedøvede mus ble immobilisert (stereotaxic enhet; Kopf Instruments, Tujunga, CA), og med aseptiske teknikker, ble en 1 mm Burr hull boret i mm fremre skalle 1 og 2 mm lateralt for bregma på venstre eller høyre side . En 20 ul gasstett Hamilton sprøyte ble benyttet for å injisere 5-10 x 10
6 IC-3752GBM celler /ml suspendert i 4 mL i cellekulturmedium med 1,0% agarose i den høyre eller venstre Frontallapp på en dybde av 1,5 mm i forhold til den durale overflate i et stereotaksisk enhet. Analgesi (Buprenex, intraperitoneal injeksjon) ble brukt etter cellen implantasjon prosedyre for smertelindring under utvinning. Cellelinjene ble opprettholdt og utvidet umiddelbart før inokulering. Etter injeksjon, ble huden lukket med kirurgiske suturer. Dyrene ble delt inn i to grupper: OKN-007-behandlede (n = 12) og ubehandlet (n = 12) grupper. Begge gruppene ble stratifisert for å sikre at tumorstørrelsene var like før behandlingen startet i den behandlede gruppe. IC-3752GBM primærkultur ble ikke passert mer enn seks ganger i mus.
OKN-007 behandling
OKN-007 (Ryss Laboratories, Union City, CA) ble administrert til mus i deres drikkevann i en konsentrasjon på 150 mg /kg /døgn (0,20% vekt /volum for en 20 g mus). Behandlingen startet når tumorvolumene var mellom 10 og 15 mm
3, og ble tilført kontinuerlig til slutten av studien. Mus som mottok vanlig drikkevann ble anvendt som ubehandlede kontroller. Mengden av OKN-007 konsumert av hver mus, som ble oppbevart i separate bur, ble bestemt ved veiing vannflasker hver dag. Ingen signifikant avvik ble observert i det væskevolum opptak av forbindelsen i disse musene. Den gjennomsnittlige inntak av OKN-007 var omtrent 130-150 mg /kg /dag for alle mus. For hele studien, ble den terapeutiske responsen på OKN-007 vurderes som enten responsive (OKN-007-R) eller ikke-responsive (OKN-007-NR). Dødelighet ble registrert daglig løpet av studieperioden for å beregne den prosentvise overlevelse av alle dyr. Alle dyrene ble humant avlivet (CO
2 kvelning) da de møttes tumorbyrde kriterier (svulster ≥ 150 mm
3) og /eller viste tegn til sykdom, vekttap, dårlig kondisjon, porfyri, hypoaktivitet, rastløshet, aggressivitet, ataksi, grunne, rask og /eller anstrengt pust, kakeksi, unnlatelse av å svare på stimuli, mangel på nysgjerrighet, stemmebruk, beslag, krum holdning og ruffled pels). Dyrene ble overvåket to ganger daglig.
Magnetisk resonans teknikker
Morfologisk bildebehandling.
Nude mus ble bedøvet og plassert i et stereo vugge. En 30-cm horisontal boring Bruker Biospin magnet opererer på 7 Tesla (T; Bruker BioSpin GmbH, Karlsruhe, Tyskland), ble brukt sammen med en S116 gradient satt til å utføre alle MR eksperimenter. En EPI (ekko planar imaging) transceiver
1 H 50W spole med en 38,0 mm indre diameter ble brukt for signaloverføring og gjenkjenning. Multiple-slice, multiple ekko (MSME) bildebehandling (FOV = 2,50 x 2,50 cm
2, TR = 2000 ms, TE = 17,5 eller 58,2 ms, matrix = 192, gjennomsnitt = 2, skiver = 16, skive tykkelse = 1 mm) ble brukt til å beregne tumorvolumer og til å kontrollere tumor morfologi. Multi skive spin ekko T
1-vektede bilder (TR = 1000,0 ms, TE = 14 ms, FOV = 2,50 × 2,50 cm
2, gjennomsnitt = 2, skiver = 16, matrise size = 256 × 256) var også utføres og ervervet før og 15 minutter etter intravenøs kontrastmiddel injeksjon (Gd-DTPA, Magnevist, Bayer Inc., Wayne, New York, USA; 0,4 mmol /kg).
