Abstract
Sigarettrøyk eksponering markert kompromitterer evne til immunsystem til å beskytte mot invaderende patogener og tumorigenesis. Nikotin er et psyko komponent av tobakksprodukter som fungerer som gjør det naturlige nevrotransmitter, acetylkolin, på nikotin (nAChR). Her viser vi at natural killer (NK) celler sterkt uttrykke nAChR β2. Nikotin eksponering svekker evnen til NK-celler til å drepe målceller og frigjøre cytokiner, en prosess som i stor grad er opphevet ved nAChR β2 mangel. Videre er nikotin undertrykkelse av NF-kB-indusert transkripsjonen aktivitet på NK-celler er avhengig av nAChR β2. Dette nAChR undertype spiller også en stor rolle i den NK-celle-formidlet kontroll av melanom lungemetastase, i et muse-lungemetastase modell utsatt for nikotin. Våre funn tyder på nAChR β2 som en fremtredende vei for nikotin indusert nedskrivning av NK cellefunksjoner som bidrar til forekomsten av røykerelaterte sykdommer
Citation. Hao J, Shi FD, Abdelwahab M, Shi SX, Simard A , Whiteaker P, et al. (2013) Nikotin Receptor β2 Bestemmer NK-celleavhengige metastaser i en murine modell av metastatisk lungekreft. PLoS ONE 8 (2): e57495. doi: 10,1371 /journal.pone.0057495
Redaktør: Fabrizio Mattei, Istituto Superiore di Sanita, Italia
mottatt: 28. oktober 2012; Godkjent: 21 januar 2013; Publisert: 28 februar 2013
Copyright: © 2013 Hao et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien støttes delvis av International Science samarbeidsprosjekt i Kina 2006DFB32330 til QHZ; National Basic Research Program of China 2013CB966900 til FDS; Program for New Century gode talenter i University of China (NCET 111067 til JWH); NFSC 2010CB529405 til QHZ, 81100887 og 81273287 til JWH; US National Institute of Health (R01AI083294 til FDS); Key Prosjekt of Science Foundation of Tianjin-provinsen 12JCZDJC24200 Natural til JWH, og Key prosjekt kinesiske utdanningsdepartementet (212 005 til JWH). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
røyke-relaterte lidelser så som infeksjoner og tumordannelse har vært knyttet til de kompromitterte funksjonene i immunsystemet hos røykere [1], [2]. Blant de mange immunmodifiserende komponenter i tobakksrøk, har nikotin blitt vist å ha en betydelig innflytelse på en rekke nikotin acetylkolin reseptor (nAChR) bærende leukocytter fra både medfødt og adaptive immunsystemet. Ekspresjon av nAChR α7 på makrofager og monocytter, og dens evne til å inhibere immunresponsen i løpet av systemisk inflammasjon og i organspesifikke sykdommer har vært relativt godt beskrevet [3], [4], [5], [6], [7] , [8]. Resultatene tyder på at nikotin regulerer intensiteten av endotoksemi og sepsis [3], [4], [5], og demper-spesifikke autoimmune responser i en nAChR α7 avhengig måte [6], [7], [8]. På den annen side er det nylig blitt demonstrert at andre nAChR undertypene kan spille en rolle i nikotin anti-inflammatorisk virkning [3], [4], [5], [6], [7], [8]. I denne sammenheng er uttrykket profilen av ytterligere nAChR-er på leukocytter og deres rolle i sykdommen er forholdsvis mindre utforsket.
NK-celler er store, granulære lymfocytter som opererer gjennom cytolytisk aktivitet og cytokinsekresjon. Disse to funksjonene styrke NK-celler i medfødt vertens forsvar mot visse mikrobielle midler og celler som gjennomgår malign transformasjon. Flere studier har vist at NK-celle tall og aktiviteter er redusert hos røykere sammenlignet med ikke-røykere [1], [2]. Eksponering for sigarettrøyk demper den cytotoksiske aktivitet og cytokin produksjon av NK-celler hos mennesker og mus [9], [10], [11], for derved å knytte NK-celledefekter til økt infeksjonssykdommer og kreft. Røyking har vært spesielt knyttet til svært ondartet småcellet lungekreft. Selv etter kirurgisk fjerning på et tidlig stadium, nesten halvparten av pasientene dør fra en sekundær tumormetastase. Det antas at dette skyldes delvis defekt NK celle-mediert immunovervåkning fordi avvik NK celle funksjon hos røykere øker ny fremvekst av livmorhalskreft metastaser [12].
