Abstract
Tetraploid (4N) celler blir ansett som viktig i kreft fordi de kan vise økt tumorigenicity, motstand mot konvensjonell terapi, og er antas å være forløpere til hele kromosom Aneuploidy. Det er derfor viktig å finne ut hvordan tetraploid kreft celler oppstår, og hvordan å målrette dem. P53 er en tumor suppressor protein og nøkkelen regulator av tetraploidy. Som en del av «tetraploidy sjekkpunkt», hemmer p53 tetraploid celleproliferasjon ved å fremme en G1-arrest i begynnende tetraploide celler (referert til som en tetraploid G1 arrest). Nutlin-3a er et preklinisk stoff som stabiliserer p53 ved å blokkere interaksjonen mellom p53 og MDM2. I denne studien, Nutlin-3a fremmet en p53-avhengig tetraploid G1 arrest i to diploide kloner av HCT116 tykktarmskreft cellelinje. Begge kloner gikk endoreduplication etter Nutlin fjerning, noe som gir opphav til en stabil tetraploide kloner som viste øket resistens overfor ioniserende stråling (IR) og cisplatin (CP) -indusert apoptose i forhold til sine diploide forløpere. Disse funnene viser at transient p53-aktivering av Nutlin kan fremme tetraploid celler dannes fra diploide forløpere, og de resulterende tetraploide celler er terapi (IR /CP) bestandig. Viktigst, tetraploide kloner valgte etter Nutlin behandling uttrykt omtrent dobbelt så mye
P53 Hotell og
MDM2
mRNA som diploide forløpere, uttrykt omtrent dobbelt så mange p53-MDM2 protein komplekser (av co-immunoprecipitation) , og var mer følsomme for p53-avhengig apoptose og vekststans indusert av Nutlin. Basert på disse funnene, foreslår vi at p53 spiller nye roller i både dannelse og målretting av tetraploide celler. Nærmere bestemt foreslår at 1) forbigående p53-aktivering kan fremme en tetraploid-G1 rest og, som et resultat, kan utilsiktet fremme dannelsen av terapi-resistente tetraploide celler, og 2) terapi-resistente tetraploide celler, i kraft av å ha høyere
p53
genkopitallet og uttrykker dobbelt så mange p53-MDM2 komplekser, er mer følsomme for apoptose og /eller veksthemming av anti-kreft MDM2 antagonister (f.eks Nutlin)
Citation. Davaadelger B, Shen H, Maki CG (2014) Nye roller for P53 i Genesis og målretting av Tetraploid kreftceller. PLoS ONE 9 (11): e110844. doi: 10,1371 /journal.pone.0110844
Redaktør: Andrei L. Gartel, University of Illinois i Chicago, USA
mottatt: 27 juni 2014; Godkjent: 24 september 2014; Publisert: 07.11.2014
Copyright: © 2014 Davaadelger et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er innenfor papir
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health Grant 1RO1CA137598-01A1 fra National Cancer Institute (NCI) (til C.G.M.). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser: Forfatter. Carl Maki er en PLoS ONE redaksjonsmedlem. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til PLoS ONE redaksjonelle retningslinjer og kriterier.
Innledning
Tetraploid celler inneholder det dobbelte av normal mengde DNA, og er sjelden i de fleste normale vev. Imidlertid tetraploide celler er forholdsvis vanlig i kreft og antas å bidra til tumorutvikling, Aneuploidy, og terapiresistens [1]. Direkte bevis for karsinogent potensial av tetraploide celler ble gitt av Fujiwara et al. [2] som isolert binucleated, tetraploide mammary epitelceller fra p53-null mus. Bemerkelsesverdig, disse cellene var mer mottagelige for karsinogen-induserte transformasjon (soft-agar vekst) enn diploide motstykker, og tetraploide cellene dannet tumorer i nakne mus mens diploide celler ikke gjorde det. Andre studier har knyttet tetraploidy til stråling og kjemoterapi motstand. For eksempel Castedo et al. [3], [4] isoleres tetraploide og diploide kloner fra to humane kreftcellelinjer med vill-type p53. Viktigere, tetraploide kloner var resistente mot stråling og flere kjemoterapeutiske midler i forhold til diploide motstykker. Til slutt, det er bevis på at aneuploide kreftceller er generert fra enten asymmetrisk fordeling eller progressiv kromosomalt tap fra tetraploide forløpere. Tidlig bevis for dette kom fra studier i premaligne Barretts øsofagus. I disse studiene, utseende tetraploide celler korrelerte med p53 tap og innledes brutto Aneuploidy og kreftutvikling [5], [6]. I sum kan tetraploide celler har høyere karsinogent potensial, være terapi og stråling-resistente, og være forløpere til kreft Aneuploidy. Det er derfor viktig å identifisere hvordan tetraploid celler oppstår og hvordan de kan være målrettet for kreftbehandling.
