Abstract
Mål
I menneskelige prostata kreft celler, en selektiv Epac agonist, 8-CPT-2Me-cAMP, oppregulerer celleproliferasjon og overlevelse via aktivering av Ras-MAPK og PI- 3-kinase-Akt-mTOR signalkaskader. Her undersøker vi betydningen av inflammatoriske mediatorer i Epac1-indusert celleproliferasjon ved å bestemme uttrykket av de pro-inflammatoriske markører p-cPLA2, COX-2, og PGE
2 i prostatakreftceller behandlet med 8-CPT-2Me- cAMP.
Metoder
Vi benyttet hemmere av COX-2, mTORC1, og mTORC2 å sondere sykliske AMP-avhengige veier i menneskelige prostata kreft celler. RNAi målretting Epac1, Raptor, og Rictor ble også benyttet i disse studiene.
Resultater
8-CPT-2Me-cAMP behandling forårsaket en 2-2,5 ganger økning av p-cPLA2
S505, COX-2, og PGE
2-nivåer i humane prostatacancercellelinjer. Forbehandling av celler med COX-2 inhibitor SC-58125, eller EP4 antagonist AH-23848, eller med en inhibitor av mTORC1 og mTORC2, Torin1, reduserte signifikant Epac1 avhengig økning av p-cPLA2 og COX-2, p-S6 -kinase
T389, og p-AKT
S473. I tillegg Epac1-indusert protein og DNA-syntese ble sterkt redusert ved forbehandling av celler med enten COX-2, EP4, eller mTOR-inhibitorer. Transfeksjon av prostata kreft celler med Epac1 dsRNA, Raptor dsRNA, eller Rictor dsRNA dypt redusert Epac1 avhengige økninger i p-cPLA2 og COX-2.
Konklusjon
Vi viser at Epac1, en nedstrøms effektor av cAMP, fungerer som en pro-inflammatorisk modulator i prostatakreftceller og fremmer cellevekst og overlevelse ved oppregulering Ras-MAPK, og PI 3-kinase-Akt-mTOR signal
Citation. Misra Storbritannia, Pizzo SV (2013) Bevis for en Pro-proliferativ Tilbakemelding Loop i Prostate Cancer: The Role of Epac1 og COX-2-avhengige Pathways. PLoS ONE 8 (4): e63150. doi: 10,1371 /journal.pone.0063150
Redaktør: Irina U. Agoulnik, Florida International University, USA
mottatt: 9. januar 2013, Godkjent: 29 mars 2013; Publisert: 30 april 2013
Copyright: © 2013 Misra, Pizzo. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne har ingen finansiering eller støtte til rapporten
Konkurrerende interesser. SVP er en PLoS ONE Editorial styremedlem. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Prostatakreft er den vanligste diagnosen kreft menn [1]. Ulike faktorer fremmer vekst og utviklingen av prostatakreft. Det er et velkjent sammenheng mellom kjøp av androgen-uavhengig vekst og en potensielt større sannsynlighet for metastase [2]. Det er også økende bevis for at betennelsesforandringer i prostatakreft kan fremme vekst [3] – [8]. Omtrent 15-20% av alle kreftdødsfall i verden er knyttet til infeksjon og inflammasjon [9]. Selv om disse dødsfallene kan først og fremst tilskrives disse prosessene, patologiske, molekylær, og epidemiologiske studier støtter hypotesen om at kronisk betennelse er knyttet til kreft progresjon [10]. Den inflammatoriske mikromiljøet av tumorer er kjennetegnet ved nærværet av verts leukocytter både i bære stromaceller og tumorområder [11]. I tillegg inneholder tumormiljøet inflammatoriske mediatorer slik som kjemokiner, cytokiner, reaktive oksygenforbindelser, og prostaglandiner [3] – [8]. Kreftutvikling i nærvær av kronisk inflammasjon involverer syklooksygenase-2 (COX-2), og aktivering av transkripsjonsfaktorer, inkludert flere NFkB, STAT3, aktivator protein-1, og hypoksi induserbar faktor 1α [3] -. [8]
