Abstract
CC kjemokinreseptor 7 (CCR7) bidrar til overlevelsen av visse kreftcelle linjer, men dens rolle i spredning av humane ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) celler er fortsatt uklar. Proliferasjonsanalyser utført på A549 og H460 NSCLC-celler ved hjelp av Celletelling leder-8 indikerte at aktivering av CCR7 av dens spesifikke ligand, eksogene chemokine ligand 21 (CCL21), var assosiert med en signifikant lineær økning i celleproliferasjon med varigheten av eksponeringen for CCL21. Den CCL21 /CCR7 interaksjonen økt betydelig brøkdel av celler i G
2 /M-fasen av cellesyklusen som målt ved flow-cytometri. I kontrast, CCL21 /CCR7 hadde ingen signifikant innvirkning på G
0 /G
1 og S faser. Western blot og real-time PCR indikerte at CCL21 /CCR7 signifikant oppregulert ekspresjon av cyklin A, cyklin B1, og cyklin-avhengig kinase 1 (CDK1), som er relatert til G
2 /M-fase overgang. Ekspresjonen av cyclin D1 og cyclin E, som er relatert til G
0 /G
1 og G
1 /S-overganger, ble ikke endret. Den CCL21 /CCR7 interaksjonen betydelig forbedret fosforylering av ekstracellulære signalregulerte kinase (P-ERK), men ikke Akt, som målt ved Western blot. LY294002, en selektiv inhibitor av PI3K som hindrer aktivering av nedstrøms Akt, ikke svekke effekten av CCL21 /CCR7 på P-ERK. Coimmunoprecipitation ytterligere bekreftet at det var en interaksjon mellom P-ERK og cyklin A, cyklin B1, eller CDK1, spesielt i nærvær av CCL21. CCR7 liten interfererende RNA eller PD98059, en selektiv inhibitor av MEK som forstyrrer aktiveringen av nedstrøms ERK, avskaffet vesentlig virkningene av eksogent CCL21. Disse resultatene tyder på at CCL21 /CCR7 bidrar til den tidsavhengige proliferasjon av humane NSCLC-celler ved oppregulering cyklin A, cyklin B1, og CDK1 potensielt via ERK-reaksjonsveien
relasjon:. Xu Y, Liu L, Qiu X Jiang L, Huang B, Li H, et al. (2011) CCL21 /CCR7 Fremmer G
2 /M fase Progresjon via ERK Pathway i Human ikke-småcellet lungekreft celler. PLoS ONE seks (6): e21119. doi: 10,1371 /journal.pone.0021119
Redaktør: Lin Zhang, University of Pennsylvania, USA
mottatt: 7 mai 2011; Godkjent: 19 mai 2011; Publisert: 16 juni 2011
Copyright: © 2011 Xu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra National Natural Science Foundation of China (nr 30972967) og forskningsfond for doktorgradsstudiet for Higher Education of China (No. 20092104110018). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
CC kjemokinreseptor 7 (CCR7) uttrykkes på alle naive T-celler og på enkelte minne T-celler, B-celler og modne dendrittiske celler [1]. Ved interaksjon med dets ligander, chemokine ligand 19 (CCL19) eller kjemokin ligand 21 (CCL21) [2], bidrar til CCR7 lymfocytt handel og homing til lymfeknuter i løpet av immun- og inflammatoriske reaksjoner [3] – [5]. CCR7 er sterkt uttrykt i ikke-småcellet lungekreft (NSCLC), brystkreft, og plateepitelkarsinom i hode og hals, og er ansvarlig for formidling metastaser i visse kreftcellelinjer [6] – [15]. Til dags dato har rollen CCR7 i proliferasjonen av humane NSCLC cellene ikke er klarlagt.