P53 er en tumor suppressor og viktig regulator av tetraploidy [7]. p53 holdes på lave nivåer av MDM2, en E3-ligase som binder p53 og fremmer dens degradering [8], [9]. DNA-skade og andre påkjenninger forstyrre p53-MDM2 binding, forårsaker p53-nivåer for å øke. Økt p53 stopper spredning ved å fremkalle uttrykket av gener som fremmer G1-arrest (
P21
) eller apoptose (
PUMA, NOXA, BAX
) [10]. Bevis for at p53 fungerer på en «tetraploidy sjekkpunkt» kommer i stor grad fra studier med mikrotubulidynamikk hemmere (MTIs) som blokkerer celler i metafase. Celler arrestert i metafase ved lengre tids MTI eksponering kan til slutt avslutte mitose og skriv en pseudo-G1 tilstand, referert til som tetraploid G1 [11], [12]. Endoreduplication refererer til saken der disse tetraploide celler inn S-fase og kopiere deres DNA, som gir opphav til høye ploidinummer celler med økende duplikasjoner av genomet (8N, 16N, 32N, etc). Celler som mangler p53 /p21 er mer utsatt for MTI-indusert endoreduplication enn villtype-celler [11] – [14]. Dette støtter en p53-p21 avhengige tetraploidy sjekkpunkt som blokkerer S-fase oppføring av 4N celler.
Tetraploid G1-arrest er vanligvis preget av uttømming av G2 /M proteiner (f.eks Cykliner A /B, CDC2) og økt uttrykk for G1 arrest proteiner (f.eks P53, P21) i 4N celler [15] – [19]. DNA-ødeleggende midler, f.eks ioniserende stråling (IR) aktiverer p53 og arrestere celler i G1 og G2-faser. To tidlige rapporter funnet IR forårsaket p53 og p21-avhengig uttømming av CDC2, syklin A og syklin B mRNA og protein [20], [21]. I ett tilfelle, uttømming av disse G2 /M-markørene sammenfalt med endoreduplication 1-6 dager etter behandling [21]. Disse funnene antydet at p53-p21-aktivering i IR-behandlede celler kan fremme en tetraploid G1 arrest fulgt senere av endoreduplication. Nutlin-3a (Nutlin) er et preklinisk stoff som stabiliserer p53 ved å blokkere p53-MDM2 bindende. Vi har rapportert at Nutlin kunne fremme en tetraploid G1 arrest i flere p53 villtype-cellelinjer, karakterisert ved uttømming av G2 /M-proteiner og økt ekspresjon av p53 og p21 i 4N-celler [18], [19]. Ved Nutlin fjerning, p53 og p21 redusert og i noen tilfeller, celler gjennomgikk endoreduplication [18]. p53 og p21 var nødvendig for både tetraploid G1 arrest og for endoreduplication etter Nutlin fjerning. Viktigere, kunne stabile tetraploide kloner bli isolert fra Nutlin behandlede celler, og disse tetraploide kloner var resistente til IR og cisplatin (CP) -indusert apoptose [19]. Disse studiene tyder på p53-p21 aktiveres av Nutlin kan fremme en tetraploid G1-arrest og, når p53-nivåer reduksjon (Nutlin fjernelse) av cellene kan replikere deres DNA (endoreduplication) og gi opphav til tetraploide celler som er IR og CP-resistente. Imidlertid er en påminnelse av disse tidligere studier at de ble gjort i kreftcellelinjer, som kan omfatte en blanding av diploide og tetraploide celler, hvorav noen kan være naturlig IR /CP-resistente. Det er mulig at vi hadde isolert IR /CP-resistent tetraploide kloner som allerede var til stede i befolkningen, eller at tetraploide kloner vi isolert ble avledet fra diploide celler som allerede var IR /CP-resistente. Dermed forble det uklart om forbigående p53-aktivering av Nutlin kan konvertere diploide celler i tetraploide celler, og hvis ja, om de resulterende tetraploide kloner vil vise økt motstand mot terapi-indusert apoptose. Den aktuelle studien ble igangsatt for å løse disse spørsmålene, og for å teste muligheten for at tetraploide kreftceller kan være spesielt følsomme for MDM2 antagonister.
