Abstract
Bakgrunn
Lung adenokarsinom er den ledende årsak til kreft dødsfall blant både menn og kvinner i verden. Til tross for nylige fremskritt i diagnose og behandling, dødelighetsratene med et totalt fem-års overlevelse på kun 15%. Denne høye dødeligheten er trolig tilskrives tidlig metastasering. Selv om flere kjente markører korrelerte med dårlig /metastase prognose i lunge adenokarsinom pasienter ved immunhistokjemi ble rapportert, de molekylære mekanismene for adenokarsinom utvikling lunge er fortsatt ikke klart. Å utforske nye molekylære markører og deres signalveier vil være avgjørende for å hjelpe i behandling av lunge adenokarsinom pasienter.
metodikk /hovedfunnene
For å identifisere nye lunge adenokarsinom-forbundet /metastase gener og å avklare de underliggende molekylære mekanismer av disse målene i lungekreft progresjon, har vi opprettet en bioinformatikk ordningen består av å integrere tre genekspresjon profil datasett, inkludert parvise lunge adenokarsinom, sekundære metastatiske svulster vs. godartede svulster, og en rekke invasive cellelinjer. Blant de nye mål identifisert, ble FLJ10540 overuttrykt i lungekreft vev og er assosiert med cellemigrering og invasjon. Videre benyttet vi to co-uttrykk strategier for å identifisere hvor veien FLJ10540 var involvert. Lunge adenokarsinom array-profiler og vev microarray IHC flekker data viste henholdsvis at FLJ10540 og VEGF-A, samt FLJ10540 og fosfo-AKT utstillingen positive sammenhenger,. Stimulering av lungekreftceller med VEGF-A resulterer i en økning i FLJ10540 proteinekspresjon og forbedrer kompleksdannelse med PI3K. Behandling med VEGFR2 og PI3K hemmere påvirker celle migrasjon og invasjon ved å aktivere PI3K /AKT veien. Videre knockdown av FLJ10540 destabiliserer dannelsen av P110-α /P85-α- (PI3K) kompleks, ytterligere støtte deltakelse av FLJ10540 i VEGF-A /PI3K /AKT sti.
Konklusjon /Betydning
Dette funnet satte scenen for videre testing av FLJ10540 som et nytt terapeutisk mål for behandling av lungekreft, og kan bidra til utvikling av nye terapeutiske strategier som er i stand til å blokkere PI3K /AKT sti i lungekreftceller.
Citation: Chen CH, Lai JM, Chou TY, Chen CY, Su LJ, Lee YC, et al. (2009) VEGFA oppregulerer FLJ10540 og modulerer Migrasjon og invasjon av Lung Cancer via PI3K /AKT Pathway. PLoS ONE 4 (4): e5052. doi: 10,1371 /journal.pone.0005052
Redaktør: Mikhail V. Blagosklonny, Ordway Research Institute, USA
mottatt: 22 desember 2008; Godkjent: 12 februar 2009; Publisert: 01.04.2009
Copyright: © 2009 Chen et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet delvis med tilskudd fra Chang Gung Hospital (CMRPD140211) og NSC (94-2752-B-010-002-PAE) til Chen-Kung Chou, NSC (Program for tverrfaglig forskningsprosjekt: NSC97-2627-B-010 -011 til Chi-Ying Huang, NSC97-2627-B-030-001 til J.-M. Lai), og NSC97-3112-B-010-025-CC1, Taichung Veteran General Hospital (TCVGH-957326D), og programmet for å fremme faglig dyktighet av universiteter (National Yang Ming University) til Chi-Ying Huang, og NSC (95-3112-B-075-002 og 96-3112-B-075-001) til Yu-Chung Wu. Den Gene Expression Analysis Kjerne Facility er støttet av National Research Program for Genomisk medisin (NRPGM), National Science Council, Taiwan. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft er den ledende årsak til kreft dødsfall blant både menn og kvinner i verden [1] – [2]. Til tross for nylige fremskritt i diagnostikk og behandling, dødelighet fortsatt høy, med en samlet 5-års overlevelse på bare 15%. Kirurgi er fortsatt førstevalget for behandling for lokaliserte ikke-småcellet lungekreft og gir den beste muligheten for helbredelse. Men når først diagnostisert, de fleste pasienter som allerede har avansert sykdom, og bare 35% av pasienter med ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) er kvalifisert for reseksjon [3]. Nye molekylære markører eller mål å hjelpe i diagnose og behandling vil være avgjørende for å bedre dødeligheten.