Aktivering av CCR7 kan øke fosforylering av ekstracellulære signalregulerte kinase (P-ERK) eller Akt (P-Akt) via Gi-proteiner for å forbedre celleproliferasjon eller overlevelse [16] – [20]. ERK tilhører mitogen-aktivert proteinkinase (MAPK) familien, som også inneholder c-Jun N-terminal kinase (JNK) og p38. ERK-kaskade, aktivert av mitogene stimuli, er kritisk for proliferasjon og overlevelse [21], [22] og er nødvendig for normal progresjon inn i mitose [23], [24]. JNK og p38-veier er aktivert i respons til kjemikalier og miljøstress [25] – [27]. Akt (også kjent som akt1), en formidler av vekstfaktor-indusert celleoverlevelse [28] -. [30], kan fremme celleproliferasjon via fosforylering [31]
Hensikten med denne studien var å undersøke effekt og reguleringsmekanisme av CCL21 /CCR7 interaksjon på spredning av A549 og NCI-H460 (H460) humane NSCLC celler. Her, demonstrerte vi at CCL21 /CCR7 bidro til den tidsavhengige proliferasjon av humane NSCLC-celler ved oppregulering av ekspresjon av cyklin A, cyklin B1, og CDK1 via ERK-reaksjonsveien. Informasjon fått fra denne studien gir innsikt i mekanismene for overlevelse av CCR7-mediert kreftceller og har implikasjoner for behandling mål i NSCLC.
Resultater
CCL21 /CCR7 fremmer spredning av A549 og H460 celler . I en tidligere studie identifiserte vi en høyere CCR7 uttrykk nivået i A549 og H460 human NSCLC cellelinjer sammenlignet med andre cellelinjer [32]. For å undersøke rollen til CCR7 i funksjon av A549 og H460-celler, ble CCR7 aktiveringen og inhiberingen indusert med eksogen CCL21 og med CCR7 liten interfererende RNA (siRNA), respektivt. Etter transfeksjon med CCR7 siRNA (siCCR7) eller kontroll siRNA ble uttrykk for CCR7 evaluert ved hjelp av Western blot og revers transkriptase (RT) -PCR. Vi fant at siCCR7 signifikant nedregulert protein- og mRNA-nivåer av CCR7, sammenlignet med kontroll siRNA (figur 1).
A549 (A) og H460 (B) celler ble transfektert med kontroll siRNA eller CCR7 siRNA (siCCR7) . Etter transfeksjon, ekspresjon av CCR7 protein (a) og mRNA (b) ble evaluert ved anvendelse av Western blot (a) og RT-PCR (b) og sammenlignet med ikke-transfekterte A549 eller H460-celler. Hver søyle representerer middelverdi ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. * P. 0,05, sammenlignet med kontrollceller
For å bestemme effekten av CCL21 /CCR7 på celleproliferasjon, CCK-8-analysen ble utført på A549 og H460 celler. I henhold til de publiserte data [33], [34] og resultatene av våre innledende forsøk, ved 100 ng /ml konsentrasjoner CCL21 betydelig fremmet celleproliferasjon, sammenlignet med 50 ng /ml konsentrasjoner, mens det var ingen signifikant forskjell mellom 100 ng /ml og 200 ng /ml konsentrasjoner (Figur 2). Derfor, ved 100 ng /ml konsentrasjoner CCL21 ble anvendt i følgende forsøk. Den CCL21 /CCR7 samhandling betydelig forfremmet celleproliferasjon, mens siCCR7 betydelig avskaffet handlingen av CCL21 (figur 3). siCCR7 alene hadde ingen signifikant effekt på celleproliferasjon sammenlignet med kontrollceller. Det ble ikke observert signifikante forskjeller mellom alle tidspunkt undersøkt (alle p 0,01), noe som indikerer en lineær økning i spredning med økende eksponeringstider til CCL21 (alle p 0,01).