Materialer og metoder
Cellelinjer og kultur betingelser
p53 villtype og p53-null HCT116-celler (beskrevet i [11] ble oppnådd fra Dr. Bert Vogelstein (John Hopkins University). D3 og D8 er blitt beskrevet [22] og er diploide kloner som ble isolert fra p53 villtype HCT116-celler ved begrensende fortynning. cellene ble dyrket i McCoys 5A medium med 10% føtalt bovint serum (FBS), penicillin (100 U /ml) og streptomycin (100 ug /ml). cellene ble sådd ut 24 timer før de blir behandlet med Nutlin-3 (10 ^ mol /l; Sigma), bestråling (10 Gy), cisplatin (Bedford Laboratory), eller som angitt
Immunoblotting
Hele celleekstrakter ble fremstilt ved resuspendering. cellepelleter i lyseringsbuffer (150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,5% Nonidet P-40, 50 mM Tris, pH 7,5), løst ved hjelp av SDS-PAGE, og overført til polyvinylidendifluorid-membraner (NEN Life Science Products). Antistoffer mot p21 (H-164), syklin A (H-432), Geminin (FL-309), Cdk2 (M2) og p53 (AB-6) var fra Santa Cruz Biotechnology; antistoffer mot Cyclin B1 (V152), CDC2 (POH1), og Tyr-15 Phospho-CDC2 var fra Cell Signaling; antistoffer mot MDM2 (2A10) var fra Calbiochem. Antistoff mot Cyclin E (HE-2) var fra BD Pharmingen. Primære antistoffer ble detektert med geit anti-mus (Pierce) eller geite-anti-kanin (Life Technologies) sekundære antistoffer konjugert til pepperrotperoksidase, ved hjelp av klarhet kjemiluminescens (Bio-Rad).
Flow Cytometry Analysis and Lever Cell Sorting
For cellesyklus analyse ble cellene høstet og fiksert i 25% etanol over natten. Cellene ble deretter farget med propidiumjodid (25 ug /ml, Calbiochem). Strømningscytometri-analyse ble utført på Gallios strømningscytometer (Coulter Beckman) og analysert med Cellquest (Becton Dickinson) og FlowJo 8,7 (Treestar, Inc). For hver prøve ble 10.000 hendelser samlet. For levende celle sortering ble cellene inkubert med Hoechst 33342 (2 mikromol /liter, Invitrogen) i 90 min ved 37 ° C og deretter høstet. Cellesortering ble utført basert på DNA-innhold ved hjelp av en MoFlo cytometer utstyrt med en UV eksitasjon laser. De sorterte cellene ble sådd ved lav tetthet.
mRNA analyse
kvantitativ real-time PCR (QRT-PCR) ble utført for å måle mRNA nivåer for Cyclin A2, Cyclin B1, CDC2, P21, Bax, Noxa, PUMA, P53R2, Actin i celler som var ubehandlet eller behandlet med Nutlin, cisplatin, eller IR som angitt. Den kvantitative real-time PCR reaksjonen ble kjørt i en 7300 Real Time PCR System (Applied Biosystems, Foster, CA) ved hjelp SybrGreen PCR Master Mix, (Applied Biosystems, Foster City, California) etter produsentens anvisninger. Termocykling ble gjort i et sluttvolum på 20 pl inneholdende 2 ul av cDNA og 400 nmol /L av primere (primere er oppført i tabell S1). Alle prøver ble amplifisert in triplo ved å bruke den følgende syklus skjema: 95 ° C i 2 minutter, 40 sykluser av 95 ° C i 15 sekunder og 55 ° C i 60 sekunder. Fluorescens ble målt i hver syklus, og mRNA-nivåer ble normalisert ved hjelp av aktin verdiene i alle prøver. En enkelt topp ble oppnådd etter mål, som støtter spesifisiteten av reaksjonen.
metafase sprer
Cell ble inkubert med Colcemid (50 ng /ul) (Sigma-Aldrich) i en time ved 37 ° C, høstet og vasket med PBS og hypotonisk oppløsning (2 deler 0,075 M KCl, og en del av 0,7% Na-sitrat). Cellene ble deretter fiksert i fiksativ (3 deler metanol og en del eddiksyre) og spredd på et lysbilde. Oppslagene ble undersøkt under et fasekontrastmikroskop.
