Abstract
Potente RNase aktiviteter ble funnet i serum hos pattedyr, men den fysiologiske funksjon av RNases var aldri bra illustrert, hovedsakelig på grunn av de begrensningene i metoder for RNase aktivitetsmåling. Ingen av de eksisterende metoder kan skille mellom RNaser med ulike mål spesifisiteter. En systematisk undersøkelse ble nylig utført i vårt laboratorium for å undersøke den sete-spesifisitet av serum RNaser på dobbelt-trådet RNA-substrater, og fant at serum RNaser spalter dobbelt-trådet RNA hovedsakelig ved 5′-U /A-3 «og 5»- C /A-3 «dinukleotidpolyfosfater områder, på en måte som likner RNase A. Basert på dette funnet, var en FRET analyse utviklet i denne studien for å måle dette stedsspesifikke serum RNase aktivitet i humane prøver ved hjelp av en dobbel strandet RNA substrat . Vi har vist at fremgangsmåten har et dynamisk område på 10
-5 mg /ml- 10
-1 mg /ml ved hjelp av seriefortynning av RNase A. sera av 303 kreftpasienter ble underkastet sammenlignet med friske kontrollpersoner 128 , og det ble funnet at serum RNase-aktivitet visualisert med denne stedsspesifikk dobbelttrådet probe ble funnet å være betydelig redusert hos pasienter med magekreft, leverkreft, kreft i bukspyttkjertelen, spiserørskreft, eggstokk kreft, livmorkreft, blærekreft, nyrekreft og lungekreft, mens bare mindre endringer ble funnet i bryst og tykktarm kreftpasienter. Dette er den første rapporten ved hjelp av dobbelt-trådet RNA som probe for å kvantifisere stedsspesifikke aktiviteter RNase A i et serum. Resultatene viste at RNase A kan vurderes nærmere for å finne ut om det kan tjene som en ny klasse av biomarkører for visse krefttyper
Citation. Huang W, Zhao M, Wei N, Wang X, Cao H, du Q, et al. (2014) stedsspesifikke RNase A aktivitet ble dramatisk redusert i Serum fra flere typer kreftpasienter. PLoS ONE 9 (5): e96490. doi: 10,1371 /journal.pone.0096490
Redaktør: Chandravanu Dash, Meharry Medical College, USA
mottatt: 19 november 2013; Godkjent: 08.04.2014; Publisert: 07.05.2014
Copyright: © 2014 Huang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Beijing Natural Science Foundation (5132015), National Basic Research Program of China (2011CBA01102), National High-tech R D Program of China (2012AA022501), fond fra Guangdong Science and Technology (2011B090400478) og Institutt for lærerutdanning of China (20090001110052 og 200 800 010 019). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
RNase A er en endoribonuclease med funksjoner i RNA-metabolismen og regulering av genekspresjon. Den ble funnet å spille roller i sykdommer så som autoimmune sykdommer, renal insuffisiens og bukspyttkjertel [1], [2], [3], [4]. Flere nylig, en antitumor aktivitet ble også rapportert om en RNase A med cytotoksiske og cytostatika egenskaper [5], [6].
I de siste tiårene, ble biokjemiske egenskaper RNase En godt undersøkt [7]. Som en unik evolusjonær konservert proteinfamilie, medlemmene av RNase A-superfamilien er normalt sammensatt av 124 aminosyrer [8]. Medlemmene av RNase A-superfamilien er allment uttrykt og er tilstede i serum og vev hos pattedyr [9]. Fem RNaser, nemlig RNase 1, RNase 2, RNase 3, RNase 4 og RNase 5, ble identifisert i human serum så tidlig som i 1976 [10], [11]. RNase 1 ble senere funnet å være den humane homolog av RNase A, og dermed er også referert til som human RNase A RNase A er den dominerende komponenten endoribonuclease i menneskelige organer og vev [9]. RNase 2 og RNase 3 oppfører seg med en lignende funksjon ribonucleolytic [2]. I tillegg til å fungere i mRNA og 18S rRNA degradering, RNase 4 og RNase 5 ble også rapportert å ha en angiogenese-funksjon, mens RNase 5 spesielt kan fremme veksten av blodkar [1].