A549 (A) og H460 (B) cellene ble behandlet med CCL21 (50, 100 eller 200 ng /ml) i 24, 48 eller 72 timer, og celle vitalitet ble beregnet ved bruk av CCK-8-analyse. Hver søyle representerer middelverdi ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. ** P. 0,01, sammenlignet med celler behandlet med CCL21 (50 ng /mL)
A549 (A) og H460 (B) celler ble behandlet med CCL21 (100 ng /ml) i 24 , 48, eller 72 timer, og celle vitalitet ble beregnet ved bruk av CCK-8-analyse. Hver søyle representerer middelverdi ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. ** P. 0,01, sammenlignet med kontrollceller
CCL21 /CCR7 forsterker andelen av celler i G
2 /M. For å verifisere hvorvidt virkningen av CCL21 /CCR7 på proliferasjonen av A549 og H460-celler er assosiert med en forandring i cellesyklusfordeling, ble cellesyklusanalyse utført ved hjelp av flow cytometri. Den CCL21 /CCR7 interaksjonen betydelig forbedret andelen av celler i G
2 /M-fase, mens det var ingen signifikant effekt av denne interaksjonen på den andel av celler i G
0 /G
en eller S-fasen, sammenlignet med kontrollceller (tabell 1). siCCR7 avskaffet betydelig denne effekten av CCL21, mens siCCR7 alene hadde ingen signifikant effekt på cellesyklus distribusjon.
CCL21 /CCR7 oppregulerer uttrykk for cyclin A, cyclin B1, og CDK1. For å bestemme den mulige mekanismen som CCL21 /CCR7 påvirker G
2 /M-fase distribusjon i A549 og H460-celler, ekspresjonen av cykliner og cyklin-avhengig kinase 1 (CDK1) ble vurdert ved hjelp av Western blot og real-time PCR . Sammenlignet med kontroll-celler, CCL21 /CCR7 interaksjonen signifikant oppregulert protein og mRNA-nivåer av cyklin A, cyklin B1, og CDK1, som er relatert til G
2 /M progresjon fase (figur 4). siCCR7 avskaffet betydelig virkningene av CCL21, mens siCCR7 alene hadde ingen signifikant effekt på cyclin eller CDK1 uttrykk. CCL21 hadde ingen signifikant effekt på nivåene av cyclin D1 eller cyclin E, som er relatert til G
0 /G
1 og G
1 /S overgang.
A549 (A ) og H460 (B) celler ble behandlet med CCL21 (100 ng /ml) i 24 timer, og proteinet (a) og mRNA (b) nivåer av sykliner A, B1, D1, og E og av CDK1 ble estimert ved hjelp av Western blot (a) og real-time PCR (b). Hver søyle representerer middelverdi ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. * P 0,05 eller ** p. 0,01, sammenlignet med kontrollceller
CCL21 /CCR7 oppregulerer ekspresjon av P-ERK men ikke P-Akt. Andre har rapportert at CCR7 kan øke fosforylering av ERK, JNK, eller Akt, som er relatert til celleoverlevelse [16] – [20], [33], [35] – [42]. For å kontrollere om CCL21 /CCR7 interaksjonen kan også forsterke uttrykket av MAPK familiemedlemmer og Akt i A549 og H460 celler, ble uttrykket av disse komponentene vurdert ved hjelp av Western blot. Den CCL21 /CCR7 samhandling betydelig oppregulert uttrykket av P-ERK på 24 timer og 48 timer, mens det var ingen signifikant innvirkning på uttrykk for ERK (figur 5). CCL21 /CCR7 hadde ingen betydelig innflytelse på uttrykk eller fosforylering av JNK, p38, eller Akt. Fordi Akt er muligens oppstrøms for ERK [43], A549 og H460-celler ble behandlet med CCL21 i 24 timer etter en 1-timers eksponering for LY294002, en selektiv inhibitor av PI3K som hemmer aktivering av nedstrøms Akt pathway. Etter denne behandling CCL21 /CCR7 fremdeles signifikant oppregulert ekspresjonen av P-ERK (figur 6).