prostaglandiner og leukotriener er viktige modulatorer som medierer krysstale mellom epitelceller og deres omkringliggende stromale celler [3] – [7]. Arakidonsyre (AA) er en viktig bestanddel av animalsk fett, og de biologisk aktive lipider avledet fra dette substratet ha viktige roller i kronisk betennelse og kreft. Ved cellestimulering, er AA løslatt fra membran fosfolipider av p-cPLA2 og deretter konvertert til forskjellige prostaglandiner (PGS) av spesifikke enzymer [6], [12]. COX-2 er den induserbare isoform av det hastighetsbegrensende enzym som omdanner AA til proinflammatoriske prostaglandiner. Blant disse PGE
2 spiller en dominerende rolle i å fremme tumorvekst. PGE
2 hever ekspresjon av proteinet antiapoptotic BCL2 og aktiverer cAMP generasjon [13]. PGE
2 øker Epac uttrykk, Rap1 aktivisering, og Akt fosforylering [14], [15]. Under normale forhold, er lav eller ikke påvist i de fleste vev COX-2 ekspresjon; imidlertid dens overekspresjon sammen med aktivering av cytosolisk PLA2 ved fosforylering er en funksjon av betennelsesreaksjoner [16]. Flere signaloverføringsveier regulere COX-2-gen-ekspresjon inkludert Ras-MAPK, PKA og PKC [17] – [20]. Overekspresjon av COX-2 forekommer i bryst, lunge, kolon, prostata cancer og [3] – [8].
In vitro
, menneskelige prostata kreft linjer PC-3, DU145, og LnCap uttrykke COX-2 [6], [12]. Inhibering av COX-2 bremser proliferasjon og /eller oppregulerer apoptose i begge androgen-uavhengige og avhengige humane prostatacancercellekulturer. Behandling av LNCaP celler med COX-2-hemmer NS398 eller celecoxib induserer apoptose og reduserer uttrykk for BCL2,
in vivo, etter og hemming av COX-2 undertrykker invasivitet av DU-145 og PC-3 celler [12 ]. Behandling av PC-3-tumorbærende mus med NS-398 undertrykker tumorcelleproliferasjon, og induserer tumorregresjon [21]. En ytterligere effekt er at COX-2-hemmere undertrykke oppregulering av VEGF som er viktig for tumor angiogenese [3] – [7], [12]. Betennelse-assosiert histologisk aggressivitet i prostatakreft korrelerer med en økning i PSA-nivå [22]. I kliniske studier av pasienter med prostatakreft, COX-2-hemmere føre til en reduksjon i prostataspesifikt antigen (PSA) nivåer og tumorcelle dobling tid. I tillegg er COX-2-aktivering og økte nivåer av PGE
2 forekommer i tumorpasienter [23] – [26]. PGE
2 handlinger gjennom fire celleoverflatereseptorer kjent som EP1, EP2, EP3 og EP4 [27] -. [31]
PGE
2 reseptorer uttrykt av menneskelige prostata kreft linjene er av EP2 og EP4-undertyper [28]. Binding av PGE
2 til EP2 er koblet til G-proteiner som aktiverer adenylat cyclase fører til en økning i intracellulært cAMP. Dette aktiverer kinaser så som PKA, Epacs, PI 3-kinase, og GSKβ3. PGE
2 øker EP2-reseptor-mRNA, øker cAMP-nivåer, og forbedrer celleproliferasjon. Uttrykk for EP2 og EP4-reseptorer er betydelig økt i løpet av utviklingen av prostatakreft og ektopisk uttrykk av disse reseptorene i LNCaP cellene øker PSA produksjon [32].