1 H-MR spektroskopi.
1 H-MRS ble kjøpt ved hjelp av en PRESS (Point løst spektroskopi) sekvens med en TE på 24,0 ms, en TR fra 2500,0 ms, 512 gjennomsnitt, og en spektral bredde på 4006 Hz. En ikke-undertrykte MR spektrum ble kjøpt på forhånd ved å bruke induksjons korreksjon for å maksimere signalintensitet og redusere rushlinjebredder. Vann ble undertrykt med en damp (variabel strøm radiofrekvens pulser og optimaliserte avslapping forsinkelser) undertrykkelse ordningen. I alle tilfeller, toppbredden (full bredde ved halvt maksimum) av vanntopp var mindre enn 30 Hz følgende lokaliserte mellomlegg, som ble gjennomført ved hjelp av første og andre ordens justeringer med Fastmap. En kubisk volumelement av 2,0 x 2,0 x 2,0 mm
3 ble plassert i enten svulsten eller den kontralaterale normalt hjernevev, samtidig maksimere mengden av tumorvev tilstede i volumelementet til enhver tid.
For å analysere Mrs data, en in-house Mathematica programmet ble brukt (versjon 6.0, Wolfram Research, Champaign, IL, USA). Spektrene ble redusert i ppm ved å kalibrere mot vanntopp (4,78 ppm). De store hjernen metabolske toppene ble identifisert som: N-acetylaspartate (NAA) på 2,02 ppm, kolin (Cho) på 3,22 ppm, kreatin (Cre) på 3,02 ppm, og mobil lipider på 1,3 ppm (Lip1.3) for metylengruppen (-CH
2-) og 0,9 ppm (Lip0.9) for metylgruppen (-CH
3) i tumorvevet. Målingene av metabolittene peak området ble brukt til å beregne følgende forhold: svulst NAA til tumor Cho (NAA
t /Cho
t), tumor Cho til kontralaterale (normalt vev) Cre (Cho
t /Cre
n), tumor Cho til tumor NAA (Cho
t /NAA
t), tumor Lip0.9 til kontralaterale Cre (Lip0.9
t /Cre
n), og svulst Lip1.3 til kontralaterale Cre (Lip1.3
t /Cre
n).
Diffusion-Weighted Imaging.
En koronale aksial multi-slice DWI sekvens dekker hele tumoren ble utført ved anvendelse av en ekko plane bildebasert pulssekvens med følgende parametre: TR = 4000 ms, TE = 51,1 ms, matrisestørrelse = 128 x 128, snittykkelse = 1 mm, diffusjon gradient varighet = 4 ms, diffusjon gradient separasjon = 14 ms. Fem bilder ble oppnådd med forskjellig gradient glødeskall, noe som resulterer i b-verdier på 100, 200, 500, 700, og 850 s /mm
-2. ADC kartene ble generert for alle skivene, hvor tumoren ble observert. Den tilsynelatende diffusjonskoeffisienten (ADC) verdier ble oppnådd ved å tegne en eneste frihånd ROI langs grensen av svulsten normalisert til kontralaterale normal hjerne.
arteriell spin-merking perfusjon.