A549 (A) og H460 (B) celler ble behandlet med CCL21 (100 ng /ml) i 12, 24 eller 48 timer, og normale og fosforylerte (P-) ekspresjonsnivåer ble anslått ved Western blot. Hver søyle representerer middelverdi ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. * P 0,05 og ** p. 0,01, sammenlignet med kontrollceller
A549 (A) og H460 (B) celler ble behandlet med CCL21 (100 ng /ml) i 24 timer etter LY294002 , en selektiv inhibitor av PI3K som dermed hindrer aktivering av nedstrøms Akt, ble påført i 1 time. Ekspresjon av P-ERK ble beregnet ved hjelp av Western blot. Hver søyle representerer middelverdi ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. ** P. 0,01, sammenlignet med kontrollceller
hemming av P-ERK opphever impellent virkningene av CCL21 /CCR7 på spredning og G
2 /M fase progresjon. For å verifisere om PD98059, en selektiv hemmer av MEK som forstyrrer aktivering av nedstrøms ERK, kan avskaffe effekten av CCL21 /CCR7 på spredning og G
2 /M fase utviklingen av A549 og H460 celler, celle levedyktighet og cellesyklus distribusjon analyser ble utført ved bruk av CCK-8 og strømningscytometri, respektivt. PD98059 avskaffet vesentlig virkningene av CCL21 /CCR7 på celleproliferasjon og G
2 /M progresjon fase (figur 7 og tabell 2, respektivt). PD98059 også avskaffet påvirkning av CCL21 /CCR7 på ekspresjon av P-ERK, cyklin A, cyklin B1, og CDK1 (figur 8). I tillegg PD98059 alene hadde en signifikant inhibitorisk virkning på celleformering, G
2 /M fase progresjon og ekspresjon av P-ERK, cyklin A, og cyklin B1 (figur 7, tabell 2, og figur 8, henholdsvis).
A549 (A) og H460 (B) celler ble behandlet med CCL21 (100 ng /ml) i 24, 48 eller 72 timer etter PD98059, en selektiv inhibitor av MEK som forstyrrer aktiveringen av nedstrøms ERK, ble påført i 1 time. Cell vitalitet ble beregnet ved hjelp av CCK-8 analysen. Hver søyle representerer middelverdi ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. * P 0,05 og ** p. 0,01, sammenlignet med kontrollceller
A549 (A) og H460 (B) celler ble behandlet med CCL21 (100 ng /ml) i 24 timer etter PD98059 , en selektiv inhibitor av MEK som forstyrrer aktiveringen av nedstrøms ERK, ble applisert i 1 time. Uttrykket nivåer av disse komponentene ble beregnet ved hjelp av Western blot. Hver søyle representerer middelverdi ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. * P 0,05 eller ** p. 0,01, sammenlignet med kontrollceller
P-ERK, indusert av CCL21 /CCR7, samhandler med cyclin A, cyclin B1, og CDK1. For ytterligere å identifisere om det er en interaksjon mellom P-ERK og cyclin A, cyclin B1, eller CDK1, coimmunoprecipitation ble utført. A549 og H460-celler i fravær eller nærvær av CCL21 i 24 timer ble underkastet immunoutfelling med antistoffer mot P-ERK eller IgG, fulgt av Western blotting for cyklin A, cyklin B1, og CDK1. Det ble observert en markert, spesifikk interaksjon mellom P-ERK og cyklin A, cyklin B1, eller CDK1, spesielt når cellene ble behandlet med CCL21 i 24 timer (figur 9a). Gjensidig immunoutfelling med antistoffer mot cyklin A, cyklin B1, CDK1, eller IgG ble bestemt ved Western-blotting for P-ERK, og igjen, samspillet mellom P-ERK og cyklin A, cyklin B1, eller CDK1 var fremtredende, spesielt i nærvær av CCL21 (figur 9b). A549 og H460-celler i fravær eller nærvær av PD98059 i 1 time og ble underkastet immunoutfelling med antistoffer mot P-ERK eller IgG, fulgt av Western blotting for cyklin A, cyklin B1, og CDK1. Samspillet mellom P-ERK og cyklin A, cyklin B1, eller CDK1 ble svekket som følge av PD98059 eksponering (figur 9c).