mammalian target of rapamycin (mTOR) er en Ser /Thr kinase som integrerer signaler fra eksterne stimuli [33] – [39] regulerer mange prosesser, inkludert celleproliferasjon. mTOR finnes i to forskjellige komplekser, mTOR1 og mTORC2. Flere nyere studier viser at PGE
2 oppregulerer mTORC1 og mTORC2 signalering. For eksempel er PGE
2-mediert endotel celle overlevelse reguleres ved mTORC2 [40]. PGE
2-formidlede kjemotakse og chemokin-frigjøring fra mastceller reguleres ved mTORC2 aktivering og dette reduseres ved forbehandling av celler med det aktive sete mTOR-inhibitor Torin1 [41]. Videre hemning av COX-2 og mTOR vis direkte og indirekte antitumoreffekter i kreftformer, og både celecoxib og rapamycin forårsake betydelig tumorvekstinhibitering [42]. mTORC1 i tillegg til mTOR, inneholder den regulatoriske-assosierte protein av mTOR (Raptor), og en klynge av andre regulerende proteiner [33] – [39]. Raptor regulerer montering av mTORC1, rekruttering av kinase underlag, og subcellulære lokalisering av mTORC1. Akt aktiverer mTORC1 ved direkte fosforylering den TSC1 /TSC2 kompleks og dermed begrenser sin GAP aktivitet og slippe GTP-bundet rheb å aktivere mTORC1 [33] – [39]. Når den er aktivert, phosphorylates mTORC1 to viktigste regulatorer av mRNA oversettelse og ribosomal Genesis, p70 S6-kinase (S6-kinase) og 4EBP1, og dermed stimulere proteinsyntesen [33] – [39]. Den mTORC2 kompleks, i tillegg til mTOR, inneholder Raptor uavhengig følgesvenn av mTOR (Rictor) og andre regulerende proteiner. mTORC1 og mTORC2 fosforylere ulike underlag for å regulere ulike cellulære funksjoner. mTORC1 stimulerer celleproliferasjon ved å øke cap-avhengige oversettelse initiering som formidles av sin to store ned stream mål S6 kinase og 4EBP. mTORC2 er ufølsom for akutt behandling med rapamycin og regulerer mange prosesser, inkludert celle proliferasjon og overlevelse, ved fosforylering kinaser så som Akt, SG-kinase, og PKC [33] – [39]. Tap eller inaktivering av tumor-suppressorer som for eksempel p53, LKB1, PTEN, og TSC1 /2, som motvirker PI 3-kinase-avhengig aktivering av mTORC1, kan fremme tumorigenesis via økt signale [33] – [39]. Økte nivåer og /eller fosforylering av nedstrøms mål for mTORC1 forekommer i ulike menneskelige maligniteter og korrelerer med aggressiv svulst atferd og dårlig prognose [33] – [39]. mTORC2 aktivitet er nødvendig for utvikling av prostata PTEN kreft forårsaket av delesjon [43].
cAMP regulerer en rekke prosesser, inkludert proliferasjon og apoptose gjennom den nedstrøms effektorer inkludert PKA. Effekten av cAMP er idiosynkratisk og kan enten inhiberer eller stimulerer celleproliferasjon i en PKA-avhengig eller PKA-uavhengig måte, [44], [45]. I celler hvor cAMP stimulerer celleproliferasjon i en PKA-uavhengig måte, aktiverer cAMP Rap1 via Epac [45] – [48]. Her effekten av cAMP blir mediert av PI 3-kinase /Akt signalering [45] – [48]. Behandling av prostatacancerceller med den Epac agonisten 8-CPT-2Me-cAMP oppregulerer Epac1 uttrykk, Rap1 aktivering, MAPK-aktivering, Akt fosforylering på T308 og S473 i en PI 3-kinase-avhengige og mTORC1 og mTORC2 aktivering som bedømt ved fosforylering av S6 -kinase på T389, 4EBP1 på T37 /36 og Akt på S473 rester henholdsvis [47],. Dempe Epac1 uttrykk av RNAi eller forbehandling med PI 3-kinase eller mTOR-hemmere undertrykker 8-CPT-2Me-cAMP-indusert oppregulering av Epac1 aktivering av MAPK, mTORC1, og mTORC2 signalering, og til slutt DNA og proteinsyntese [47], [48 ]. Epac par cAMP-produksjon for å Rap1 og PI 3-kinase-aktivering. Rap1, som ofte er forhøyet i høyt metastatisk prostatakreft-cellelinjer, regulerer signaler som er involvert i cellevekst, overlevelse, og metastase [49]. Epac1 er oppregulert etter betennelse og spiller en avgjørende rolle i aktivering av PKC-avhengige PGE
2 signalering via aktivering av Rap1 [50].