Ranpirnase er et RNase A super medlem identifisert i frosk (Rana pipiens) eggceller [12]. Som den minste medlem i RNase A-superfamilien, er ranpirnase en enkelt streng poly-peptid som består av 104 aminosyrer [12]. Foreløpig er ranpirnase i en klinisk studie av fase IIIb, der, ranpirnase ble testet for å behandle pasienter med operabel ondartet mesothelioma, lungekreft og leukemi, og ble vist å øke overlevelsestiden hos behandlede pasienter [13], [14]. Den uventede oppdagelse av anti-kreft-aktivitet av ranpirnase antydet at andre nye funksjoner kan bli videre undersøkt for medlemmer av RNase A-superfamilien.
Noen metoder er blitt testet for å måle serumnivåene RNase. Radioaktivt merket t-RNA og dsRNA-substrat ble brukt av Saxena og Ben-Artzi for å bestemme RNase aktiviteten av angiogenin og RNase III [15], [16]. Hybridiserte RNA bestående av en 17-mer antisens- RNA-tråden og RNA fra T24-cellelinjen ble brukt i en studie for å karakterisere dobbel tråd RNase ribonucleolytic aktivitet [17]. I en angiogenin studien ble en FRET metode som brukes av Kelemen
et al.
Å undersøke den katalytiske effektiviteten av RNase. Denne metode er imidlertid fungerer bare under svært lave nivåer RNase [18]. Overraskende, selv om disse fremgangsmåter er i prinsipp den samme, de oppnådde resultater fra disse analysene var ikke konsistente. Reddi
et al.
Anvendes poly-C som substrat for å bestemme RNase nivå ved å måle den gjenværende substrat etter at RNase-behandling [19]. Fremgangsmåten ble brukt av Funakoshi og andre grupper i 1976 og betydelige forbindelser ble oppnådd mellom RNase nivåer og bukspyttkjertel sykdommer, inkludert kreft i bukspyttkjertelen og pankreatitt [20], [21], [22]. På omtrent samme tid, Marabella vist en metode for å utføre RNase-analyse, ved hjelp av gjær RNA som substrat [23]. Senere ble en jodering metode som brukes til å merke ribosomalt RNA. Ved hjelp av et radioaktivt merket substrat, ble det gjenværende substrat bestemmes kvantitativt, ved hjelp av en auto-gamma-scintillasjons-spektrometer [24]. Ved hjelp av denne protokollen, Kurihara
et al.
Målte RNase-aktivitet i serum, og fant at serum RNase nivåer ble ikke korrelert med kreft histologi, i stedet viser en korrelasjon med noen fysiologisk indeks [25]. Videre er kjemisk syntetisert poly-C, så vel som t-RNA ekstrahert fra
E. coli
, ble brukt som underlag i RNase analysen av Kemmer
et al.
[26]. Selv om målinger av serum RNase nivå ble oppnådd i disse studiene, utilstrekkelig kapasitet skille enkelte RNase i en blanding kan ha vært den tekniske hinder som hindret forskerne å nå konsensus resultater i forskjellige serum RNase studier.
I 2003 undersøkte Czauderna
et al.
serumet stabiliteten av siRNA og funnet at nedbrytningen var hovedsakelig et resultat av endoribonuclease spalting. De fant også at, når noen kritiske områder ble endret, ble serum stabilitet av de sirnas vesentlig forbedret [27]. Senere, Turner og Haupenthal studier indikerte at RNase A spilt en vesentlig rolle i serum nedbrytning av siRNA i pattedyr [28], [29]. Deretter stedsspesifikke cleavage mønstre på C-A, U-G og U-A områder ble identifisert ved Volkov [30]. I en tidligere studie utført med125I sirnas, vi videre illustrert at spaltingen av dobbelt-trådede RNA forekom hovedsakelig på to steder, 5′-C /A-3 «(5′-U /G-3» på komplementære tråden) og 5 «-U /A-3» dinukleotidpolyfosfater nettsteder [31].