Tumor invasjon og metastasering er viktige områder for undersøkelse for å fastslå den aggressive fenotype av kreft hos mennesker og er de viktigste årsakene til kreftdødsfall [4]. Prosessen med metastasering er svært kompleks og regnes som en sen hendelse i tumorigenesis, dvs. celler spre seg, mister kontakten med nabocellene, vandrer gjennom interstitiell matrix, invadere blod og lymfekar, og innskudd til lymfeknutene. Migrering og invasjon av celler synes å være et resultat av et komplekst samspill mellom de tallrike proteinfamilier som deltar i denne prosessen. Mekanismer for celle bevegelse er viktig ikke bare som en del av basis cellulære og utviklingsmessige prosesser, men også i patogenesen av forskjellige sykdommer [5]. For å bli metastatisk, må tumorcellene øker ekspresjonen av forskjellige metastase-fremmende gener. Men i lungekreft, molekylene og mekanismene som er involvert i cellevandring eller invasjon fortsatt i stor grad ukjent.
Produksjon og sekresjon av VEGF-A er ofte observert i de fleste aggressive svulster, og uttrykk for VEGF-A dypt påvirker prognose av kreftpasienter, inkludert de med lungekreft [6] – [8]. VEGF-A er en av de mest potente stimulatorer for angiogenese identifisert så langt, som påvirker endotelial celle vaskulær permeabilitet, proliferasjon, og motilitet [7]. Selv om forskjellige intracellulære signalveier er blitt foreslått å formidle de biologiske aktivitetene til VEGF-A i endotelceller, blir signaleringshendelser som er involvert i cellemigrering og invasjon i respons på VEGF-A stimulering i lungekreft ikke fullt ut forstått.
FLJ10540 har flere navn, blant CEP55 [9], C10orf3 [10], og URCC6. CEP55 merket med GFP-C lokaliserer til den sentrosomen i interfase-celler, til spindelen midtsone under anaphase, og til den midbody under cytokinese [9], [11] – [12]. Videre Cdk1, ERK2, og Plk1 samarbeide i fosforylering av CEP55 under mitose, som er nødvendig for riktig lokalisering av mitotiske CEP55 og dens funksjon i løpet av cytokinese [9]. FLJ10540 er overuttrykt i løpet av human colon [10] og hepatocellulært karsinom [13] tumorgenese, noe som tyder på at det kan fungere som et oncogen i tumorutvikling. I tillegg har vi tidligere har vist at overekspresjon av FLJ10540 bidrar til cellulær transformasjon gjennom aktivering av PI3K /AKT [13]. Imidlertid har blitt utført noen stor skala analyse av FLJ10540 Uttrykket og clinicopathologic og funksjonell betydning i human lungekreft.
Den aggressive oppførsel av maligne kreftceller blir bestemt av en kompleks rekke av signalveier som regulerer viktige funksjoner , slik som vekst, overlevelse, migrering og invasjon. Den PI3K /AKT signalveien er årsaksmessig knyttet til alle fire av disse svarene. [14] – [17]. Ytterligere bevis på viktigheten av PI3K /AKT signalering i kreft kommer fra studier som har oppdaget overekspresjon og hyperaktiveringen av PI3K /AKT i et bredt spekter av humane tumorer, inkludert lungekreft, og dette er ofte forbundet med dårlig prognose [18]. Samle bevis fra tidligere rapporter antyder en potensiell rolle PI3K /AKT migrasjon og invasjon av ulike celletyper, inkludert lungekreft [19], leverkreft [20], brystkreft [21], og bukspyttkjertelkreft [22].
i denne studien, viser vi at FLJ10540 er overuttrykt i lunge adenokarsinom og at ektopisk uttrykk for FLJ10540 fremmer celle migrasjon og invasjon. I menneskelige lunge adenokarsinom prøver, FLJ10540 positivt korrelert med VEGF-A uttrykk, som bestemmes av genuttrykk profilering og IHC farging av microarray. I tillegg stimulering med VEGF-A resulterte i en økning i FLJ10540 protein ekspresjon i en doseavhengig måte i CL
1-0 lungekreftceller. Videre FLJ10540 delvis translocates fra cytoplasma til plasmamembranen og forbedrer kompleksdannelse med PI3K henhold til VEGF-A stimulering. Endelig påvirker VEGF-A cellemigrasjon og invasjon ved å aktivere FLJ10540 /PI3K /AKT pathway. Disse funnene tyder på at FLJ10540 overekspresjon er assosiert med en økt metastatisk potensial og kan tjene som et mulig nytt terapeutisk mål for lunge adenokarsinom.