FISH analyse
Celler ble høstet og vasket med PBS. Deretter inkubert med hypoton oppløsning (2 deler 0,075 M KCl, og en del av 0,7% Na-sitrat) i 20 minutter ved 37 ° C. Cellene ble deretter fiksert i fiksativ (3 deler metanol og en del eddiksyre). Platene ble fremstilt og eldet ved 55 ° C i 3 minutter på en thermobrite. Glassene ble inkubert med 0,05% Pepsin (Fisher # P53-100) i 16 minutter ved 37 ° C og deretter vasket med PBS og dehydrert i 70%, 85% og 100% etanol i 1 minutt hver ved romtemperatur. Da sonden Vysis LSI TP53 SpectrumOrange /CEP 17 SpectrumGreen (Abbott Molecular Inc # 01N17-020) ble tilsatt hybridisere ved 73 ° C i 5 minutter og 37 grader i 18 timer. Deretter lysbildene ble vasket med SSC buffer (Gibco # 15557-044) med 0,5% NP-40 (Fisher # P53-100) for 2 minutter ved 73 ° C og kontra med DAPI II (Abbott Molecular Inc # 30-804818). Lysbilder ble undersøkt under fluorescerende mikroskop.
klonogene analysen.
Celler ble belagt 24 timer før de blir ubehandlet eller behandlet med CP, IR, eller Nutlin i egnede fortynninger å danne 50-100 kolonier. Etter 2-3 uker kolonier ble fiksert med formaldehyd og farget med 0,05% krystallfiolett. Koloniene ble talt opp og normalisert med plating effektiviteten av ubehandlede celler.
Resultater
Nutlin fremmer en tetraploid G1-arrest i diploide celler
Vi ønsket å spørre om forbigående p53 aktivering av Nutlin kunne fremme tetraploid celler dannes fra diploide forløpere, og hvis ja, om de resulterende tetraploide celler ville ha økt motstand mot terapi-indusert apoptose. HCT116 er en human koloncancer cellelinje som uttrykker villtype p53. I vår forrige undersøkelse, ble HCT116 belagt på enkelt celle tetthet og ti enkelt diploide kloner ble isolert (kloner utpekt D1-D10) som varierte i deres relative følsomhet for cisplatin (CP) indusert apoptose [22]. Vi valgte diploide kloner D3 og D8 for denne studien fordi disse klonene viste en relativt høy følsomhet for CP i vår forrige undersøkelse. D3 og D8 behandlet med Nutlin i 24 timer akkumulert med 2N og 4 N DNA-innhold (figur 1A). Immunoblot viste at Nutlin behandling i begge klonene forårsakes fullstendig eller nær fullstendig uttømming av syklin A, syklin B1, og Tyr-15 fosforylert CDC2 (pCDC2), og delvis uttømming av total CDC2 protein (figur 1B). Cyklin A, cyklin B1, og CDC2 mRNA ble også tappet for Nutlin behandlede celler, noe som tyder på redusert nivå av disse G2 /M-proteiner kan skyldes redusert transkripsjon (figur 1C). I motsetning til dette, ble p53 og p21 proteinnivåer markert øket ved Nutlin behandling (figur 1B). Våre tidligere studier viste p53 og p21 ble økt i både 2N og 4N Nutlin-arrestert celler [18]. Dermed fører Nutlin uttømming av G2 /M proteiner og økt uttrykk av G1-arrest proteiner (p53, p21) i 4N arrestert celler, som indikerer en tetraploid G1 arrest. Viktigere, Nutlin hadde ingen effekt på syklin A, syklin B1, pCDC2, og total CDC2 nivåer i p53-null HCT116-celler (figur 1B), og forårsaket ikke en 2N og 4 N arrest i disse cellene (figur 1A), noe som viser tetraploid G1 arrest indusert av Nutlin er p53-avhengig. Vi overvåket også nivåene av geminin, en DNA-replikasjon inhibitor som er fraværende i G1 og akkumuleres i S, G2 og M-fase [23]. Geminin ble oppbrukt av Nutlin i D3 og D8-celler, i samsvar med cellene blir G1-arrestert (figur 1B). Cdk2 nivået uendret ved Nutlin, mens nivåene av G1-fase cyclin proteiner Cyclin D1 og Cyclin E ble økt, også i samsvar med celler som blir arrestert i G1-fasen. I sum viser resultatene at Nutlin forårsaker en p53-avhengig tetraploid G1-arrest i diploide HCT116 kloner D3 og D8.
A) HCT116 diploide kloner D3 og D8, og HCT116 som uttrykker villtype p53 (p53 + /+) eller er p53-null (p53 – /-) var ubehandlet eller behandlet med Nutlin (NUT 10 uM) i 24 timer, og cellesyklusprofil bestemt ved strømningscytometri. B) Ekspresjon av de angitte proteiner ble målt ved immunblot i celler ubehandlede eller behandlet med Nutlin (NUT 10 uM) i 24 timer. C) mRNA nivåer for de angitte faktorene i ubehandlede celler eller celler behandlet med Nutlin (NUT 10 mm) i 24 timer ble bestemt ved QRT-PCR.