Som vurdert ovenfor, fremmer kronisk betennelse startfasen, spredning, og metastase ved oppregulering av COX-2-PGE
2-cAMP signalkaskade. 8-CPT-2Me-cAMP, en bestemt analog cAMP, binder seg til Epac1, men ikke PKA. I prostata kreft celler, fører dette analoge oppregulering av Epac1, Rap1GTP, proteinsyntese, syntese DNA, og MAPK, og PI 3-kinase-Akt-mTORC1-mTORC2 signalering. Som en konsekvens, blir protein og DNA-syntese stimuleres. Disse effektene er nedregulert ved forbehandling av cellene med hemmere av MAPK, PI 3-kinase, mTORC1, eller RNAis som er rettet mot Epac1, Raptor, eller Rictor [47], [48]. Her ser vi en hypotese om at Epac1 fungerer som en inflammatorisk megler i prostata kreft ved å fremme cellevekst og overlevelse. Vi undersøkte regulering av pro-inflammatoriske markører p-cPLA2, COX-2, og PGE
2 i tre menneskelige prostata kreft cellelinjer som ble behandlet med 8-CPT-2Me-cAMP. Forbehandling av cellene med COX-2-hemmere, en mTORC1 og mTORC2 hemmer eller transfeksjon av celler med Epac1 dsRNA, Raptor dsRNA, eller Rictor dsRNA nedregulert 8-CPT-2Me-cAMP induksjon av p-cPLA2, og COX-2. Kreft celleproliferasjon ble også undertrykt. Dermed mens PGE
2 regulerer cAMP produksjon og Epac-aktivering, Epac aktivering fører også COX-2-avhengige PGE
2 produksjon. Resultatet er en autokrin lignende syklisk prosess kjører prostatakreft cellevekst gjennom oppregulering av Ras-MAPK og PI 3-kinase-Akt-mTOR signalering.
Materialer og Metoder
Material
Dyrkingsmedier medier~~POS=HEADCOMP ble kjøpt fra Invitrogen. 8-CPT-2Me-cAMP ble kjøpt fra Axxora LLC (San Diego, California). Antistoffer mot mTOR, p-Akt
S473, akt1, S6-kinase, p-S6-kinase
T389, p-cPLA2
Ser505 og cPLA2 ble kjøpt fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Antistoffer mot Epac1, COX-2, Raptor, Rictor, EP2 og EP4 ble kjøpt fra Santa Cruz Bioteknologi (Santa Cruz, California). Anti-actin-antistoffer ble oppnådd fra Sigma (St. Louis, MO). [
3H] thymidin (spesifikk aktivitet 174 Ci /mmol og [
3H] leucin (spesifikk aktivitet 115,4 Ci /mmol) ble erholdt fra Perkin-Elmer Life Sciences. Alle andre materialer var av analytisk kvalitet og ble anskaffet lokalt. COX-2-hemmer SC-58125 eller EP4 antagonist AH23848 ble kjøpt fra Caymon (Ann Arbor, Michigan) og Torin1 ble kjøpt fra Tocris biovitenskap (Minneapolis, MN).
menneske~~POS=TRUNC
i denne studien anvendte vi tre humane prostatacancercellelinjer, 1-LN, DU145, og PC-3. Som tidligere beskrevet [51], den svært metastatiske 1-LN prostatacancer-cellelinjen ble avledet på denne institusjon fra en metastase av de mindre metastatiske PC-3 celler i nakne mus og var en slags gave av Dr. Philip Walther (Duke University Medical Center, Durham, NC). Disse cellene er tilgjengelig på forespørsel. DU-145 og PC-3 celler ble kjøpt fra ATCC. De ble dyrket i 6, 12, eller 48-brønners plater i RPMI 1640 medium supplementert med 10% FBS, 2 mM glutamin, 12,5 enheter /ml penicillin, 6,5 ug /ml streptomycin og 10 nM insulin (RPMI-S ) i en fuktet CO
2 inkubator ved 37 ° C. Etter å ha nådd 90% konfluens, ble mediet aspirert og et friskt volum av RPMI-S-medium tilsatt, og cellene ble anvendt for eksperimentene som er beskrevet nedenfor.