Resultater
Forhøyet FLJ10540 uttrykk i lunge adenokarsinomer og kreftcelle invasiv lunge linjer
En betydelig utfordring i post-genomisk æra er å bestemme hvordan man skal prioritere forskjellig uttrykt og dårlig karakteriserte mål i kreftrelaterte microarray profilering studier. Her har vi satt opp en bioinformatikk plattform ved å integrere tre forskjellige microarray datasett for å avdekke viktige regulatorer involvert i metastasering av lungekreft. Figur 1 viser skjematiske dataintegrasjon tilnærminger og FLJ10540 uttrykk data i ulike kategorier. Først ble prøver fra 26 pasienter med lunge adenokarsinom, bekreftet av histopatologi, utsatt for Affymetrix microarray profilering. Basert på de 26 primære lunge adenokarsinom eksemplarer, ble 826 av 22 283 forskjellig uttrykt transkripsjoner mellom tilstøtende ikke-tumor og tumor områder gruppert ved Wilcoxon signert rank test (
p
0,01), basert på to-fold forskjeller og testet ved hjelp av Benjamini og Hochberg falske funnrate korrelasjon (
p
0,01). Disse molekylære portretter, som inneholder 192 oppregulert og 634 nedregulert transkripsjoner, kunne med hell skille pasientenes tilstøtende ikke-tumor og tumor områder av hierarkisk clustering (figur S1 A). For det andre ble offentlig tilgjengelige microarray data (som er lastet ned fra GEO) benyttes til å erverve forskjellige microarray datasett, som ble normalisert ved quantile Normalisering å bruke R til å sette opp potensialet en metastatisk biomarkør identifikasjon plattform. Vi har sammenlignet 225 sekundære metastatiske svulster (inkludert 20 kreftmetastaser til lymfeknuter og 200 metastatiske svulster) og 30 godartede svulster å få sett av potensielle metastatiske onkogener (871) og metastatisk suppressor gener (1042). Til slutt, for å prioritere mål og for å bekrefte våre metastase-relaterte gener i cellelinjer, en serie av lunge adenokarsinom-cellelinjer, blant annet CL
1-0, CL
1-1, CL
1-5 og CL
1-5-F4, med økende grad av invasivitet [23], ble også utsatt for microarray profilering. Totalt 6,238 transkripsjoner hadde høyere uttrykk nivåer i høy invasjonen evne cellelinje CL
1-5-F4 enn foreldre CL
1-0 celler. Skjæringspunktet mellom disse tre datasettene avslører mange nye mål. Vi karakteriserte gener som er konservert bare i virveldyr, men ikke i virvelløse dyr, for å avsløre noen nye humane kreftspesifikke abnormiteter. Som et resultat, har vi fokusert på dårlig karakteriserte genet
FLJ10540
.
(A, venstre panel) microarray uttrykk mønstre av
FLJ10540
i lunge adenokarsinom pasienter ble normalisert mot de uttrykk mønstre på HG_U133A chips. N: tilstøtende ikke-tumorvev; T: tumorvev. Den boxplot viser datafordeling som en gruppering klassifisering og indikerer at det er en statistisk signifikant forskjell (
p
0,0001) mellom tumorvev og tilstøtende Nont-umor vev fra den samme lungekreftpasient. (A, panel høyre) mRNA nivåer av
FLJ10540
i prøver fra 16 lungekreftpasienter ble bestemt av Q-RT-PCR. Resultatene ble normalisert mot uttrykket nivåer av
GAPDH
mRNA i hver sammenkoblet prøve og plottet med boksplott. (B) Den microarray uttrykk mønstre av
FLJ10540
ble sammenlignet mellom 30 godartede svulster, 20 kreftmetastaser til lymfeknuter og 200 metastatiske svulster, og var viste med boksplott. (C, venstre panel) mRNA nivåer av
FLJ10540
ble bestemt av Q-RT-PCR i lunge kreft cellelinjer. Resultatene ble normalisert mot nivået av
GAPDH
mRNA i hver cellelinje. Forsøkene ble utført in triplo. (C, høyre panel) Totalt protein ble hentet fra CL
1-0 og CL
1-5-F4 celler og utsatt for immunoblot analyse med anti-FLJ10540. β-aktin ble benyttet en intern lasting kontroll.