A549 (A) og H460 (B) celler i fravær eller nærvær av CCL21 (100 ng /ml) i 24 timer ble underkastet immunoutfelling med antistoffer mot P-ERK eller IgG, fulgt av Western blotting for cyklin A, cyklin B1, og CDK1 (a). Gjensidig immunoutfelling med antistoffer mot cyklin A, cyklin B1, CDK1, eller IgG ble analysert ved Western blotting for P-ERK (b). A549 og H460-celler i fravær eller nærvær av PD98059 i 1 time og ble underkastet immunoutfelling med P-ERK eller IgG-antistoffer, etterfulgt av Western blotting for cyklin A, cyklin B1, og CDK1 (c).
diskusjon
Flere studier har dokumentert at aktiveringen av CCR7 er ansvarlig for formidling overlevelsen av visse kreftcellelinjer ved å fremme migrasjon og spredning eller ved å hemme apoptose [33], [35] – [42]. Imidlertid er rollen til CCR7 i proliferasjonen av humane NSCLC-celler har ikke vært godt dokumentert. I den foreliggende undersøkelse, bekreftet vi at CCL21 /CCR7 interaksjon kan betydelig forbedre human NSCLC celleproliferasjon på en tidsavhengig måte, som involverer den oppregulering av cyklin A, cyklin B1, og CDK1, muligens via ERK, men ikke den Akt, sti.
i samsvar med tidligere studier med ulike cellemodeller [16], [37], [40], aktivering av CCR7 med CCL21 fremmet celleproliferasjon. I motsetning til vår nåværende funn, en tidligere studie antydet at murine CCL21 hadde ingen signifikant virkning på proliferasjonen av A549-celler [44]. En mulig forklaring for avviket vil være at mus CCL21 kan samvirke med CXCR3 men ikke CCR7, mens human CCL21 kan binde CCR7, men ikke CXCR3 [45]. Dette antyder at aktivering av CXCR3 ikke påvirker formering av A549-celler
Tradisjonelt blir cellesyklusen separert i fire faser:. DNA-replikasjon forekommer i løpet av S-fasen, og kromosom segregering oppstår under M-fasen. S- og M fasene ble separert ved de såkalte gap faser, G1 (før DNA-replikasjon) og G2 (før mitose). Vi demonstrerte at CCL21 /CCR7 signifikant endret cellesyklusfordeling slik at flere celler fylles G
2 /M-fasen. Ingen signifikante forskjeller ble observert om fordelingen av celler i G
0 /G
1 og S faser.
cellesyklus er regulert av cykliner og CDK. D-type cykliner regnes som viktige regulatorer av G
1 progresjon [46]. Cyclin E er nødvendig for G
1 /S overgang [47], [48] og cyklin A er essensielt for progresjon gjennom S-fasen [49], [50]. Både cyclin A og B-type cykliner forbinder med CDK1 å fremme inntreden i mitose [51], [52]. I denne studien ble både protein og mRNA-nivåer av cyklin A, cyklin B1, og CDK1 signifikant oppregulert når cellene ble behandlet med CCL21 i 24 timer. Dette indikerer at CCL21 /CCR7 akselererer G
2 /M progresjon fase for å fremme celleproliferasjon. Ingen signifikante forskjeller i cyklin D1 eller cyclin E ekspresjonsnivåer ble målt, noe som indikerer at CCL21 /CCR7 har ingen signifikant effekt på G
0 /G
en fase eller G
1 /S-overgangen. Dette funn demonstrerer for første gang at CCL21 /CCR7 har en impellent virkning på cellesyklusprogresjon involverer G
2 /M-fasen.