i denne studien har vi utviklet en dual fluorescensmerket RNA duplex som inneholdt en 5′-C /A-3 «cutting området som den spesifikke substrat for serum RNase A. Vi anvendte fluorescens-resonans energioverføring (FRET) -metoden, en svært følsom optisk teknologi, for å studere dynamikken i reaksjon mellom fluorescerende merkede substrater og RNase A, for å bygge opp en standardkurve for å korrelere RNase nivåer med mengden av katalytiske produkter for å utlede den RNase A nivået av serum. Ved hjelp av denne analysen, var vi i stand til å granske RNase A-aktivitet i serum fra kreftpasienter. Vi sammenlignet med RNase A nivået av pasienter med 11 slag av kreft med den friske kontroller, og fant serum RNase A-nivå i pasienter med cervikal cancer, spiserørskreft, nyrekreft, lungekreft, blærekreft, pankreatisk kreft, eggstokk kreft, leverkreft og magekreft er betydelig nedregulert når sammenlignet med den til friske kontroller (P 0,001), mens serum RNase nivået av brystcancer og kolonkreftpasienter var ikke svært signifikant forskjellig fra den friske individer
Resultater
design og karakterisering av en FRET Probe for Serum RNase Måling
et velkjent faktum i molekylærbiologi er at enkelt-strandet RNA er veldig ustabil i de fleste tilfeller, spesielt i nærvær av ribonuklease. Den raske nedbrytningsprosesser gjør det også vanskelig å overvåke nedbrytingsprosessen i sann tid. Denne situasjonen ytterligere fører til vansker med å etablere kvantitative målinger av RNase-aktivitet.
Forskjellig fra enkelt-trådede RNA, dobbelt-trådet RNA er generelt mye mer stabile. I en fersk undersøkelse profilering serum nedbrytning av dobbel-strandet sirnas, fant vi at både lange og korte dobbel-strandet RNA brytes ned hovedsakelig på to utsatte steder, nemlig 5′-U /A-3 «og 5» C /A -3 «dinukleotidpolyfosfater nettsider [31]. Basert på dette funnet, spekulert vi at dobbelt-trådede RNA kan bli brukt som et substrat for å måle serum RNase-aktivitet. For dette formål ble en dobbelt-trådet RNA-sekvens utformet for å bære et enkelt 5»-C /A-3 «følsomme området, som ble bekreftet i degradering assay (figur 1A). RNase A er den dominerende RNase i humant serum som medierer nedbrytningsprosessen av slike dsRNAs (figur 1B). For å lette overvåkning av nedbrytningsprosessen av denne probe i sanntid, ble et FRET system konstruert ved å integrere en donor fluorescens FAM og en akseptor-fluorescens TAMRA ved 5 «enden av hver komponent RNA tråder. Så lenge RNA duplex holder intakt, de to endemerkede fluorescerende fargestoffer er nær nok til å mediere energioverføring fra donor til akseptoren (figur 2A), som fører til en emisjonstopp ved 575 nm når eksitert ved 480 nm (figur 2B ). Når den tosidige brytes ned, vil energioverføring fra FAM til TAMRA bli avbrutt, og emisjonstoppen vil skifte fra 575 nm til 515 nm, under de samme betingelser eksitasjon (figur 2B). Derfor måle endringen av emisjonstoppen ved 515 nm kan brukes for å overvåke nedbrytningsprosessen av duplex RNA og gjenspeiler aktiviteten av RNase i systemet (Figur 2C).
A) Nedbrytning av en 1860 bp lang RNA duplex ble utført i RNase A. Nedbrytnings fragmenter ble hentet ut og sekvensert. Ved å justere nedbrytnings fragmenter med den opprinnelige RNA-sekvens, ble spaltningsseter identifisert og presentert i form av forholdet for hvert mulig dinukleotid side [31]. B) Duplex RNA degradering analysen. Dual-merkede duplex RNA ble hver inkubert med RNase A, blir blandingen av RNase A RNase A og inhibitor, humant serum, blandingen av humant serum og RNase A inhibitor. Prøvene ble samlet og kjører i en denaturert PAGE gel.
A) Skjematisk illustrasjon av FRET basert RNase analysen. Den duplex RNA (13 bp) var dobbelt-merket med fluorescein (FAM) som donor og tetramethylrhodamine (TAMRA) som akseptor i hver ende. B) Normalisert fluorescens-spektrum av duplex RNA (13 bp) inkubert med (grønn linje) eller uten (rød linje) RNase /serum ved 25 ° C i 15 min. C) Duplex RNA degradering analysen måling i sanntid. Duplex RNA ble hybridisert og inkubert i sammensmeltningsbuffer ved 25 ° C. RNase eller serum ble tilsatt i den angitte tid. Fluorescens av donor (FAM) ble registrert i sanntid (faste punkter). Prøver på ulike tidspunkt (fra venstre til høyre: 0 s, 10 s, 60 s, 180 s, 480 s) ble samlet og kjører i en denaturert PAGE gel (Innfelt). Fluorescens ble skannet på Typhoon viser det resterende beløpet av full lengde dsRNA.