FLJ10540
utstillinger oppregulert uttrykk mønstre i lunge adenokarsinomer (figur 1A, venstre panel) og metastatisk signaturer (Figur 1b). For å validere genuttrykk profilering data for
FLJ10540
, Q-RT-PCR ble utført på 16-parvise lunge adenokarsinom svulsten og tilstøtende ikke-tumorprøver. Figur S1B viser at overekspresjon av
FLJ10540
var observerbar i våre lunge pasientprøver, med 15 av 16 lungesyke svulster (94%) som viser et høyere signal etter normalisering til
GAPDH
for lik mal lasting. Den gjennomsnittlige Ekspresjonsnivået av
FLJ10540
i lunge adenokarsinomer var 8 ganger høyere enn det i tilstøtende ikke-tumor lunge vevsprøver, som analysert ved boxplot (figur 1A, høyre panel). Vi neste bekreftet ekspresjon av FLJ10540 i representative og ferskt frosset lunge adenokarsinom og tilstøtende ikke-tumorprøver ved immunhistokjemisk farging ved anvendelse av anti-humane FLJ10540 antistoffer. Våre data indikerer at nivået av FLJ10540 ble øket i tumorprøver, sammenlignet med den i de tilstøtende ikke-tumor vev (data ikke vist).
Ekspresjon av FLJ10540 i en serie av invasiv human lunge adenokarsinom cancer cellelinjer
i løpet av lunge svulst utvikling, en av de mest kritiske overgangene er progresjon fra
in situ
til invasiv kreft. For å utforske mulige rolle FLJ10540 i invasivitet av lunge adenokarcinomceller, vi først undersøkte uttrykk for
FLJ10540
i et panel av cellelinjer, CL
1-0, CL
1-1 , CL
1-5, og CL
1-5-F4, med enten lav eller høy invasive egenskaper, som tidligere beskrevet [23] ved Q-RT-PCR. Dataene viste at nivåene av
FLJ10540
mRNA var høy i CL
1-5 og CL
1-5-F4 celler som har høye invasive og metastatiske evner, men var lavere i lav invasiv CL
1-0 celler (figur 1C, venstre panel). FLJ10540 proteinnivåer ble også markert høyere i meget inngripende CL
1-5-celler enn i den lave invasiv CL
1-0-celler, som vist ved western blot analyse (figur 1C, høyre panel). Resultatene indikerte at oppregulering av FLJ10540 mRNA og protein ekspresjon ble positivt korrelert med invasiv evnen til lungekreftceller, øke muligheten for at oppregulering av
FLJ10540
kan føre til noen av de uregelmessigheter som finnes i human lunge adenokarsinom .