Her har vi omfattende undersøkt mobil og molekylære effekter av nikotin som en av komponentene i sigarettrøyk på NK-celler. Vi profilert nAChR uttrykk på NK-celler og identifiserte nAChR β2 som en viktig faktor for nikotin-mediert svekkelse av NK celle funksjoner. Videre viser vi at nikotin hemming av NK cellefunksjoner via nAChR P2 signifikant øker melanoma metastaser i en xenogene modell.
Materialer og metoder
Dyr
Kvinne C57BL /6 mus (6-8 wk gamle), RAG2
– /-, RAG2
– /- γ
c
– /-, alt på en C57BL /6 bakgrunn, ble kjøpt fra Taconic Farms. α7 og p2 KO mus [13], også krysset til C57BL /6 bakgrunn, ble vennlig levert av Dr Allan C. Collins. Musene ble opprettholdt under patogen-frie forhold. The Animal forskningsetikk styret i Tianjin Medical University og St. Joseph Hospital og Medical Center godkjent alle forsøkene beskrevet i denne studien.
mRNA Rensing og revers-transkripsjon PCR
mRNA ble renset fra frisk akutt -isolated celler (~1.5 × 10
6 celler per prøve) ved hjelp av μMACS mRNA isolert sett (Miltenyi Biotec), som per den medfølgende protokollen. Revers transkripsjon ble utført med Superscript III First Strand cDNA Synthesis kit (Invitrogen, USA) ved å følge den vedlagte protokollen. Oligo-dT-sekvenser ble anvendt for å prime revers transkriptase. PCR ble deretter utført ved å følge etablerte protokoller, ved hjelp av en rekke av primere som er spesifikke for hvert mål-mRNA (tabell 1). Primerpar ble utformet med bruk av PubMed er «Primer-blast» verktøy (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/). For hvert par, forover og revers primere var spesifikke for forskjellige eksoner, slik at potensiell DNA-kontaminering kunne utelukkes. PCR ble utført ved anvendelse av RedTaq PCR kit (Sigma, USA), i henhold til den vedlagte protokoll. Primere ble alltid testet med total hjerne cDNA (positiv kontroll), og den optimale glødetemperaturen (Tm) ble bestemt empirisk (med bruk av en temperaturgradient termo), under opprettholdelse av høy-stringensbetingelser. En negativ kontroll (ingen cDNA templat), ble inkludert i hvert sett av reaksjoner. PCR-produkter for hvert primerpar fra positive kontroller ble sekvensert for å sikre nøyaktigheten av våre resultater.
Generelt nAChR Expression Vurdert av Radioligand Saturation Binding
Epibatidine, som er selektiv for β2- og p 4-inneholdende nAChR-er (som kan sette sammen med α4, α5, α6 og P3-underenheter), ble brukt for å vurdere mengden av p2-inneholdende nAChR-er, som utført tidligere [14], [15]. For å maksimere analysen følsomhet, brukte vi høy spesifikk aktivitet [
125I] epibatidine (I-Epi, 2200 Ci mmol
1; PE Life Sciences, Waltham, MA). For dette formål ble det rensede NK-celler anvendt umiddelbart etter isolering. Celler ble resuspendert i isotonisk bindende buffer (i mM: NaCl, 144; KCl, 2; CaCl
2, 2; MgSO
4, 1, HEPES 20 pH = 7,5), supplert med bovint serumalbumin (0,1% (w /v)). Inkubasjoner ble utført ved 22 ° C i 2 timer i 96-brønners plater. Prøvene ble inkubert med en rekke av åtte konsentrasjoner (6,25 til 800 pm) av I-Epi i et totalvolum på 30 ul tilsatt isotonisk bindingsbuffer. Total (uten peptid tilsatt) og ikke-spesifikk binding (definert ved anvendelse av 100 mM carbamycholine) ble målt ved hver konsentrasjon i triplikat. For å skille β2- fra p 4-holdige nAChR, ble 10 nM A85380 lagt i conjuncton med 200 pM I-Epi [14]. Bindingsreaksjonene ble terminert og vasket ved filtrering under anvendelse av et 96-sted manifold. Partikkelformige fraksjoner ble samlet på ett enkelt lag av INOTECH 0,75 um retensjon glassfiberfiltre dynket i 0,5% polyetylenimin. Bundet radioligand ble kvantifisert ved hjelp av en Micro plate teller (PerkinElmer Life Sciences, Wellesley, MA).