Transient Nutlin behandling fremmer dannelsen av terapiresistente tetrapolid kloner fra diploide forloperceller
Vi har tidligere viste 4N arrestert celler kan gjenoppta DNA-syntese etter Nutlin fjerning og kopiere deres DNA uten en mellomliggende mitotisk divisjon, en prosess som kalles endoreduplication [18], [19]. For å spørre om D3 og D8 gjennomgå endoreduplication etter Nutlin fjernet, cellene ble Nutlin behandlet i 24 timer, etterfulgt av Nutlin fjernelse for forskjellige tidspunkter. Strømningscytometri ble brukt til å overvåke cellesyklus profiler og immunoblot brukes til å overvåke proteinnivået etter fjerning Nutlin (Fig 2). D3 og D8 akkumulert med 2N og 4N DNA innhold når Nutlin behandlet i 24 timer, som i figur 1. Begge kloner gikk endoreduplication etter Nutlin fjerning, dokumentert av uttalt veksten av 4N celler 16 timer etter Nutlin fjerning og deres forbigående akkumulering i en 8N topp. Fremveksten av 4N celler og deres akkumulering i en 8N peak er et tegn på 4N celler initiere DNA-syntese, replikere deres DNA, og går inn mitose. Cyclin A2, cyklin B1, og CDC2 nivåer returnerte 16 timer etter fjerning Nutlin, i samsvar med cellene blir det meste i G2 /M på dette tidspunkt. Cyclin E-CDK2-aktivitet som antas å fremme eller være nødvendig for DNA-syntese initiering [24], [25], og p21 binder seg til og inhiberer syklin E-CDK2-aktivitet [26]. Spesielt fremveksten av 4N, celler DNA replikere 12-16 timer etter Nutlin fjerning falt sammen med en kraftig nedgang i p21 protein nivåer. Vi spekulerer de redusert nivå av p21 etter Nutlin fjerning tillatt aktivering av cyclin E-CDK2 komplekser som kan deretter kjøre DNA-syntese.
A) Diploide HCT116 kloner D3 og D8 var ubehandlet (NT) eller utsatt for Nutlin (NUT 10 uM) i 24 timer, etterfulgt av Nutlin fjerning. Cellene ble høstet ved de angitte tider etter Nutlin fjerning. Fikserte celler ble farget med propidiumjodid (25 ug /ml) og underkastet strømningscytometri-analyse. B) Celler ble ubehandlet (NT) eller utsatt for Nutlin (NUT 10 mm) i 24 timer, etterfulgt av Nutlin fjerning. Cellelysater ble oppsamlet ved angitte tidspunkter og analysert ved immunblotting med de angitte antistoffer. Actin var som en lasting kontroll.
P-Cdc2
, fosfor-Cdc2 (Tyr-15).
Neste, vi ønsket å spørre om endoreduplication etter Nutlin fjerning kan gi opphav til stabile tetraploide kloner, og hvis ja , enten de resulterende tetraploide kloner ville være motstandsdyktig mot CP eller ioniserende stråling (IR) -indusert apoptose. For dette formål, D3 og D8 ble Nutlin behandlet i 24 timer, etterfulgt av fjernelse Nutlin i ytterligere 16 timer. Cellene ble deretter merket med levende celle DNA flekk Hoechst 33342. 2N og 8N-celler ble isolert ved hjelp av strømningscytometri og utsådd ved lav tetthet for isolering av individuelle kloner (figur 3A). I alt 11 D3 kloner og 12 D8 kloner ble oppnådd fra isolerte 8N bestander som oppsto etter Nutlin fjerning. 7 av de 11 D3 kloner (63%) og 8 av de 12 D8 kloner (66%) vokste som tetraploide 4N celler. Dette ble vist ved: 1) G1 toppen av disse kloner som overlapper den G2 /M toppen av D3 og D8 diploide celler (figur 3B), 2) kromosom telling av metafase sprer som støttes de tetraploide kloner som har det dobbelte av DNA-innholdet i diploid D3 og D8 forløpere (figur 3C), og 3) FISH analyse ved hjelp av