Flere studier ved hjelp av andre celletyper har vist at aktivering av CCR7 er forbundet med forbedret celleoverlevelse via økt fosforylering av ERK, JNK, eller Akt [16] – [20], [33], [35] – [42]. Vi undersøkte om CCL21 /CCR7 kan forsterke uttrykket av MAPK komponenter og Akt i A549 og H460 celler. Våre resultater antydet at CCL21 /CCR7 forbedret fosforylering av ERK, men ikke JNK, p38, eller Akt. Disse funnene er i strid med tidligere publiserte rapporter som antydet en facilitative effekt av CCR7 på Akt, men ikke ERK, pathway [16], [19]. En separat studie indikerte at Akt er muligens oppstrøms ERK [43]. Vi fant at CCL21 /CCR7 likevel kunne gi en betydelig oppregulere ekspresjonen av P-ERK etter at cellene ble behandlet med LY294002 i 1 time. Fordi LY294002 selektivt hemmer PI3K å forhindre nedstrøms aktivering av Akt, våre resultater tyder sterkt på at Akt ikke spiller en avgjørende rolle i samspillet mellom CCL21 /CCR7 og ERK. Dette er i samsvar med en tidligere rapport [53]. Grunnen til disse avvikene er fortsatt uklart.
Siden CCL21 /CCR7 var i stand til å øke uttrykket av P-ERK, søkte vi å finne ut om det er en interaksjon mellom P-ERK og cyclin A, cyclin B1, eller CDK1. Coimmunoprecipitation og gjensidige immunoutfellingsstudier resultater sterkt antydet en interaksjon mellom P-ERK og cyklin A, cyklin B1, eller CDK1, spesielt i nærvær av CCL21. Dette samspillet kan bli svekket ved å hemme ERK med PD98059. I tillegg PD98059 opphevet virkningen av CCL21 /CCR7 på A549 og H460 celleproliferasjon og G
2 /M fase progresjon, samt downregulating ekspresjonen av P-ERK, cyklin A, cyklin B1, og CDK1. Disse resultatene viser at effekten av CCL21 /CCR7 på celleproliferasjon og oppregulering av cyclin A, cyclin B1, og CDK1 kan skje via ERK sti i humane NSCLC-celler.
Denne studien tyder på at aktivering av CCR7 med CCL21 i betydelig grad kan fremme proliferasjon av NSCLC-celler i en tidsavhengig måte som involverer cyklin A, cyklin B1, og CDK1, muligens via ERK, men ikke den Akt, pathway. Denne informasjonen kan bidra til å avklare hvilke mekanismer for kreft celle overlevelse og identifisere potensielle mål for behandling av NSCLC.
Materialer og metoder
Cell kultur og reagenser
A549 og H460 cellelinjer fra vår tidligere publiserte papir [32] ble dyrket i RPMI-1640 eller DMEM-F12 supplert med 10% HyClone føtalt bovint serum (FBS) (ThermoFisher Scientific, Fremont, CA, USA) i en atmosfære av 5% CO
2 ved 37 ° C. Cellene ble dyrket i 75 cm
2 kultur kolber og høstet i en løsning av trypsin-EDTA på logaritmisk vekstfase.
cyclin A, cyclin B1, cyclin D1, cyclin E, CDK1, P-ERK , ERK, P-JNK, JNK, P-p38, p38, P-Akt, Akt, IgG, og p-aktin mus eller kanin monoklonale antistoffer ble innkjøpt fra Santa Cruz Bioteknologi (Santa Cruz, CA, USA). Rekombinant humant CCL21 ble kjøpt fra Pepro Tech (Rocky Hill, NJ, USA). siCCR7 og Lipofectamine 2000 ble kjøpt fra Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). Cell Counting Kit-8 (CCK-8) ble kjøpt fra Dojindo Laboratories (Beijing, Kina). PD98059 og LY294002 ble oppnådd fra Sigma (St. Louis, MO, USA) og ble brukt ved 50 pM eller 100 pM (sluttkonsentrasjoner), henholdsvis, i samsvar med tidligere rapporter [40], [54]. Protein A /G perler ble hentet fra Beyotime (Haimen, Kina).