perfusjon kartene var oppnås på en enkel aksial stykke av hjernen som ligger på et punkt av rostro-kaudale aksen hvor svulsten hadde det største tverrsnitt. Den bildegeometri var en 25,6 × 25,6 mm
2 felt-of-view (FOV) på 2 mm i tykkelse, med et enkelt skudd ekko-planar koding over en 64 × 64 matrise. Et ekko tid (TE) på 13,5 ms, en repetisjon tid (TR) på 18 s, og en inversjon tid (TIR) på 26,0 ms ble brukt, og bildene ble ikke sendt til annen gjennomsnittsberegning. For å oppnå perfusjon motsetning til dette ble strømmen alternerende inversjon utvinning ordningen brukes. Kort fortalt ble inversjon utvinning bilder ervervet ved hjelp av en skive-selektiv inversjon av samme geometri som bilde skive eller et ikke-selektivt inversjon skive konsentrisk med bildebehandling skive med en skive pakke margin på 5,0 mm. For hver type inversjon, ble 22 bilder kjøpt med inversjon ganger jevnt fordelt fra 26,0 ms til 8,426.0 ms (med en økning på 400 ms mellom hver TIR). CBV (cerebral blodstrøm) verdier ble oppnådd ved å tegne en eneste frihånd ROI langs grensen av svulsten normalisert til kontralaterale normal hjerne for å få normalisert i forhold CBF (rCBF) verdier. Negativ ASL CBF verdier ble antatt å være null [45].
Gross og mikroskopisk histologi
obduksjon ble utført på alle mus. Omfanget av tumoren ved obduksjon ble evaluert ved makroskopisk eller mikroskopisk undersøkelse av hjernen for hvert dyr fra de ubehandlede og OKN-007-behandlede grupper. Hjernevev ble fiksert i 10% fosfat bufret formalin, innstøpt i parafin, serielt seksjonert i 4 mikrometer, og ble farget med hematoxylin eosin (H E). For histologisk undersøkelse
Immunohistochemistry
Immunhistokjemisk fargingen ble utført ved å bruke en automatisert immunostainer (Leica, Bond-III, Leica, Buffalo Grove, IL) med følgende primære polyklonale antistoffer: blodplate-avledet vekstfaktor-reseptor alfa (PDGFR
α
) (1: 1000 fortynning , kanin polyklonale, klone ab61219, Abcam), decorin (1: 500 fortynning, kanin polyklonale, klone LS-B-8177/45156), LSBIO levetid biovitenskap), heparansulfat sulfatase SULF2 (1: 100 fortynning, kanin polyklonale, klone AV49338, Sigma Aldrich), og CD31 (1:25 fortynning, kanin polyklonale, klone ab28364, Abcam, Ki-67 (1: 100 fortynning, kanin polyklonale, klone PA5-19462, Thermo Fisher Scientific, IL). Alle antistoffer ble opprinnelig optimalisert på kontroll vev, og positive og negative kontroller ble behandlet parallelt med vevssnitt.
IHC Scoring
Alle IHCs ble analysert ved hjelp av Aperio ScanScope Image Analysis System (Aperio, Vista, CA). PDGFR
α
, SULF2, og decorin IHCs ble analysert ved hjelp av en positiv Pixel Count algoritme med Aperio ImageScope betrakteren. Bare områder som inneholder svulstvev ble analysert for IHC uttrykk. Områder uten svulstvev og områder med nekrose eller betydelige gjenstander (f.eks vevsfolding) ble valgt bort, og ekskludert fra analysen. Antallet positive bildeelementer fra regioner Interesse (ROIs) med høy ekspresjon ble dividert med det totale antall piksler (negative og positive) i det analyserte området, og multiplisert med 100, for å utlede prosentandelen av positive bildeelementer.
microvessel tetthet (MVD, antall skip pr mm
2) og Mean Vessel (MVA, Vaskulær området /2 + lumen området), ved hjelp av CD31 som en markør, ble bestemt ved hjelp av en Aperio microvessel analyse algoritme. Tre representative ikke-overlappende områder av interesse (Rois) for tumorprøver ble tilfeldig valgt, og MVD og MVA ble kvantifisert for hvert dyr fra både ubehandlede og OKN-007-behandlede grupper.
En Aperio ScanScope bildeanalyse systemet ble også brukt til å bestemme KI-67-merkeindeksen (Ki-67 LI). Tre ROIs med høyest antall merkede kjerner ble identifisert i hvert enkelt tilfelle. Ki-67 LI ble bestemt ved telling 1000 celler og uttrykke dette som antall merkede celler per 1000 celler [46] for hvert dyr fra både ubehandlede og OKN-007-behandlede grupper. Merkede celler ved siden av eller innenfor nekrotiske områder ble også ekskludert mens telling av Ki-67 LI. Midlene og standardavvik av Ki-67 LI ble bestemt for hver gruppe.