Det er vel etablert at energioverføringen effekt avhenger i hovedsak av avstanden og den relative orientering av donor og akseptor fluorescens i probe [32]. På den ene side øker en kort probe energioverføringseffektiviteten i FRET, mens på den annen side, har en lengre probe en høyere smeltetemperatur, og er mer stabil. RNA-duplekser av 8 og 13 bp ble undersøkt for å optimalisere lengden av substratet. Resultatene viste at 13-bp substrat, med sekvenser som 5′-AUGAGCCUGAUUU-3 «/3′-UACUCGGACUAAA-5», var optimale for FRET deteksjon. Denne RNA dupleks ble deretter anvendt som reaksjons substratet i studien.
Optimalisering av analysesystem
å måle RNase-aktivitet i systemet, og fire mikroliter av 5 uM dual-merket RNA-substrat var lagt inn 2 ml slite buffer under konstant omrøring. Før du legger RNase eller testprøver, ble en baseline kurve registrert ved 480 nm eksitasjon i ca 30 sekunder, ved hjelp av en QuantaMaster 30 spektrofluorometer (Photon Technology International, Birmingham). Deretter RNase løsning eller testprøver ble tilsatt til reaksjonssystemet, og fluorescensen ble registrert ved 515 nm i et intervall på tre sekunder i 15 minutter. For dataanalyse ble bakgrunnsfluorescens subtrahert fra prøven fluorescens for å oppnå en reell-tidskurven, for derved å overvåke nedbrytingsprosessen i sann tid under behandlingen (figur 2C). En ikke-lineær regresjon metode (enkelt-eksponensiell ligning) ble anvendt for å tilpasse dataene og motta konstanten K
obs av nedbrytningsreaksjonen (figur 3A).
A) Kvantifisering av nedbrytning i FRET-assay. FAM-fluorescerende intensitet omdannes som degradering forholdet ved å definere bunn og topp fluorescensintensitet som 0% og 100%. Bunnen er den fluorescerende intensitet av full lengde dual-merket dsRNA; topp er den fluorescerende intensitet av FAM-merket enkelt streng RNA. Den AF
max ble definert som 100%. Den fluoriserende avlesning av prøver ble montert på enkelt-eksponensiell ligning (rød linje) for å oppnå hastighetskonstanten K
obs. Prosent nedbrytning ved et gitt tidspunkt ble beregnet som 100 x AF /AF
maks. B) Nedbrytning av dual-merket dsRNA på ulike konsentrasjon av RNase A, overvåket av FRET analyse (fra bunn til topp: 10
-7 mg /ml, 10
-6 mg /ml, 10
– 5 mg /ml, 0,001 mg /ml, 0,003 mg /ml, 0,006 mg /ml, 0,01 mg /ml). C) Standard kurve av RNase En konsentrasjon og K
obs. K
obs ble oppnådd som beskrevet i figur 3A. D) K
obs skiftende mønster etter frysing-tining behandling. K
obs bestemmes fra humane serumprøver frosset på -80 ° C og tint ved værelsestemperatur fra 0 til 6 ganger.