Overuttrykte FLJ10540 fremmer celle migrasjon og invasjon
Siden FLJ10540 er overuttrykt i lunge adenokarsinom og en meget inngripende lungekreft cellelinje, virket det mulig at dens uttrykk kan påvirke cellemotilitet. For å klargjøre rollen FLJ10540 i bevegeligheten i pattedyrceller, vi undersøkt om overekspresjon av FLJ10540 var i stand til å påvirke celle migrasjon og invasjon. To forskjellige celletyper ble anvendt for å evaluere denne mulighet. Først CL
1-0-celler som stabilt uttrykker hemagglutinin (HA) -tagged FLJ10540 ble etablert. Flere stabile transfektanter med økende nivåer av FLJ10540 protein ble valgt (figur 2A, venstre panel) for videre studier. Interessant, FLJ10540 overekspresjon i CL
1-0 celler var assosiert med påfallende endret celle morfologi. FLJ10540 overuttrykt kloner ble redusert i cellestørrelse og syntes å være mer spindel-formet og hadde økt inter separasjon sammenlignet med vehikkel kontroll-kloner, som ble rund-formet (figur 2A, midtre panel). Imidlertid formeringshastigheten, som bestemt ved MTT-analysen, var ikke signifikant forskjellig fra den for bærerkontrollen eller celler som uttrykker FLJ10540 i løpet av 24 timer (figur 2A, høyre panel). For å undersøke effekten av FLJ10540 på human lungekreft cellemigrering, ble stabile cellelinjer som uttrykker HA-FLJ10540 eller bærerkontroll utsådd på Transwell kamre. Resultatene viste at FLJ10540 CL
1-0-stabile transfektanter kan øke deres vandring, som målt ved hjelp av Transwell migrasjon assay; Dette ble sammenlignet med bærerkontroll, hvor meget få celler migrert (figur 2B, venstre øvre panel). Kvantitativt sett migrering evne FLJ10540 CL
1-0-stabile transfektanter var omtrent 6-7 ganger høyere enn den for bærerkontrollen (figur 2B, til høyre øvre panel). Vi neste gjennomført en
in vitro
invasjon analysen bruker en Matrigel belagt barriere filter. Etter en 24 timers inkubering i en Matrigel-belagte Transwell kammer, FLJ10540 CL
1-0-stabile transfektanter hadde invadert basalmembran materiale og føres gjennom porene for å nå undersiden av filteret (figur 2B, til venstre nedre panel) . Tilsvarende FLJ10540 CL
1-0 uttrykker celler viste en 10-12 ganger høyere invasjon evne enn kjøretøy kontrollcellene (figur 2B, nede til høyre panel).
(A, venstre panel) HA-merket -FLJ10540 stabile kloner av CL
1-0 celler ble etablert. Cellelysatene ble underkastet immunoblotanalyse med anti-HA-antistoff. (A, midtre panelet) Fase kontrast av monolagkulturer av CL
1-0 celler som uttrykker FLJ10540 og kjøretøy kontroll ble vist. (A, panel høyre) For å måle cellevekstrater, 5 × 10
3 celler av kjøretøy-CL
1-0 og CL
1-0-FLJ10540 stabile kloner ble sådd på dag 0 i 96- brønners plater med 10% FBS. Cellene ble tellet ved angitte tidspunkter etter MTT-assayet (OD
570) for å kvantifisere cellevekst. Data ble normalisert mot OD
570 verdi på dag 0. vekst på CL
1-0 celler er vist som gjennomsnitt ± s.d. av tre uavhengige eksperimenter. (B, øvre panel) For migrasjon analysen, 5 × 10
3 celler av kjøretøy-CL
1-0 og CL
1-0-FLJ10540 stabile kloner ble sådd på toppen av en Transwell innsats . Etter 24 timer ble cellene på oversiden skrapet, og cellene som migrerte til den nederste ble fiksert og farget med Giemsa. Migrasjonen relative ganger kjøretøy-CL
1-0 og CL
1-0-FLJ10540 stabile kloner ble normalisert med kjøretøy kontroll og presenteres skjematisk. (B, nedre panel) For invasjonen analysen, 1 × 10
4-celler ble sådd etter Matrigel ble lagt. Invasjonen relative ganger stabil klonen ble normalisert mot kjøretøy celler og representert skjematisk. Alle data som representerer gjennomsnitt ± s.d. av tre uavhengige eksperimenter.
For det andre, for å unngå klonale effekter, ble en retroviral-basert Flag-merket FLJ10540 smittet til en RK3E cellelinje (figur S2A) som tidligere hadde blitt brukt med hell til å vurdere migrasjon eller invasjon indusert av ulike gener og signalveier, for eksempel fibroblast vekstfaktor 9 (FGF9) [24], k-ras [25], og Snail [26]. RK3E celler utviser flere funksjoner i epitel, for eksempel en tilnærmet normal karyotype og en lav bakgrunn av cellemigrering og invasjon. Blandede bassenger av infiserte RK3E celler ble brukt til migrasjon og invasjon analyser. Igjen, FLJ10540 uttrykker celler viste en 4-5 ganger høyere migrasjon evne enn bilen kontroll celler (Figur S2B) og en 7 ganger høyere invasjon evne enn bilen kontroll celler (Figur S2C). Samlet utgjør disse funnene støtter hypotesen om at FLJ10540 kan fremme celle migrasjon og invasjon i pattedyrceller.