Statistical Analysis
statistiske analysene ble utført ved hjelp av grafen Pad Prism 6 (GraphPad Prism 6 Software, San Diego, CA, USA). Alle
p
verdier 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Tumorvolumer, metabolitt peak lengde forholdstall [(NAA
t /Cho
t), (Cho
t /Cre
n), (Cho
t /NAA
t), (Lip0.9
t /Cre
n), og (Lip1.3
t /Cre
n)], normalisert ADC, rCBF, Ki-67 LI, og immunoexpression av PDGFR
α
, ble SULF2, og decorin rapportert som betyr ± standardavvik. For statistisk analyse, ble Student t-test (uavhengige prøver, tosidige t-test) som brukes for å vurdere forskjellene mellom hjelp av de normale, ubehandlede, og OKN-007 behandlede barn IC-3752GBM glioma mus. Kaplan-Meier overlevelseskurver og en Log-rank (mantel-cox) test ble brukt for å sammenligne overlevelse ganger blant de ubehandlede og OKN-007 behandlede grupper.
Resultater
Makroskopisk, histologisk, immunhistokjemiske og MR karakteristikker av romanen orthotopic xenograft pediatrisk glioblastom (pGBM) modell IC-3752GBM og effekter av OKN-007 til å hemme IC-3752GBM svulst kultur vekst ble beskrevet i denne rapporten.
Brutto og mikroskopiske kjennetegn IC-3752GBM pGBM modell er presentert i figur 1A-1E. Makroskopisk svulstene ble karakterisert som en gulaktig grå, dårlig avgrenset masse, med multifokale områder av nekrose og blødning. Histologisk undersøkelse avslørte dårlig avgrenset, innkapslet infiltrerende svulst med markert celle atypi, høy mitotisk indeks, og multifokale områder av nekrose og blødning.
(AB) Formalin fast IC3752 pGBM vev, karakterisert som en gulaktig grå og dårlig avgrenset masse med multifokale områder av nekrose og blødning. (CE) Histologisk undersøkelse avslørte dårlig avgrenset, uinnkapslede og invasive svulster (E) preget av markert celle atypia, en høy mitotisk indeks (svarte piler) (C), og multifokale områder av nekrose (stjernetegn) og blødning (plusstegn) ( D). T = Tumor, B = normal hjerne. Målestokk = 200 um (C-D). Scale bar = 400 mikrometer (E).
Animal overlevelse ble undersøkt ved å sammenligne OKN-007-behandlede dyr med ubehandlede dyr (fig 2). Total, OKN-007 ble funnet å signifikant øke dyr overlevelse (p 0,0223) (median overlevelse på 25,5 dager) sammenlignet med ubehandlede tumorbærende mus (median overlevelse på 19,5 dager). De totale OKN-007-behandlede overlevelsesdata syntes å skildre to behandlingsrespons kohorter. For eksempel ble det funnet at seks dyr reagert på OKN-007 behandling og viste signifikant lengre overlevelsestider (
p
= 0,0002) (median overlevelse 33 dager) sammenlignet med ubehandlede dyr (n = 12) . Omvendt, har seks andre pGBM mus ikke synes å svare på den OKN-007-terapi, og viste ingen statistisk forskjell (
p
= 0,3392) sammenlignet med den ubehandlede gruppen. Den ikke-responsive OKN-007-behandlede mus syntes å ha en median overlevelse (19 dager) som var lik median overlevelse for de ubehandlede tumorbærende mus.