P53 Kjøpe og kromosom 17-spesifikke prober. Dette FISH analyse viste tetraploide kloner har 4 kopier av kromosom 17 og
P53
, mens diploide D3 og D8 celler har 2 eksemplarer av kromosom 17 og
P53 plakater (figur 3D). Til slutt, vi testet om tetraploide kloner som har oppstått etter Nutlin behandling var mer motstandsdyktig mot CP og IR-indusert apoptose enn diploide kolleger. For det første 5 tetraploide kloner og 5 diploide kloner isolert fra Nutlin behandlet D3 eller D8-celler ble utsatt for CP (20 uM) eller IR (10 Gy) og apoptose overvåket 48 timer senere ved sub-G1 DNA-innhold. Som vist i figur 4A, er tetraploide kloner som en gruppe var betydelig mer resistent mot CP og IR-indusert apoptose enn parentale celler og diploide kloner isolert etter Nutlin behandling. Individuelle tetraploide kloner (T3 og TD6) var også mer motstandsdyktig mot CP og IR-indusert apoptose i forhold til diploide kolleger (D3 og D81B), dokumentert av en lavere prosent sub-G1 celler etter CP og IR behandling (figur 4B) og lavere uttrykk av spaltet PARP og spaltet caspase-3 (figur 4D). Disse resultatene er i samsvar med rapporter fra oss og andre som viste tetraploide celler kan være terapi motstandsdyktig [3], [19]. Tidligere studier har rapportert at p53 og p21 kan bidra til CP og IR-resistens i HCT116 og andre celler, mest sannsynlig ved å indusere eller håndheve en cellesyklus-stans som blokkerer CP eller IR-behandlede celler fra prolifererende og forsøker å dele [27] – [31]. Spesielt, vi fant p53, MDM2, og p21 proteinene ble overtalt til sammenlignbare nivåer i CP og IR-behandlet diploid og tetraploide kloner (fig 4C), og at p53-responsive cellesyklus arrest gener (
P21
), DNA reparasjonsgener (
P53R2
), og apoptotiske gener (
PUMA, Noxa, Bax
), ble også indusert forhold i CP og IR-behandlet diploid og tetraploide kloner (figur 4E). Disse resultatene tyder på CP og IR-motstand i tetraploide kloner er ikke forbundet med økt p53-nivåer eller aktivitet. Totalt resultatene indikerer forbigående p53-aktivering av Nutlin kan fremme en tetraploid G1 arrest og endoreduplication etter Nutlin fjerning i diploide forløper celler, som fører til dannelsen av terapi (CP /IR) -resistente tetraploide kloner.
En ) Vist er prosedyren for å isolere diploide og tetraploide kloner fra celler forbigående utsatt for Nutlin. D3 og D8 var ubehandlet (NT) eller behandlet med 10 uM Nutlin (NUT) i 24 timer, etterfulgt av fjernelse Nutlin i ytterligere 16 timer. Cellene ble deretter leve-farget med Hoechst 33342 (5 ug /ml). Cellesortering ble utført på en MoFlo cytometer utstyrt med en UV eksitasjonsbølgelengde laser. Sortert 2N og 8N-celler ble sådd ut ved lav tetthet i normalt medium (minus Nutlin) og individuelle kloner isolert. B)
Top
, sammenligning av DNA-profiler mellom D3 og en representant tetraploid klone isolert fra D3.
Bottom
, sammenligning av DNA-profiler mellom en representant diploid klone (D81B) isolert fra D8 celler, og en representant tetraploid klone (TD6) isolert fra D8 celler. C) Representant metafase spredning fra diploide D3 celler og tetraploide T3 celler. Tallet nederst til høyre viser antall kromosomer telles. D) FISH analyse med kromosom 17 (Chr 17) og p53-spesifikke prober viser tetraploide (T3) cellene inneholder 4 kopier av p53 og Chr 17, mens diploide (D3) cellene inneholder 2 kopier av p53 og Chr 17.