På en slik måte, ble en standard kurve etablert ved å måle RNase A-aktivitet i seriefortynnet RNase A løsninger, i et konsentrasjonsområde between10
-7 til 10
-1 ug /ul (Figur 3C). For hver konsentrasjon ble en kinetisk kurve opp (figur 3A), og en referansekurve ble laget i henhold til den beregnede K
obs for å beskrive forholdet mellom aktivitet og konsentrasjonen av RNase A. En simulert kurve viste at nedbrytningen aktivitet steg raskt når den RNase-konsentrasjonen ble øket (figur 3C). Resultatene viste at et lineært forhold over et bredt område av RNase A-konsentrasjoner fra 10
-7-10
-3 ug /ul. Etter å legge RNase A 10
-7 ug /ul, fluorescerende signal intensitet økes 1000 a.u., signalstøyforhold var to fold. Påvisningsgrensen av FRET analysen var 10
-7 ug /ul. Når den RNase-analysen ble utført med 1 x 10
-6 pg /pl RNase A, økes det fluorescente signalintensiteten fra 41000 a.u. til 58000 a.u., og støyen i denne undersøkelse var 500. signal-støy-forhold på under 1 x 10
-6 ug /ul er 34 fold. Ifølge denne signal-støy-forhold, den detekterbare serien var så lav as1 x 10
-6 ug /ul. Den ikke-lineær regresjon R
2 til 1 × 10
-6 ug /ul konsentrasjonen var 0,9856. Under konsentrasjon på 1 x 10
-5 ug /ul, det ikke-lineære regresjon R «sup> 2 var 0,9945. På den annen side, økes det fluorescente signalintensiteten fra 43000 a.u. til 78000 a.u., og signalet støy-forholdet var 70 ganger. I henhold til R «sup> 2 og det signal støyforhold, konkluderte vi med at konsentrasjonsområdet RNasene som lett kan måles ved denne metoden bør være fra 1 x 10
-5-0,1 ug /ul.
for ytterligere å validere denne analysen systemet, ble RNase aktiviteter målt for humane serumprøver som har gjennomgått gjentatte fryse-tine-behandling. Ved å fryse prøvene ved -80 ° C og tining på is i flere ganger, ble RNase aktivitetene av prøvene målt ved anvendelse av den nåværende FRET-metoden. Det ble funnet at RNase kunne overleve flere fryse-tine sykluser uten tap av aktivitet, noe som indikerer den aktuelle fremgangsmåten kan benyttes for frosne kliniske prøver (figur 3D).
Måle Serum RNase-aktivitet i kreftpasienter
Ved hjelp av denne FRET-basert måling av RNase aktivitet, ble et sett av humane serumprøver studert, inkludert 55 friske personer og 34 kreftpasienter som dekker noen vanlige krefttyper. Den standardkurve som er beskrevet ovenfor ble brukt for å beregne de relative serum RNase konsentrasjoner av humane serumprøver, og deretter den relative RNase konsentrasjonen av kreftpasienter ble sammenlignet med den for friske individer (gjennomsnitt av normale kontroller vilkårlig er satt til 100%). Resultatene viste at serum RNase nivåene var signifikant nedregulert for alle 7 typer krefttyper (figur 4).
Serum RNase aktiviteter ble bestemt for friske individer samt 4 mage kreftpasienter, 5 kolon kreftpasienter , 5 lungecancerpasienter, 5 esophageal kreftpasienter, 5 nyrekreftpasienter, 5 livmor kreftpasienter og 5 bukspyttkjertelcancerpasienter. RNase konsentrasjon av hver serumprøve ble beregnet ved standardkurve og K
obs oppnådd fra enkelt-eksponensiell ligning. Den relative serum RNase aktivitet for hver kreftpasient ble kvantifisert ved å normalisere kreftpasient serumkonsentrasjonen med gjennomsnittlig konsentrasjon av sunne individers serumprøver.
For å bekrefte disse observasjonene ble ytterligere serumprøver innsamlet fra pasienter med brystkreft, magekreft, tykktarmskreft, leverkreft, kreft i bukspyttkjertelen, spiserørskreft, eggstokk kreft, livmorkreft, blærekreft, nyrekreft og lungekreft, ved en prøvestørrelse på 303 kreftpasienter totalt. Vurdering av disse prøver viste en nedregulering av serum RNase nivåer i magekreft, leverkreft, kreft i bukspyttkjertelen, spiserørskreft, eggstokk kreft, livmorkreft, blærekreft, nyrekreft og lungekreft (tabell S1). Det ble ikke observert tydelige endringer i serum RNase nivåer for brystkreftpasienter og tykktarmskreftpasienter. Disse resultatene i stor grad støttet våre tidligere observasjoner. Den magekreft, leverkreft, bukspyttkjertelkreft, spiserørskreft, eggstokk kreft, livmorhalskreft, blærekreft, nyrekreft og lungekreft pasientgrupper skilte seg fra sunn gruppe med en P-verdi mindre enn 0,001. Til sammenligning er P-verdien for brystkreft gruppe var bare 0,0619, og viser ingen tydelig forskjell fra kontrollgruppen (figur 5). Samlet utgjør disse data indikerte at nedregulering av serum RNase-aktivitet er et generelt fenomen i mange vanlige krefttyper. Denne observasjonen antydet et potensial for stedsspesifikk RNase som en vanlig kreft biomarkør.