Det var en betydelig økning i prosent overlevelse for alle OKN-007-behandlede mus (n = 12) (
p
0,05) sammenlignet med ubehandlede tumorbærende mus (n = 12). Basert på de ulike svar kohorten ble OKN-007-behandlingsgruppen videre delt inn OKN-007-R (responsive) og OKN-007-NR (non-respondere) kohorter. OKN-007-R-mus (n = 6) viste signifikant lengre overlevelsestider (
p
0,001) sammenlignet med UT dyr (n = 12). Omvendt, OKN-007-NR mus (n = 6) viste ingen statistisk forskjell (
p
0,05) sammenlignet med den UT gruppen
For å beregne hele svulsten. volum i noen dyr, ble MSME T
1-vektede bilder utført og ervervet før (fig 3A) og 15 min etter (figur 3B) intravenøs kontrastmiddel injeksjon (Gd-DTPA, Magnevist, Bayer Inc., Wayne, NY, USA). Fig 3E viser kvantitative gjennomsnitts IC-3752GBM tumorvolum beregnet fra MR-bilder. Den totale OKN-007-behandlingsgruppe ble funnet å signifikant redusere tumorvolumer (p = 0,0289) i forhold til ubehandlede mus (figur 3E). Basert på overlevelse data som indikerte responsive og ikke-responsive OKN-007 behandlings kohorten ble tumorvolumet også skilt i form av behandlingsrespons. Seks dyr ble funnet å svare på OKN-007 behandling [OKN-007- (R)] og viste signifikant mindre svulster (
p
0,001) (fig 3D) sammenlignet med ubehandlede dyr (n = 12 ) (figur 3C). Det ble også funnet at seks pGBM mus funnet å ikke svare [OKN-007- (NR)] til den OKN-007-behandling (basert fra animalsk overlevelsesdata), viser statistisk signifikant forskjell (
p
= 0,7857) når sammenlignet med den ubehandlede gruppen.
Representative T1-vektede morfologiske bilder før (A) og etter kontrastmiddel (Gd-DTPA) injeksjon (B) i pGBM-bærende mus er vist. (A) Før kontrast administrasjon svulsten fremsto som en mildt hyperintense masse og det var vanskelig å avgrense den. (B) Femten minutter etter kontrastinjeksjon i IC3752 pGBM demonstrerer ekstrautstyr, opptegning av tumor (gul stiplet linje). Representative T2-vektet MR-bilder av UT (C) og OKN-007 (D) behandlet IC 3752 pGBM bærende mus hjerner. (E) Den kvantitative histogram for alle mus viser at alle OKN-007-behandlede mus (n = 12) hadde en signifikant redusert tumorvolum (p 0,05) sammenlignet med UT-mus (n = 12). Seks dyr reagert på OKN-007 behandling [OKN-007 (R)] og viste signifikant mindre svulster (
p
0,0001) sammenlignet med UT dyr (n = 12). Imidlertid har seks andre pGBM mus ikke synes å reagere [OKN-007 (NR)] til den OKN-007-terapi, og det var ingen statistisk forskjell mellom UT og OKN-007 (NR) gruppe. Verdier er representert som middel ± SD. Gruppe sammenligninger: (1) UT vs. OKN-007 (totalt); (2) UT vs. OKN-007 (R); og (3) OKN-007 (R) vs OKN-007 (NR).
For alle andre undersøkelser, OKN-007- (R) og OKN-007- (NR) behandlingsgruppene var sammenlignet med ubehandlede tumorbærende mus, som ikke alle mus gikk