A) fem diploide kloner isolert fra Nutlin behandlede D3-celler (D3 diploide) og D8-celler (D8 diploide), og fem tetraploide kloner isolert fra Nutlin behandlede D3-celler (D3 tetraploid) og D8-celler (D8 tetraploid) var ubehandlet (NT) eller utsatt for CP (20 uM) eller IR (10 Gy) i 48 timer. Prosentandelen av celler med sub-G1-DNA ble bestemt. Vist er de gjennomsnittlige resultatene fra tre separate forsøk,
barer
, Standardfeil (SE). * Betydning verdi (P 0,05). B) Tetraploid kloner (T3, TD6) og deres diploide kolleger (D3, D81B) var ubehandlet (NT) eller utsatt for CP (20 mm) eller IR (10 Gy) i 72 timer. Prosentandelen av celler med sub-G1 DNA (propidiumjodidfarging) ble bestemt. Vist er de gjennomsnittlige resultatene fra tre separate forsøk,
barer
, Standardfeil (SE). * Betydning verdi (P 0,05). C) Den angitte diploid og tetraploide kloner var ubehandlet (NT) eller utsatt for CP (20 uM) eller IR (10 Gy) i 24 timer. p53, p21 og MDM2 protein nivåer ble bestemt ved immunoblotting og kvantifisert. Tallene angir det relative nivået av hvert protein. Aktin ble anvendt som en kontroll lasting. D) Den indikerte diploid og tetraploide kloner ubehandlede (NT) eller utsatt for CP (20 mm) eller IR (10 Gy) i 48 timer. Spaltes PARP og Caspase-3-proteinnivåer ble bestemt ved immunblotting og kvantifisert i forhold til den ubehandlede. E) QRT-PCR ble benyttet for å bestemme mRNA-nivåer for de angitte genene i diploid (D3, D81B) og tetraploide (T3, TD6) kloner som enten var ubehandlet (NT) eller utsatt for CP (20 uM) eller IR-spektrum (10 Gy ) i 24 timer. Nivået på hver mRNA-transkript i ubehandlede diploide kloner (D3 NT, D81B NT) ble ansett som «1.0», og alle andre verdier er plottet i forhold til det.
Tetraploid kloner er mer utsatt for p53- avhengig apoptose og veksthemming indusert av Nutlin
det var noe overraskende at p53 ble indusert forhold av CP og IR i diploide og tetraploide kloner, til tross for at de tetraploide kloner havnen dobbelt så mange eksemplarer av
P53
genet (FISH, fig 3D). Dette indikerer at nivået til som p53 induseres av CP og IR er ikke avhengig av
P53
kopitall, men i stedet kan være begrenset ved andre faktorer, kanskje mengden av skadet DNA eller aktivering nivå av stress-indusert kinaser som stabiliserer p53. Ikke desto mindre, spekulerte vi det nivået som p53 induseres av MDM2-antagonister (f.eks Nutlin) kan være avhengig av
P53
kopiantall, og som tetraploide celler kan derfor uttrykke høyere p53-nivåer i respons til Nutlin og være hyper følsomme for Nutlin-mediert veksthemming. For å teste dette, diploid D3 og D81B og deres tetraploid kolleger T3 og TD6 ble Nutlin behandlet i 24 timer. P53 og MDM2 proteinnivåer ble bestemt av immunoblot og mRNA nivåer bestemt av QRT-PCR. Resultatene viste at de tetraploide klonene uttrykker forhøyet (~2X mer) p53 og MDM2 mRNA og protein enn diploide kloner, både basalt (figur 5A) og etter 24 timers behandling Nutlin (figurene 5C). For å vurdere p53-MDM2 komplekse nivåer ble cellene behandlet med proteasominhibitor MG132 å blokkere p53 degradering, og p53-MDM2 komplekser bestemmes av co-immunoprecipitation. Disse studiene viste tetraploide kloner hadde flere p53-MDM2 komplekser etter MG132 behandling enn de diploide kloner som de oppsto (fig 5b). Således tetraploide kloner som uttrykker høyere nivåer av p53 og MDM2, og inneholder høyere nivåer av p53-MDM2 komplekser. Vi spekulerte i tetraploide kloner dette ville oversette til høyere p53 nivåer etter Nutlin behandling, og en påfølgende økning i p53-avhengig G1 arrest og apoptose. For å teste dette, sammenlignet vi den relative sensitiviteten av diploide og tetraploide kloner Nutlin-indusert cellesyklus arrest eller apoptose. Først, diploide og tetraploide kloner ble behandlet med økende doser av Nutlin (1,0-5,0 mm) i 24 timer. Økt G1 /S-forhold, noe som reflekterer uttømming av S-fase-celler og en akkumulering av celler i G1-fase, ble anvendt som et mål på Nutlin-indusert G1 arrest. Som vist i figur 6A, er tetraploide kloner som en gruppe var mer utsatt for Nutlin-indusert G1 rest enn parentale celler eller diploide kloner (G1 /S-forholdet økes mer med økende doser Nutlin i tetraploide kloner enn foreldre eller diploide kloner). Individuell tetraploide kloner T3 og TD6 var også mer utsatt for Nutlin-indusert G1 arrest enn diploide kolleger D3 og D81B (fig 6B). Som vist i figur 6C, ble p53 og p21 protein indusert til et høyere nivå og ved lavere doser Nutlin i tetraploide kloner i forhold til de diploide kloner. Disse resultatene indikerer tetraploide kloner uttrykker høyere nivåer av p53 og p21 etter Nutlin behandling og er mer utsatt enn diploide kloner til Nutlin-indusert G1 arrest. Deretter diploide og tetraploide kloner ble behandlet med en høyere dose Nutlin (20 uM) i 72 timer, og apoptose overvåkes av prosent celler med sub-G1 DNA-innhold og /eller ekspresjon av spaltet PARP og spaltet caspase-3. Som vist i figur 6D, tetraploide kloner som en gruppe var mer utsatt for Nutlin-indusert apoptose enn diploide kloner. Individuelle tetraploide kloner (T3 og TD6) var også mer utsatt for Nutlin-indusert apoptose enn diploide kolleger (D3 og D81B), dokumentert av en høyere prosent sub-G1 celler etter Nutlin behandling og økt uttrykk av spaltet PARP og kløyvet caspase-3 ( figurene 6E og F).