siRNA behandling av celler
A549 og H460 celler ble sådd ut på 6 cm
2 cellekultur retter og vokst til 30-50% konfluens før transfeksjon med Lipofectamine 2000 som tidligere beskrevet [55]. Transfeksjonseffektiviteten ble bestemt ved flow-cytometri. Effektiviteten av siCCR7 og ikke-støydempere kontroll siRNA ble testet ved hjelp av Western blot og RT-PCR. Sekvensene til siCCR7 og kontroll siRNA var: CCR7, 5′-GCGUCAACCCUUUCUUGUATT-3 «og 3′-UACAAGAAAGGGUUGACGCAG-5′; kontroll, 5»-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 «og 3′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-5».
Celleproliferering analysen
Cell proliferativ aktivitet ble undersøkt ved hjelp av CCK-8. A549 og H460-celler ble sådd ut på 96-brønners plater (1000 celler /brønn) og behandlet med CCL21, 0, 24, 48 eller 72 timer. Etter behandling, ble CCK-8 tilsatt til hver brønn i henhold til produsentens instruksjoner og inkubert i 4 timer ved 37 ° C. Den optiske tetthet (OD) verdi for hver brønn ble målt ved anvendelse av en mikroplateleser (Spectra Thermo, Männedorf, Sveits) med en testbølgelengde på 450 nm.
cellesyklusanalyse
Etter behandling med CCL21 i 24 timer, ble cellene høstet og vasket to ganger med kald fosfatbufret saltløsning (PBS) og fiksert i 75% etanol i 2 timer ved 4 ° C. De fikserte cellene ble vasket to ganger med 500 ul kald PBS. Cellene ble deretter farget med 500 ul av propidiumjodid (PI) fargeløsning (50 ug /ml PI, 0,1% Triton X-100, 200 pg /ml DNase-fri RNase i PBS) i 30 min ved romtemperatur i mørke. Ti tusen hendelser per prøve ble ervervet ved hjelp av en FACS-scan strømningscytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA), og andelen av celler i G
0 /G
1, S og G
2 /M-fasene av cellesyklusen ble bestemt ved anvendelse av Modfit LT 3,0 (Becton-Dickinson).
Western blot-analyse
etter behandling med CCL21 i 24 timer, cellene ble ekstrahert med lyserings -buffer (150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,1% SDS, 2 ug /ml aprotinin og 1 mM PMSF) i 30 minutter ved 4 ° C. Ekstrakter ble sentrifugert ved 12000 x
g
i 15 minutter ved 4 ° C. Supernatanter som inneholder totalt protein deretter ble høstet. Alikvoter, hver inneholdende 50 pg protein, ble separert ved 10% SDS-PAGE og overført til PVDF-membraner ved 55 V (cyklin A, cyklin B1, P-Akt, Akt) eller 40 V (de andre) i 2,5 timer ved lav temperatur . Membranene ble blokkert i 5% skummet melk i 2 timer, og proteiner ble påvist ved anvendelse av monoklonale antistoffer ved 1:1000 (P-JNK, JNK, P-p38, p38 og β-aktin) eller 1:200 (de andre) fortynning over natten ved 4 ° C. Proteiner ble gjort synlige ved hjelp av anti-mus eller anti-kanin-IgG konjugert med pepperrotperoksidase (HRP) ved 1:6000 eller 1:8000 fortynning i 2 timer ved romtemperatur, henholdsvis. Bånd ble fotografert med en EC3 Imaging System (UVP LLC, Upland, CA, USA), og OD ble målt ved hjelp ImageJ (NIH, Bethesda, MD, USA). OD Forskjellen mellom testede proteiner og β-aktin av den samme prøve ble beregnet som relative innhold og uttrykt i grafisk form.