Knock-down av endogen FLJ10540 av siRNA undertrykker lungekreft celle migrasjon og invasjon
For å bekrefte at FLJ10540 påvirker celle migrasjon og invasjon i humane lungekreftceller, brukte vi en siRNA tilnærming til å hemme endogen uttrykk for FLJ10540 og deretter analysert migrasjons og invasjons evnene til CL
1-5 og H1299 celler. Først, for å undersøke spesifisiteten av siRNAs, en HA-merket FLJ10540 uttrykk konstruere var co-transfektert med tre forskjellige sirnas; disse besto av to kjemisk syntetiserte sirnas spesifikke for FLJ10540 (siFLJ10540-1 og siFLJ10540-2) og en negativ kontroll siRNA, som ble hver transfektert inn i HEK293T celler. Begge FLJ10540 sirnas viste nesten fullstendig inhibering av HA-merket FLJ10540 uttrykk, slik som vist ved Western blot analyser ved anvendelse av et anti-HA-antistoff, mens nivået av HA-merket FLJ10540 forble høy med den negative kontroll siRNA (data ikke vist). For det andre, for å undersøke om de spesifikke FLJ10540 sirnas kunne hemme endogen FLJ10540 uttrykk i CL
1-5 og H1299 celler, transfektert vi sirnas i CL
1-5 og H1299 celler for 24 timer, etterfulgt av western blot analyse ved hjelp av et antistoff mot FLJ10540. Dataene viste en dramatisk reduksjon i FLJ10540 protein nivåer med begge FLJ10540 sirnas, og det var ingen signifikant reduksjon av FLJ10540 når den negative siRNA ble anvendt (figur 3A og B, venstre panel). Imidlertid formeringshastigheten, som bestemt ved MTT-analysen, var ikke signifikant forskjellig mellom de negative kontrollceller og celler som uttrykker FLJ10540 sirnas i løpet av 24 timer (figur 3A og B, midtre panel). For det tredje, for å studere effekten av siRNA FLJ10540 transfeksjon på migrasjon, negativ kontroll og siRNA FLJ10540-transfektert CL
1-5 eller H1299 cellene ble separat sådd ut på Transwell kamre med ubelagte filtere. Etter 24 timers inkubasjon ble motilitet potensialet til siRNA FLJ10540 celler funnet å ha vært sterkt hemmet av de sirnas (figur 3A og B, høyre panel). Til slutt ble de samme paneler av negative eller FLJ10540 siRNA transfekterte celler sådd ut i en Matrigel-belagte Transwell kammer. Etter 24 timers inkubering, invasiv potensialet i siRNA FLJ10540 cellene så ut til å bli betydelig redusert (figur 3A og B, høyre panel). Disse resultatene sterkt støtte ideen om at FLJ10540 spiller en rolle i celle migrasjon og invasjon i humane lungekreftceller.
(A og B, venstre panel) En negativ kontroll siRNA med to forskjellige FLJ10540 sirnas (siFLJ10540-1 og siFLJ10540-2) ble transfektert inn i CL
1-5 og H1299-celler i 24 timer. Etter transfeksjon, ble western blotting utført ved anvendelse av anti-FLJ10540 og anti-p-aktin-antistoffer. (A og B, midtre panelet) For å måle cellevekstrater, 5 × 10
3 celler med negativ kontroll-CL
1-5, CL
1-5-FLJ10540 sirnas, negativ kontroll-H1299, og H1299-FLJ10540 sirnas ble sådd ut på dag 0 i 96-brønners plater med 10% FBS. Cellene ble tellet ved angitte tidspunkter etter MTT-assayet (OD
570) for å kvantifisere cellevekst. Data ble normalisert mot OD
570 verdien på dag 0 for hver behandling. Veksttakten i CL
1-5 og H1299 celler er vist som gjennomsnitt ± s.d. av tre uavhengige eksperimenter. (A og B, høyre panel) Migrasjonen relativ-fold og invasjonen relative gangers av CL
1-5 og H1299 ble normalisert mot negative kontrollceller og representert skjematisk. Resultatene representerer gjennomsnitt ± s.d. av tre uavhengige eksperimenter.