Serum RNase nivåer ble kvantifisert for friske individer samt 37 livmorhalskreftpasienter, 37 esophageal kreftpasienter, 37 nyrekreftpasienter, 24 lunge kreftpasienter, 10 blærekreftpasienter, 21 bukspyttkjertelkreft pasienter, 23 eggstokk kreftpasienter, 32 leverkreftpasienter, 27 mage kreftpasienter, 31 tykktarmskreftpasienter og 24 brystkreftpasienter (for mer detaljer om data, se tabell S1).
det var 32 leverkreft testet den gjennomsnittlige relative aktivitet sammenlignet med normal kontroll var 32,9%, med P 0,0001. Ut av de 32 prøvene, falt bare en prøve til kontrollvirksomhet rekkevidde. Tjue sju magekreftpasienters serum ble testet, var gjennomsnittlig relative aktiviteten var 38,8%, med P 0,001. Det var 24 lungekreftpasienter «serum ble testet, den gjennomsnittlige relative aktiviteten var 29,1%, P 0,0001. Trettisyv esophageal kreftpasienters serum og 35 livmorhalskreftpasienters serum, ble 37 nyrekreftpasienter «serum og 21 bukspyttkjertelkreft testet og vist seg å ha en 21,1% med P 0,0001, 20,2% med P 0,0001, 27,6% med P 0,0001, 29,4% med P 0,0001, henholdsvis. Det var 23 eggstokkkreftpasienter sera ble målt, er den relative aktivitet av eggstokk kreft var 28,6%, med P 0,0001, og ett tilfelle var falt inn i reguleringsområde. For blærekreft vi også observert en eksepsjonell sak som falt ned i normalområdet, mens den gjennomsnittlige relative aktiviteten var 29,5%, med P 0,0001. Den brystkreft ikke dele lignende nedregulert RNase mønster med alle de andre 10 typer kreft, den relative aktivitet av brystkreft var 61,4%, noe lavere enn de normale individer, men statistisk analyse foreslått en slik forskjell er kanskje ikke signifikant (P = 0,0619). En lignende situasjon oppsto med tykktarmskreftpasienter undersøkt med den gjennomsnittlige relative RNase A-aktivitet på 54,5% og P . 0,05
ingen forskjell i serum RNase nivåer mellom pasienter med primær og metastatisk tykktarmskreft
RNase nivåer ble ytterligere undersøkt i primære og metastatiske tykktarmskreftpasienter, for å undersøke om de utbredte verdier av RNase-aktivitet i serum av tykktarmskreftpasienter var på grunn av blanding av faser, og hvis RNase aktivitetsforskjeller kan brukes for å diskriminere ulike stadier av denne kreftformen. Serumprøver ble samlet inn fra primær- og metastasetykktarmskreftpasienter for hvem de metastase stadier ble bestemt ved undersøkelse av vev biopsi. Serumprøver fra ti pasienter med lymfeknute-metastaser og 10 uten metastaser ble samlet og analysert ved hjelp av RNase FRET-assay. Resultatene viste ingen forskjell mellom de to gruppene (figur 6).
Disse rum RNase aktiviteter 10 primærtykktarmskreftpasienter og 10 metastaser kolon kreftpasienter ble kvantifisert ved FRET analyse.