Kvalitativ PCR for COX-2, EP2, og EP4 i prostata kreftceller stimulert med 8-CPT-2Me-cAMP
1-LN, PC-3, og DU145 prostata kreft celler ble dyrket som ovenfor. Etter å ha nådd 90% sammenflyting ble cellene vasket to ganger med Hanks «balanserte saltløsning inneholdende 10 mM HEPES, pH 7,4, og 3,5 mM NaHCO
3 (HHBSS). Et volum av friskt RPMI-S-medium ble deretter tilsatt, og cellene ble inkubert i 5 minutter for temperaturlikevekt. Cellene ble utsatt for enten buffer eller 8-CPT-2Me-cAMP (100 pM) i 30 minutter og inkubert som ovenfor. Reaksjonen ble avsluttet ved aspirering av mediet. Total RNA fra cellene ble ekstrahert ved hjelp RNeasy Minikits (Qiagen, Valentia, CA) i henhold til produsentens instruksjoner. RNA ble kvantifisert ved absorbans ved 260 nM. Totalt RNA ble reverstranskribert med 1 ug av RNA i en 20 pl reaksjon, ved hjelp av Moloney murin leukemivirus revers transkriptase (200 enheter) og oligo (dT) som primer i 1 time ved 40 ° C. Det resulterende cDNA (5 ug) ble anvendt som et templat, og en 225-bp-segmentet av cDNA av COX-2, ble EP2 og EP4 amplifisert ved hjelp av en 20-mer oppstrøms primere for (1) COX-2-fremover; (5′-TGG TCT GGT GCC TGG TCT G -3 «) og en COX-2-revers (5’AGT ATT AGC CTG CTT GTC TGG AAC -3»); (2) EP2-forward: (5’TTC ATC CGG CAC GGG CGG ACC GC -3 «) og EP2-revers (5’CCT CCT GAG AAA GAC AGT GCT -3»); og (3) EP4-forward: (5’CCT CCT GAG AAA GAC AGT GCT -3 «) og EP4-revers (5’AAG ACA CTC TCT GAG TCCT -3). En 302-bp-segmentet av mus β-aktin (konstitutiv internkontroll) cDNA ble ko-amplifisert ved hjelp av et sett av primere som er gitt i en R (2) 8-CPT-2Me-cAMP (100 mikrometer /16 h); (3) (AH23848 1 uM /3 t); (4) AH23848 1fiM /3 h) da 8 CPT-2Me-cAMP; (5) SC58125 (1 uM /3 t); (6) SC58125 1fiM /3 h) da 8-CPT-2Me-cAMP; (7) Torin1 (250 nM /3 t); eller (8) Torin1 (250 nM /3 h) da 8-CPT-2Me-cAMP. [
3H] leucin (2 pCi /ml) ble deretter tilsatt og cellene ble inkubert over natten som beskrevet ovenfor. Reaksjonene ble avsluttet ved aspirering av mediet og monolagene ble vasket to ganger med is-kald 5% TCA og cellene vasket tre ganger med iskald PBS. Celler ble lysert i et volum på 1 N NaOH (40 ° C, 2 h), proteinkonsentrasjonen ble bestemt, og lysatene ble tellet i en væske-scintillasjonsteller [47], [48].
Måling av DNA-syntese i 1-LN-celler stimulert med 8-CPT-cAMP 2Me-
prostatacancerceller (3 x 10
3 celler /brønn i 48 brønners plater) ble dyrket i RPMI-S) i en fuktet CO
2 (5%) inkubator ved 37 ° C. Ved 90% konfluens, ble mediet aspirert og et volum av RPMI-S ble tilsatt, etterfulgt av tilsetning av forbindelser som beskrevet ovenfor. [
3H] tymidin (2 pCi /ml) ble deretter tilsatt og cellene ble inkubert over natten. Reaksjonene ble avsluttet ved å aspirere mediet og cellemonolagene ble vasket to ganger med is-kald 5% TCA etterfulgt av tre vaskinger med iskald PBS. Celler ble lysert i et volum på 1 N NaOH (40 ° C /2 timer), ble proteinkonsentrasjonen ble bestemt, og lysatene ble tellet i en væske-scintillasjonsteller [47], [48].