Nikotin Treatment in vivo og in vitro
For in vivo levering, en 100 mg /ml oppløsning inneholder (-) nikotin bitartrate (Sigma, St. Louis, MO, USA) i fosfat-bufret saltvann (PBS) eller en løsning av PBS alene var nylaget 24 timer før pumpe implantasjon og lastet inn Alzet® osmotiske minipumper (modell 2006, Durect Corporation, Cupertino, CA, USA). Pumpene ble implantert subkutant på høyre side av ryggen av mus og kontinuerlig leveres enten PBS eller nikotinsaltet i 3,6 mL /d i 6 uker, og deretter pumpene fjernet. Dette likestilles med levering av 0,39 mg nikotin fri base per mus per dag. For en ~ 30 g mus, som er i den øvre ende av vekt for dyr brukt i studien, tilsvarer dette ~13 mg nikotin fri base /kg /d eller ~0.54 mg nikotin fri base /kg /time. Plasma-nikotinnivåer i mus er ~100-200 ng /ml (~0.6-1.2 mM) etter infusjon av ~2-4 mg /kg /time av legemiddel og ~45 ng /ml (~280 nM) etter infusjon med ~0.5 mg /kg /time. Til sammenligning menneskelige røykere har peak plasma nikotin nivåer av 10-50 ng /ml (~60-310 Nm). Således nikotinnivåer i plasma (ekstrapolert for å være ~49 ng /ml eller ~300 nM) av mus anvendt i studiene er sammenlignbare med de i plasmaet av humane røykere. Noen kontrollmusene fikk PBS-injeksjoner via direkte i stedet for gjennom minipumper, men enten leveringsmåte produsert lignende resultater. For in vitro forsøk ble 0,1-100 mikrometer /ml nikotin lagt til cellekulturer.
B16 melanoma cellelinje og Tumor Challenge
B16-F10-luc2 (B16) er en luciferase-uttrykke cellelinje fra mus melanom (Caliper Life Sciences, Alameda, CA, USA). Mus av de angitte genotypene ble utfordret i.v. med B16-celler i 0,2 ml PBS via halevenen. Celle tall som brukes og tider med offer er referert til tidligere etablerte protokoller [9], [15], [16] og er spesifisert i resultatdelen. Dyrene ble bedøvet og avlivet via exsanguinations gjennom mage vene punktering. Lungene ble fjernet og plassert i PBS. Tumornoduler ble talt ved hjelp av en dissekere mikroskop av en forsker blindet for behandlingsgruppene. I noen tilfeller ble lungene neddykket i en 67% etanol, 9% formaldehyd, og 4% iseddik-oppløsning og antallet tumor foci ble nummerert 24-48 timer senere.
Isolering av mononukleære celler Lung
Lung mononukleære celler ble isolert som tidligere beskrevet [17]. I korthet, lunger ble perfusert med forvarmet HBSS fra den høyre ventrikkel. Cellesuspensjoner fra utskårne organer ble samlet ved kollagenase fordøyelse og etterfulgt av mekanisk hakking. Cellerester ble fjernet ved å passere gjennom nylonnetting. Cellene ble vasket og resuspendert i HBSS. Parenchymale celler ble isolert ved tetthetssentrifugering med Lympholyte-M (Cedarlane Laboratories).