Ved hjelp av konseptet med syn-uttrykk for å avdekke VEGF-A, men ikke VEGF-B, som oppstrøms regulator av FLJ10540
Gener som tilhører samme pathway viser ofte de samme uttrykk profiler, som blir referert til som syn-ekspresjon [27]. Derfor, for å kartlegge potensielle signalveien eller oppstrøms regulator (e) deltar i FLJ10540-fremkalt migrasjon og invasjon egenskaper, benyttet vi vår lungekreft microarray datasettet, som beskrevet tidligere, for å få innsikt i den funksjonelle samstemmighet av co-uttrykte gener. For å teste denne hypotesen, må vi først undersøkt om mRNA uttrykk profilen til
FLJ10540
korrelerer med noen ligand eller reseptor i vår lungekreft microarray database (figur 1). Av disse co-uttrykte gener, er toppkandidaten
VEGF-A
, som var sterkt positivt korrelert med mRNA uttrykk nivået av
FLJ10540
i sammenkoblede lungekreftpasienter (r = 0,7 p 0,001) (figur 4A). VEGF-A er kjent for å være en kritisk pro-angiogene faktor, med evne til å regulere mange trinn i den angiogene prosess, som proliferasjon, migrering, invasjon, og overlevelse [28], [29]. Faktisk er VEGF-A sterkt uttrykt i mange maligne tumorer, inkludert lungekreft [30], [31], [32], og ekspresjonen av VEGF-A er assosiert med dårlig prognose [33], [34] og tilstedeværelsen av lymfeknutemetastase [35], øke muligheten for at de biologiske roller FLJ10540 og VEGF-A kan være funksjonelt knyttet sammen i lunge adenokarsinom.
(A) microarray uttrykk mønstre av
VEGF-A Hotell og
FLJ10540
i lunge adenokarsinom pasienter ble vist. Resultatene ble normalisert mot uttrykk mønstre av 56 chips (HG_U133A). N: tilstøtende ikke-tumorvev; T: tumorvev. (B, venstre panel) VEGF-A induserte en økning i FLJ10540 proteinnivåer i en doseavhengig måte. Etter behandling med forskjellige konsentrasjoner av VEGF-A (venstre panel) eller VEGF-B (høyre panel) i 10 minutter i CL
1-0-celler, ble de totale proteinene ekstrahert fra CL
1-0-celler og probet med antistoff mot FLJ10540. (B, midtre panel) serum-sultet CL
1-0 celler ble forbehandlet med eller uten forskjellige konsentrasjoner av SU5416 i 2 timer; Cellene ble deretter stimulert med 20 ng /ml VEGF-A i 10 min. β-aktin ble benyttet som en intern kontroll lasting. (C) Serum-sultet CL
1-0-celler ble forbehandlet med eller uten SU5416 i 2 timer; Cellene ble deretter stimulert med VEGF-A (ved en konsentrasjon på 20 ng /ml) i 3 timer. Migrasjon og invasjon relative-folder ble normalisert mot kjøretøy celler. (D, venstre, øvre panel) For migrasjon analysen, 5 × 10
3 celler av kjøretøy-CL
1-0 og CL
1-0-FLJ10540 stabile kloner ble sådd på toppen av en Transwell sette inn og tillates å følge i 12 timer, og ble deretter inkubert med eller uten VEGF-A (20 ng /ml) i 3 timer. Ved slutten av forsøket ble cellene på oversiden skrapet, og cellene som migrerte til den nederste ble fiksert og farget med Giemsa. (D, venstre, nedre panel) for invasjonen analysen, 1 x 10
4 celler ble sådd etter Matrigel ble tilsatt, og ble deretter inkubert med eller uten VEGF-A (20 ng /ml) i 3 timer. Alle data som representerer gjennomsnitt ± s.d. av tre uavhengige eksperimenter. (E) Indirekte immunofluorescens-analyse av FLJ10540 i VEGF-A-behandlede celler. Den proteinekspresjon og den subcellulære lokalisering av FLJ10540 ble analysert i nærvær eller fravær av VEGF-A (20 ng /ml) i CL
1-0 celler ved hjelp av immunfluorescens-mikroskopi. Etter å ha blitt inkubert med eller uten VEGF-A i 30 minutter eller 180 minutter, ble cellene fiksert med 3,7% formaldehyd og behandlet for indirekte immunofluorescens-mikroskopi. FLJ10540 translocated til cellemembranen ved VEGF-A behandling (Arrowhead). Bar:. 10 mikrometer
Gitt den store rollen som VEGF-A i å regulere migrasjon og invasivitet, var vi først interessert i om VEGF-A kan modulere FLJ10540 protein uttrykk. Resultatene viste at protein ekspresjonsnivået av FLJ10540 ble oppregulert i en VEGF-A doseavhengig måte i CL
1-0 lungekreftceller (figur 4B, venstre panel). Vi neste spørsmål om den antagonistiske effekt av SU5416, kan en VEGFR-2-tyrosinkinase-inhibitor, på biologiske aktiviteter av VEGF-A tilskrives inhiberingen av FLJ10540 protein overekspresjon indusert av VEGF-A i lungekreftceller. Resultatene viste at oppregulering av FLJ10540 i nærvær av VEGF-A ble inhibert ved samtidig tilsetning av SU5416 på en doseavhengig måte (figur 4B, midtre panel). Tvert imot, ble proteinnivået FLJ10540 ikke påvirket av behandling med VEGF-B (figur 4B, høyre panel). Faktisk,
FLJ10540
ikke dele lignende uttrykk mønstre med
VEGF-B
, i hvert fall ikke i vår lungekreft microarray, støtter ideen om at synexpression mønstre kan brukes til å utlede funksjon ukjente gener [27].