A) P53 og MDM2 mRNA nivåer ble sammenlignet i ubehandlede tetraploide kloner (T3, TD6) og deres diploide kolleger (D3, D81B). B) Diploid (D3, D81B) og tetraploid (T3, TD6) kloner var ubehandlet eller behandlet med proteasominhibitor MG132 (10 mm) for 8 timer.
De øvre
Nivåer av MDM2, p53, og aktin (lasting kontroll) i ubehandlet og MG132 behandlede celler vises.
Nedre
å bestemme nivåer av p53-MDM2 komplekser i diploid og tetraploide celler, protein lysatene ble immunopresipitert med anti-p53 antistoff, etterfulgt av immunoblotting for MDM2. C) Diploid (D3, D81B) og tetraploide (T3, TD6) kloner var ubehandlet eller behandlet med Nutlin (10 uM) i 24 timer. p53 og MDM2 proteinnivåer ble oppdaget av immunblotting og kvantifisert ved hjelp av Image-J programvare. Den relative mengde av p53 og MDM2-protein i de ubehandlede diploide kloner ble gitt en verdi på «1,0». Tallene angir det relative nivået av hvert protein. Aktin ble anvendt som en kontroll lasting.
A) Fem diploide kloner isolert fra Nutlin behandlede D3-celler (D3 Diploide) og D8-celler (D8 Diploide), og fem tetraploide kloner isolert fra Nutlin behandlede celler D3 (D3 Tetraploid) og D8-celler (D8 Tetraploid) var ubehandlet eller behandlet med økende Nutlin (1,0-5,0 mm) i 24 timer. Den prosent G1 og S-faseceller ble bestemt ved flowcytometri, og folden endring av G1 /S-forholdet er plottet. Ubehandlet diploide kloner G1 /S-forholdet ble gitt en verdi på 1,0. Vist er gjennomsnittet av tre separate eksperimenter, +/- SE. B) Tetraploid kloner (T3, TD6) og diploide kolleger (D3, D81B) var ubehandlet eller behandlet med Nutlin (1,0-5,0 mm) i 24 timer. Fold endring av G1 /S-forholdet er plottet. Vist er gjennomsnittet av tre separate eksperimenter, +/- SE. C) Diploid (D3, D81B) og tetraploide (T3, TD6) kloner var ubehandlet eller behandlet med økende Nutlin (1,0-5,0 mm) 24 timer. P53 og P21 proteinnivåene ble kvantifisert ved hjelp av Image-J programvare. Tallene angir de relative nivåer av hvert protein. P53 og p21 nivåene i ubehandlede diploide kloner ble gitt en verdi på «1,0». Actin ble brukt som lasting kontroll. D) Fem diploide kloner isolert fra Nutlin behandlede D3-celler (D3 Diploide) og D8-celler (D8 Diploide), og fem tetraploide kloner isolert fra Nutlin behandlede D3-celler (D3 tetraploid) og D8-celler (D8 Tetraploid) var ubehandlet (NT) eller behandlet med Nutlin (20 mm) 72 timer og apoptose bestemt. Vist er de gjennomsnittlige resultatene fra tre separate forsøk,
barer
, Standardfeil (SE). * (P 0,05). E) Representative diploid (D3, D81B) og tetraploid (T3, TD6) kloner var ubehandlet (NT) eller behandlet med Nutlin (20 uM) i 72 timer. Prosentandelen av celler med sub-G1 DNA-innhold (propidiumjodidfarging) ble bestemt. Vist er de gjennomsnittlige resultatene fra tre separate forsøk,
barer
, Standardfeil (SE).