diskusjon
en korrelasjon mellom serum RNase nivåer og bukspyttkjertelkreft ble først rapportert av Reddi i 1976. ved hjelp av en optisk metode, de målte serumnivået av RNase ved å tallfeste sin aktivitet på poly-C RNA, en ikke- spesifikk RNase substrat [19]. I slutten av 1970 og begynnelsen av 1980-tallet, ble radioimmun implementert i RNase måling [24], [25], og i noen studier E. coli tRNA ble brukt til å erstatte poly-C som analysen substrat [26], disse forbedringene forbedre målenøyaktigheten av RNase. Flere studier har blitt gjennomført for å undersøke serum RNase nivåene hos pasienter med ondartet kreft, godartet svulst, røyker, nyresvikt, og i særlig pasienter med pankreatitt og kreft i bukspyttkjertelen. Disse studiene er imidlertid avdekket et blandet bilde [22], [24]. Selv Funakushi og Kemmer gruppene rapporterte økt serum RNase nivåer hos pasienter med både kreft i bukspyttkjertelen og pankreatitt [21], [26], Reddi og Warshaw grupper imidlertid funnet at RNase nivået økte bare i bukspyttkjertelen kreftpasienter [19], [22], mens serum RNase nivåer av pankreatitt pasienter lå på omtrent samme nivå som friske kontroll [19], [22]. Mitsuhashi og Kurihara grupper, derimot, fant at serum RNase nivåer knyttet bare med alder, røyking, samt noen andre fysiologiske indeks, inkludert blod urea nitrogen og albumin innholdet [25]. I tillegg er en fersk studie rapportert forhøyet serum RNase nivåer hos pasienter med juvenil diabetes mellitus [33]. Enda en annen rapport viser at RNase en endret sin ekspresjonsnivået av mikromatriser og western-blotting-metoden under magekreft utvikling [34].
Disse avvik kan være forårsaket av kompleksiteten av Reddi s assay, for eksempel reaksjonsterminerings trinn eller stoffet rensetrinn. I disse analysene ble reaksjonssystemer la på is for en god stund, før høy dose HClO
4 ble tilsatt for å stoppe fordøyelsen. Men i vår studie, ble det bemerket at isbad behandling ikke kunne helt avskaffe RNase aktivitet. Ekstra, rensing av ufordøyd polynukleotid kan være et nytt skritt for komplikasjon for Reddi sin analyse. I dette trinn en enkel sentrifugering ble brukt for å fjerne di-nukleotid og tri-nukleotid resulterte fra RNase spaltning. Denne prosessen er imidlertid også kanskje også fjerne noen lengre polynukleotider som ikke ble fullstendig fordøyd, og derfor fører til over estimert aktivitet av serum RNase.
A FRET-analysen ble anvendt i vårt studium for å ta opp den fluorescerende intensitet i sanntid, slik at man unngår reaksjonstermineringsprosessen og rensetrinnet. Registrering av fluorescens-signalet endres i sanntid, og ved hjelp av et FRET sonde som har bare én RNase A-spaltningssete, tilsynelatende aktivere en nøyaktig beregning av K
obs for reaksjonen.
I den foreliggende undersøkelse, en FRET basert metode ble etablert for å måle serum RNase nivåer konsekvent med høy sensitivitet for å påvise så lite som 1 × 10
-7 ug /ul RNase. I denne studien ble resultatene av spektrofluorometer systematisk optimalisert ved hjelp av Raman spekteret av vann. Dette ble funnet å øke kvaliteten av målingen og reproduserbarhet mellom testene. Ved å bruke en 2 ml reaksjonsvolum, vi var faktisk i stand til å måle serum RNase nivå uten serie fortynning, og dermed unngikk potensielle avvik forårsaket av en 1000 tid fortynning i andre protokoller.
re-oppdagelse av RNA verden har trekkes mer og mer oppmerksomhet til en rekke forskjellige RNaser fungerer i RNA modifikasjon og metabolisme. Således er en pålitelig metode for å RNaser En deteksjons kan være sannsynlig for slike studier. Den FRET-analysen ble etablert i den foreliggende undersøkelse er ikke bare begrenset til RNase måling i serumprøver, men kan også brukes i mange andre kliniske tester og vitenskapelige analyser. Med tolkningen av resultatene, for eksempel observert nedgang på RNases A aktivitet i serum av visse typer kreftpasienter, en klype forsiktighet må tas, som vi ikke var å ta medisiner av ulike pasienter i betraktning, og det er behov for å avgjøre om noen medisiner kan hemme RNase A-aktivitet. Iscenesettelse av pasienter utsatt for serum RNase målingen er åpenbart en av de viktigste faktorene for å vurdere før verve RNase som en potensiell biomarkør, og på grunn av dette flere pasienter med tidlig stadium kreft bør testes for å spore den første påvisning av reduksjon av RNase A-aktivitet .