VEGF-A-indusert FLJ10540 overekspresjon og trans forbedrer lungekreft celle migrasjon og invasjon gjennom en EMT-uavhengig pathway
for å teste den biologiske betydningen av VEGF-A- indusert oppregulering av FLJ10540, undersøkte vi påvirkning av FLJ10540 på migrering og invasjon i nærvær eller fravær av VEGF-A. Først undersøkte vi om foreldre CL
1-0 celler kunne vise cellemotilitet etter stimulering av VEGF-A. På figur 4C, CL
1-0 celler oppviste mer migrasjon og invasive egenskaper i nærvær av VEGF-A alene enn VEGF-A kombinert med SU5416 eller bærer alene, noe som antyder at tilsetningen av VEGF-A betydelig økt migrasjon og invasjon av CL
1-0 celler, som ble stadig av en økning i FLJ10540 nivåer. Lignende resultater ble funnet i FLJ10540 CL
1-0-stabile transfektanter, med eller uten VEGF-A stimulering (figur 4D).
For å teste om den subcellulære lokalisering av FLJ10540 kan bli endret i lungekreftceller på VEGF-A stimulering, vedtok vi den indirekte immunfluorescens tilnærming til å observere FLJ10540 lokalisering i CL
1-0 lungekreft celler enten med eller uten VEGF-A stimulering. Som vist i figur 4E, VEGF-A behandling ikke bare ført til en økning i FLJ10540 proteinekspresjon, men det også fremmet translokasjon av en fraksjon av FLJ10540 til cellemembranen. I tillegg til forskjellene i cellemorfologi var mer tydelig, fremhever forlengelse av VEGF-A-behandlede celler (figur 4E, 30 min og 180 min) sammenlignet med den avrundede CL
1-0-celler (Figur 4E, 0 minst ). Disse morfologiske endringer bedt oss om å undersøke fenomenet epiteliale-mesenchymale overgang (EMT). Under tumorgenese, kan EMT øke bevegelighet og invasivitet av kreftceller, og ondartet transformasjon kan være forbundet med signalveier å fremme EMT [36]. En tidligere studie viste også at ekstracellulære signaler indusert av VEGF-A er sterkt innblandet i EMT i menneskelige bukspyttkjertelen carcinoma celler [37]. For å undersøke hvorvidt FLJ10540 kan mediere VEGF-A-indusert EMT, og dermed forbedre cellemigrering og invasjon, brukte vi H1299 og CL
1-0 lungekreftceller, med eller uten VEGF-A stimulering, for å løse dette spørsmålet. Imidlertid, til tross for å øke cellebevegelighet ved å overuttrykke FLJ10540 eller redusere celle motilitet ved FLJ10540-medierte sirnas, forskjeller i FLJ10540 nivåene ikke på noen måte endrer uttrykket nivåer av noen av markørproteiner er forbundet med EMT, slik som E-cadherin og vimentin ( data ikke vist). Derfor synes FLJ10540 å megle migrasjon og invasjon effekter av VEGF-A uavhengig av EMT og ser ikke ut til å spille en rolle i regulering av EMT, i hvert fall i de lungekreft cellelinjene vi analysert.
En positiv β-aktin ble benyttet som en intern kontroll lasting.