1 H-MRS, DWI, perfusjonsbilleddannelse eller IHC vurderinger.
1H-MRS-verdier ble oppnådd hos normale atymiske nakne mus (n = 7), og ubehandlet (n = 6) og OKN-007-behandlede (n = 8) mus med IC-3752GBM gliomer. Figur 4 viser regionene hvor enkelt 8mm
3 voxel for
1 H-MR spektroskopi ble plassert i hjernen av normal mus (Fig 4A) og mus med IC-3752GBM gliomer (fig 4B). Fig 4C viser at ubehandlet IC-3752GBM pGBM mus viste signifikant lavere NAA
t /Cho
t (
p
= 0,0001) og høyere Cho
t /Cre
n (
p
= 0,0325), Cho
t /NAA
t (
p
= 0,0075), Lip0.9
t /Cre
n (
p
= 0,0363) og Lip1.3
t /Cre
n (
p
= 0,0009) forholdstall i forhold til normal atymiske mus hjernen. Den Lip1.3
t /Cre
n (
p
= 0,0395), Lip0.9
t /Cre
n (
p
= 0,0257) Cho
t /NAA
t (
p
= 0,0167), og Cho
t /Cre
n (
p
= 0,0254) ratio signifikant lavere i OKN-007- (R) -gruppe enn ubehandlet pGBM ved sluttfasen av tumorprogresjon. Den OKN-007- (R) gruppen viste en signifikant høyere NAA
t /Cho
t (
p
= 0,0492) ratio enn ubehandlet pGBM. Det var ingen signifikant forskjell mellom Cho
t /Cre
n (
p
= 0,498), NAA
t /Cho
t (p = 0,6912), Cho
t /NAA
t (
p
= 0,4231), og Lip0.9
t /Cre
n (
p
= 0.6205) prosenter av den normale mus hjernen sammenlignet med OKN-007- (R) gruppe. Den OKN-007- (R) gruppen viste en signifikant høyere Lip1.3
t /Cre
n (
p
= 0,0047) ratio enn vanlig mus hjernen. Det var ingen signifikant forskjell mellom NAA
t /Cho
t (
p
= 0,2071), Cho
t /Cre
n (p = 0,7101), Cho
t /NAA
t (
p
= 0,5362), Lip0.9
t /Cre
n (
p
= 0,7277) og Lip1.3
t /Cre
n (
p
= 0.5163) prosenter av den ubehandlede gruppen sammenlignet med OKN-007- (NR) gruppe.
Representative steder på 2 x 2 x 2 mm3 voksler som brukes til å utføre 1H-MRS i normal musehjerne (A) og IC3752 pGBM tumorbærende mus (B). (C) ubehandlede IC3752 pGBM mus viste en betydelig lavere NAAT /Chot forhold og høyere Chot /CREN (
p
= 0,0325), Chot /NAAT, Lip0.9t /CREN og Lip1.3t /CREN forholdstall når sammenlignet med de normale atymiske mus hjerner. Den Lip1.3t /Cren, Lip0.9 t /Cren, Chot /NAAT, og Chot /CREN ratio signifikant lavere i OKN-007- (R) gruppe sammenlignet med ubehandlet pGBM på slutten fasen av tumorprogresjon. Den OKN-007- (R) gruppen viste en signifikant høyere NAAT /Chot ratio enn ubehandlet pGBM. Det var ingen signifikant forskjell mellom Chot /Cren, NAAT /Chot, Chot /NAAT, og Lip0.9t /CREN forholdstall for de vanlige muse hjernen i forhold til OKN-007- (R) gruppe. Den OKN-007- (R) gruppen viste en signifikant høyere Lip1.3t /Cren forhold enn den normale mus hjernen. Det var ingen signifikant forskjell mellom NAAT /Chot, Chot /Cren, Chot /NAAT, Lip0.9t /Cren og Lip1.3t /CREN forhold til ubehandlet forhold til OKN-007- (NR) grupper. Stjernene viser statistisk signifikant forskjell (*
p
0,05, *** p 0,01; *** p 0,001; **** p 0,0001). Gruppe sammenligninger: (1) Normal vs. UT; (2) UT vs. OKN-007 (R); (3) OKN-007 (R) vs OKN-007 (NR); (4) Normal vs. OKN-007 (R); (5) UT vs. OKN-007 (NR); og (6) Normal vs. OKN-007 (NR).
I vår studie med bruk av DWI, ubehandlet gruppen viste signifikant høyere (
p
= 0,0060) (1,161 ± 0,04538, n = 11) normaliserte ADC-verdien i tumor regionene i forhold til de normale muse hjerner (1,003 ± 0.009358, n = 6) (fig 5A-5G). Den OKN-007-R-behandlede gruppen hadde signifikant høyere normaliserte ADC-verdier (1,296 ± 0,04141, n = 7) sammenlignet med den ubehandlede gruppe (p = 0,0432) eller de normale muse hjerner (
p
= 0,0003).