RT-PCR og real-time PCR
Total RNA ble isolert fra celler ved hjelp TRIzol (Invitrogen) i henhold til produsentens instruksjoner. p-aktin ble benyttet som en intern kontroll. For å bestemme effektiviteten av siCCR7 og kontroll siRNA ble semi-kvantitativ RT-PCR utføres på en G-STORM termosykleren (GRI Ltd, Byfleet, UK) ved hjelp av Takara RNA PCR Kit (AMV) Ver.3.0 (Takara, Dalian, Kina). PCR-primere var som følger: CCR7 F: 5′-GAGGCTATTGTCCCCTAAACC-3 «, R: 5′-TGGAGGACAGTGAAGAAAACG-3». Den CCR7 amplicon lengde var 305 bp. β-actin F: 5′-AAATCGTGCGTGACATTAA-3 «, R: 5′-CTCGTCATACTCCTGCTTG-3». Den β-aktin fragment lengde var 513 bp. Varmesykkelbetingelsene var som følger: 30 sykluser av 40 s hver, inkludert denaturering ved 95 ° C, hybridisering ved 53 ° C, og forlengelse ved 72 ° C
Sanntids-PCR ble utført på en ABI. Prism 7900HT Fast System (Applied Biosystems, Foster, CA, USA) ved hjelp av SYBR Premiks Ex Taq II (Takara). Amplifikasjoner ble utført i et totalvolum på 20 ul og syklet 40 ganger etter initiell denaturering (95 ° C i 30 s) med følgende parametere: 95 ° C i 5 s og 60 ° C i 30 sek. β-actin F: 5′-AGCACAGAGCCTCGCCTTTG-3 «, R: 5′-ACATGCCGGAGCCGTTGT-3». Den β-aktin fragment lengde var 107 bp. Andre primer sekvenser har blitt publisert i en annen studie [56]. Påliteligheten av PCR-resultater ble støttet ved å analysere den dissosiasjon kurve. Real-time PCR data ble beregnet ved hjelp av to
-ΔΔCT metoden på SDS 2,4 programvarepakke (Applied Biosystems) [57].
Coimmunoprecipitation
Etter behandling med CCL21 i 24 timer ble cellene ekstrahert med lyseringsbuffer (10 mM KCl, 1,5 mM MgCl
2, 10 mM HEPES [pH 7,9], 1 mM PMSF, 1 mM DTT) og homogenisert i 30 minutter ved 4 ° C. Ekstraktene ble sentrifugert ved 12.000 x
g
i 15 minutter ved 4 ° C, og supernatantene som inneholdt totalt protein ble høstet. Like mengder protein ble utsatt for antistoffer mot P-ERK, IgG, cyklin A, cyklin B1, eller CDK1, som ble immobilisert på protein A /G-perler. Etter 3 timers inkubasjon ved 4 ° C med forsiktig rotasjon, ble perlene grundig vasket fem ganger med lyseringsbuffer, kokt, og mikrosentrifugert. Proteiner ble påvist med antistoffer mot P-ERK, cyclin A, cyclin B1, eller CDK1 av Western blot.
Statistisk analyse
Data ble analysert ved hjelp av SPSS 16.0 programvare. Én-veis analyse av varians (ANOVA) ble anvendt for å evaluere forskjellene mellom grupper med ulike behandlinger, og den minst signifikante forskjell (LSD) test eller Dunnett T3 test ble anvendt for post hoc undergruppeanalyse. Polynom kontrast ble brukt for trendanalyse. Alle data er presentert som gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. Resultatene ble ansett som statistisk signifikant for p 0,05. N-fold verdier for genuttrykk endre opp til 0,5 og under to ble tatt som betydnigsløst i samsvar med verdier hentet fra negative kontrollgener [57], [58].