Måling av COX -2 eller mTOR-hemmer effekter på åtte-CPT-2Me-cAMP indusert-oppregulering av p-CPLA
2, og COX-2
prostata kreft celler (3 x 10
6 celler /6 brønners plater) inkubert over natten i RPMI-S-medium ble vasket to ganger med kald HHBSS og et volum av RPMI-S-medium ble tilsatt til hver brønn. Celler i de respektive brønnene ble behandlet som beskrevet ovenfor. Reaksjoner ble stoppet ved å aspirere mediet og et volum av lyseringsbuffer ble tilsatt på is i 20 min. Cellelysatene ble skrapt inn i Eppendorf-rør og sentrifugert i 5 minutter ved 800 x g ved 4 ° C, og proteininnholdet i lysatene ble bestemt. Prøvene ble deretter studert som beskrevet ovenfor.
Måling av COX-2 og mTOR-hemmer effekter på åtte-CPT-2Me-cAMP-indusert-oppregulering av p-S6-kinase
T389 i Raptor immunutfelninger av prostata kreft celler
Fosforylering av S6-kinase på T389 er ansett som et mål på mTORC1 aktivering. Prostatakreftceller (3 x 10
6 celler /brønn på 6-brønners plater) inkubert over natten i RPMI-S-medium ble vasket to ganger med kald HHBSS og et volum av RPMI-S-medium ble tilsatt til hver brønn. Celler i respektive brønner ble behandlet som beskrevet ovenfor. Reaksjoner ble stoppet ved å aspirere mediet og tilsetning av et volum av CHAPS lyseringsbuffer inneholdende 40 mM HEPES (pH 7,5), 120 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10 mM natriumpyrofosfat, 10 mM β-glycerofosfat, 0,5 mM natriumortovanadat, 0,3 % CHAPS og Roche Proteasehemmer cocktail (1 tablett /10 ml). Cellene ble lysert på is i 20 min. Cellelysatene ble skrapt til nye Eppendorf-rør og sentrifugert i 5 minutter ved 800 x g ved 4 ° C og deretter proteininnholdet i lysatene ble bestemt. Like mengder lysat protein (200-250 mikrogram) ble immunopresipitert med Raptor antistoffer (1:50) Santa Cruz Cat no. sc 81 537), etterfulgt av tilsetning av 40 ul protein A-agarose. Blandingene ble inkubert over natten med rotasjon ved 4 ° C. Raptor immunopresipitater ble utvunnet ved sentrifugering (2000 opm /5 min /4 ° C) og vasket to ganger med kald CHAPS lyseringsbuffer. Et volum på 4 x prøvebuffer ble tilsatt til prøvene som så ble kokt i 5 minutter, sentrifugert elektroforese (10% akrylamid gel), overført til Hybond-P-membran. Membranene ble immunoblottet med antistoffer mot p-S6-kinase
T389. Proteinbåndene ble oppdaget av ECF og kvantifisert i en Storm
860 Phosphorimager [47], [48].
Måling av mTORC2 aktivering av fosforylering av Akt
S473 i Rictor immunutfelninger kreftceller stimulert med 8-CPT-2Me-cAMP
Fosforylering av Akt på S473 etter Rictor anses som et mål på mTORC2 aktivitet. Prostatakreftceller (3 x 10
6 celler /brønn på 6-brønners plater) inkubert over natten i RPMI-S-medium ble vasket to ganger med kald HHBSS, og et volum av RPMI-S-medium ble tilsatt til hver brønn. Vi undersøkte effekten av COX-2-hemmere og mTOR hemmer Torin1 på fosforylering av Akt
S473 i Rictor immunutfelninger av 1-LN celler under de forholdene som er beskrevet ovenfor. Reaksjonene ble avsluttet ved aspirering av mediet og tilsetning av et volum av CHAPS lyseringsbuffer (buffer B). Cellene ble lysert på is i 15 min. Like mengder av lysat protein (200-250 ug) ble immunoutfelt med anti-Rictor antistoffer (1:50, Santa Cruz, CA, CA # 81538) ved tilsetning av 40 ul protein A agarose slam. Innholdet ble inkubert med rotasjon over natten ved 4 ° C. Rictor immunopresipitater ble vasket med (1) lysebuffer B supplementert med 0,5 M NaCl; (2) lysebuffer B; og (3) Tris • HCl (pH 7,4) supplementert med 1 mM DTT, 1 mM PMSF og 1 mM benzamidin ved sentrifugering ved 2500 RPM i 5 minutter ved 4 ° C. Til Rictor immunopresipitater et volum på 4 x prøvebuffer ble tilsatt, og prøvene kokt i 5 min. Etter sentrifugering ble supernatanten underkastet elektroforese på polyakrylamidgeler 10% geler, proteiner overført til PVDF-membran og immunoblottet med antistoffer mot p-AKT
S473. Proteinbånd ble visualisert og kvantifisert ved ECF og Phosphorimaging. De respektive membraner ble reprobed for Akt som lasting kontroll [47], [48].