Materialer og metoder
Menneskelig Prøvetaking og etikk erklæringen
Denne studien har fulgt Helsinkideklarasjonen, og gjennomført i henhold til de prinsipper som er godkjent av etikk anmeldelse styrene Kreft sykehus, Chinese Academy of Medical Sciences (Beijing, Kina). Skriftlig informert samtykke ble gitt for prøvetaking og påfølgende analyse. I alt ble 431 serumprøver samlet fra friske individer og kreftpasienter og analysert i studien. Karakteristikken av kreftpasient ble beskrevet i tabell 1. Den sera ble lagret ved -80 ° C etter samling.
oligonukleotidsyntese og klargjøring
To komplementære og fluoroforen-merkede RNA-oligonukleotider med sekvenser av 5′-FAM-AUGAGCCUGAUUU og 5′-TAMRA-AAAUCAGGCUCAU ble syntetisert og renset ved TAKARA (Dalian, Kina). Konsentrasjoner av RNA oligonukleotid ble bestemt ved å måle absorpsjonen ved 260 nm, ved hjelp av et Nanodrop spektrofotometer. Ekstinksjonskoeffisienten ble også målt ved 260 nm, noe som resulterer i 140860 L /(mol * cm) for den FAM-merket RNA oligonukleotid og 156 900 L /(mol * cm) for den TAMRA-merket RNA oligonukleotid. De to komplementære RNA oligonukleotider ble blandet i et sammensmeltningsbuffer (5 mM Tris-HCl, pH = 7,6, 10 mM NaCl) ved en konsentrasjon på 5 uM. Blandingen ble inkubert ved 95 ° C i 5 minutter i en termosykler, og deretter ble temperaturen redusert med 5 ° C for hver 5 min for å tillate dupleks-dannelse. De resulterende tomannsboliger ble sjekket i en 20% polyakrylamid gel og visualisert ved SYBR Gold farging (Molecular Probes, Eugene, OR, USA).
FRET analyse
Fluorescens målingene ble utført i FRET buffer (0,01 M Tris-HCl, pH 7,4, 0,002 MgCl
2), ved hjelp av en QuantaMaster 30 spektrofluorometer (Photon Technology International, Birmingham).
I 2 ml fret buffer, 10 nM RNA duplex ble under konstant omrøring. Eksitasjonsbølgelengden ble innstilt ved 480 nm, og emisjonsspektrumet signalet ble målt mellom 500 og 650 nm. En økning i fluorescens-emisjon ved 515 nm indikerer fremdriften av RNA spaltning. Et eksempel på data som er samlet er presentert i figur 2C.
For data normalisering, en intakt 13 bp siRNA ble analysert som en tosidig kontroll, og en helt spaltet siRNA ble inkludert som en degradering kontroll. FAM fluorescerende intensiteter ble konvertert som degradering forholdet ved å definere bunn og topp fluorescerende intensiteter som 0% og 100%. Normaliseringsfremgangsmåten ble nevnt i figur 3. Fluorescerende avlesninger ble montert til den enkelt-eksponentielle ligning (rød linje) for å oppnå hastighetskonstanten K
obs. Prosent degradering på et gitt tidspunkt ble beregnet som 100 × AF /AF
max (figur 3A).
For å sikre RNase-fri tilstand, setter vi eksitasjon bølgelengde på 480 nm, og undersøkt utslipp mellom 500 til 650 nm av intakte underlag. Intakt substrat viser lavt signal ved 515 nm og høyt signal ved 575 nm, mens nedbrutte produkter resulterer i forhøyede signaler ved 515 nm.
I henhold til beskrivelsen ovenfor, da de to merkede 13-bp siRNA i 2 ml FRET buffer blandet med RNase en oppløsning eller serumprøver, vil fluorescensen av FAM økes. Endringen av fluorescens ble overvåket over tid med eksitasjons bølgelengde satt til 480 nm og emisjon ved 515 nm. For enkelt omsetning kinetikk analyse, hastighetskonstanten k
obs og amplitude av maksimal nedbrytning F
max ble utledet ved å tilpasse eksperimentelle data til enkelt eksponentiell likning:.
Identifikasjon RNase cleavage nettsteder
for å presisere RNase kutteseter, ble dsrna nedbrytningsproduktene ut og klonet bruker som kjøpesenter RNA gel utvinning kit og kloning kit fra Takara (Kyoto, Japan).