Effektene av Epac1 genet Slå på COX-2 uttrykk i kreftceller stimulert med 8-CPT-2Me-cAMP
for å finne ut hvilken rolle Epac1 i aktivering av mTORC2 i prostata kreft celler behandlet med 8-CPT-2Me-cAMP, ble uttrykket av Epac1 brakt til taushet av RNAi [47], [48]. Den kjemiske syntese av dsRNA som er homolog til målet Epac1 peptidsekvensen s204VAHLSN209 mRNA sekvensen 5′-TGT GGC CCA CCT CTC CAA CTC -3 «(Swiss Prot Epac1 primære sjonsnummer 0953958) ble utført ved Ambion (Austin, TX). dsRNAs ble utarbeidet av gløde forstand 5’UGG CCC ACC UCU CCA ACU CU-3 «og antisense 5’GAG UUG GAG AGG UGG GCA ACA -3» og glødet dsrna trådene ble renset ved en Ambion kit. Dempe Epac1 genuttrykk før stimulering med 8-CPT-2Me-cAMP ble gjennomført ved transfeksjon av kreftceller med 100 nM (48 h) Epac1 dsRNA som beskrevet tidligere [47], [48]. Kontrollceller ble transfektert med en ekvimolar konsentrasjon av egge RNA (Ambion Katalognummer 4610) som ovenfor. Størrelsen av Epac1 stanse i transfekterte celler, som målt ved Epac1 mRNA og Epac1 proteinnivåer, varierte mellom 60-65% [47], [48]. Cellene i 6 brønners plater ble behandlet som følger: (1) lipofektamin + buffer; (2) lipofektamin + 8-CPT-2Me-cAMP (100 mikrometer /30 min); (3) Epac1 dsRNA (100 nM /48 h) + 8-CPT-2Me-cAMP (100 mikrometer /30 min); eller (4) kryptert dsRNA (100 nM /48 h) + 8-CPT-2Me-cAMP (100 pM /30 min) og inkubert som beskrevet ovenfor. Reaksjonene ble avsluttet ved aspirering av mediet, et volum av CHAPS lysis buffer B ble tilsatt, cellene ble deretter lysert på is i 15 min, overført til Eppendorf-rør, sentrifugert (1000 rpm /5 min /4 ° C), og den supernatanter overført til nye rør og proteinkonsentrasjonen bestemt. Prøvene ble behandlet som beskrevet ovenfor.
Måling av effekten av å kneble Raptor eller Rictor RNAi stanse på uttrykk for p-cPLA2 og COX-2 i prostatakreftceller behandlet med 8-CPT-2Me-cAMP
Transfeksjon av prostata kreft celler med Raptor dsRNA eller Rictor dsRNA ble utført som beskrevet nedenfor. For ytterligere å undersøke involveringen av mTORC1 i 8-CPT-2Me-cAMP indusert oppregulering av S6-kinase, stilnet vi ekspresjon av Raptor genet ved RNAi, noe som forstyrrer montering av mTORC1 komplekse og undertrykke fosforylering av dets nedstrøms mål S6-kinase . Herdet RNAi av Raptor ble kjøpt fra Sigma og består av den forstand følgende (5′-3 «) UCU GCA AAG AUU Ugu UGA GDT (ID # SAS1-16Hs01-00048387-AS). Cellene ble transfektert med 100 nM glødet Raptor dsRNA og kontrollceller ble transfektert med lipofektamin som tidligere beskrevet [47], [48]. Førtiåtte timer etter transfeksjon, ble kontrollcellene stimulert med enten buffer, eller 8-CPT-2Me-cAMP (100 pM /30 min /37 ° C). Celler for den negative kontrollen ble transfektert med egge dsRNA (100 nM /48 h, Ambion) og deretter stimulert med enten buffer eller 8-CPT-2Me-cAMP. Reaksjonene ble avsluttet ved aspirering av mediet, og cellene ble lysert i et volum av buffer B, som beskrevet ovenfor. Til like mengder av lysat protein, et volum på 4 x prøvebuffer tilsatt, prøvene kokt i 5 min, sentrifugert og underkastet elektroforese på 10% polyakrylamidgel. Proteiner ble overført til PVDF membraner og respektive immunoblottet med anti-COX-2 og p-cPLA2 antistoffer. Proteinbånd ble visualisert og kvantifisert ved ECF og phosphorimaging som beskrevet ovenfor. Prøvene ble behandlet og undersøkt som beskrevet ovenfor.
For å bekrefte at 8-CPT-2Me-cAMP-indusert aktivering av mTORC2 er involvert i oppregulering av cPLA2 og COX-2 vi forstummet Rictor genekspresjon av RNAi, som forstyrrer montering av mTORC2 komplekser og dermed undertrykke mTORC2 aktivering. SiRNA probe ble kjøpt fra Ambion (liten interfering RNA ID S226002) av den forstand sekvensen (5’GGG UUA Guu UAC AAU CAG C -3 «) og antisense (5’GCU GAU Ugu AAA CUA ACC -3). Cellene ble transfektert med 100 nM av glødet Rictor dsrna og kontrollceller ble transfektert med lipofektamin som tidligere beskrevet [47], [48]. Førtiåtte timer etter transfeksjon, ble kontrollcellene stimulert med enten buffer eller 8-CPT-2Me-cAMP (100 pM /30 min /37 ° C). Celler for de negative kontrollene ble transfektert med egge dsRNA (100 nM /48 h, ambion) og deretter stimulert med enten buffer eller 8-CPT-2Me-cAMP som ovenfor. Reaksjonene ble avsluttet ved aspirering av mediet. Cellene ble lysert over is i 20 min i CHAPS lyseringsbuffer. Lysatene ble overført til Eppendorf-rør, sentrifugert ved 800 rpm i 5 min ved 4 ° C, og proteininnholdet i supernatantene ble bestemt. Til like mengder av lysat protein, et volum på 4x prøvebuffer tilsatt, og prøvene ble kokt i 5 minutter, sentrifugert og underkastet elektroforese på 10% polyacrylalmide gel. Proteiner ble overført på PVDF-membraner og de respektive membraner immunoblottet med anti-p-cPLA2 eller COX-2-antistoffer. Proteinbånd ble visualisert og kvantifisert ved ECF og Phosphorimaging.
Resultater
oppregulering av de inflammatoriske markører p-cPLA2, COX-2, PGE
2, EP, og EP4 i prostatakreft celler stimulert med 8-CPT-2Me-cAMP
Vi har evaluert første pro-inflammatorisk miljø i tre androgen-uavhengig menneskelige prostata kreft linjer, nemlig en-LN, DU-145, og PC-3, ved kvantifisere p-cPLA2
Ser505, COX-2, EP2, EP4 og PGE
2 i disse cellene stimulert med enten buffer eller 8-CPT-2Me-cAMP (figur 1). Behandling av prostata kreft celler med 8-CPT-2Me-cAMP forårsaket en 2-2,5 ganger økning i uttrykket av p-cPLA2
Ser505 sammenlignet med kontroller (figur 1). En plausibel mekanisme som Epac1 kan aktivere cPLA2 er ved å heve intracellulært kalsium og aktivering MAPKs. Epac1 regulering av Ca
2+ frigjøring fra det endoplasmatiske retikulum er tidligere blitt rapportert [52]. Epac1 øker intracellulær Ca
2+ av PLCγ-mediert hydrolyse av PIP2 generere IP3 som løfter intracellulær Ca
2 + [53]. Alle tre prostatakreft linjer stimulert med buffer viste ubetydelig eller svært lave nivåer av COX-2 mRNA og protein sammenlignet med 8-CPT-2me-camp-stimulerte celler som viste en 2-3 ganger økning i COX-2 mRNA og protein ( Figur 1A og B). I likhet med COX-2, behandling av prostata kreft celler med 8-CPT-2Me-cAMP forårsaket en 2-3 ganger økning i intracellulær PGE
2 syntese sammenlignet med kontroller (figur 1C).