NK-celle cytotoksisitetsanalyser
NK-celle cytotoksisitet ble bestemt ved kromfrigjøringsanalyse ved hjelp av
51Cr- merket YAC-1 murin lymfom cellelinjen [18] eller B16-tumorceller. Ferskt rensede NK-celler ble inkubert med
51Cr-merkede målceller (5 x 10
3) ved forskjellige effektor-celle /target celleforhold. Etter 4 timers inkubering, ble supernatantene høstet og
51Cr-frigjøring ble målt med en γ-teller (PerkinElmer, Waltham, MA). Prosentandelen av spesifikk lyse ble beregnet i henhold til følgende formel: (eksperimentell frigjøring – spontan frigjøring) /(maksimal frigjøring – spontan frigjøring) x 100. cytotoksisitetsanalyser ble utført i triplikat [18]
NK-celleproliferasjon. assays
NK-celler ble isolert fra milten hos mus som ble behandlet med nikotin eller PBS. Cellene ble suspendert i kulturmedium inneholdende Dulbeccos modifikasjon av Eagles medium (Gibco, Paisley, UK) supplert med 1% (v /v) minimum essensielt medium (Gibco), 2 mM glutamin (Flow Laboratory, Irvine, CA, USA), 50 IU /ml penicillin, 50 mg /ml streptomycin, og med 10% (v /v) FCS (alle fra Gibco). 4 x 10
5-celler i 200 ul kulturmedium ble plassert i hver brønn i 96-brønners, rundbunnede mikrotiterplater (Nunc, København, Danmark). For in vitro-nikotin-stråling eksperimenter ble nikotin (0,1-100 pM) tilsatt til kulturmediet i tillegg til LPS (10 pg /ml). Etter 3 dagers inkubering ble cellene pulset i 18 timer med 10 pl aliquoter inneholdende 1 uCi
3H-methylthymidine (spesifikk aktivitet på 42 Ci /mmol; MP Biomedicals, Irvine, CA, USA) per brønn. Celler ble innhøstet på glassfiberfilter og tymidininkorporering proporsjonale til graden av celleformering ble deretter målt. Resultatene er uttrykt som tellinger per minutt (cpm).
FACS analyse
Enkeltcellesuspensjoner (10
6-celler) ble fremstilt fra milt eller lymfeknuter, og farget med fluorochrome- konjugerte antistoffer. Alle antistoffer ble kjøpt fra BD Biosciences eller eBioscience mindre annet er angitt. Antistoffer ble direkte merket med en av følgende fluorescerende tags: FITC, PE, PerCP, allofykocyanin (APC), PC5, eller PC7-. Følgende anti-mus-antistoffer ble benyttet: CD3 (145-2C11), NKG2A (20d5), NKG2D (CX5), Ly49 I (Yli-90), NK1.1 (PK136), perforin (eBioOMAK-D) og granzyme B (16G6). Flowcytometrisk data ble samlet på en FACSAria
TM flowcytometer (Becton Dickinson, Mountain View, MD) og analysert med Diva
TM programvare. Isotype-matchet negativ kontroll mAb ble anvendt for alle flekker. For å bestemme prosentandelen av celler som produserer valgte cytokiner, ble verdier oppnådd med isotype kontroller subtraheres fra de med spesifikk mAb.
Tumor in vivo avbildning
bioluminescens bilder ble oppnådd ved anvendelse av en IVIS Imaging System 200 Series (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA). For
in vitro
bildebehandling, ble bioluminescent cellene fortynnet i serie fra 10
5 celler i fullstendig media i svart, klar bunn, 24-brønners plater (Costar, Acton, MA, USA). D-luciferin (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA.) 150 mikrogram /ml i media ble tilsatt til hver brønn 5-10 min før bildebehandling. Imaging tid var 1 min /plate. For
in vivo
bildebehandling, mus fikk en intraperitoneal injeksjon av D-Luciferin 150 mg /kg (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA). Mus ble deretter plassert på den oppvarmede fasen inne i lystett boks kamera med kontinuerlig eksponering til 1-2% isofluran. Imaging ganger varierte fra 1 s til 3 mints. Regioner av interesse fra viste bildene ble identifisert rundt kreft områder og ble kvantifisert som total fotontelling eller fotoner /s ved hjelp av levende Image® programvare (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA).
Kreftsmitteforsøk ble gjennomført med melanom B16 celler som uttrykker luciferase. For kvantifisering av tumorbyrden, 10 minutter etter intraperitoneal injeksjon av 3 mg /mus D-luciferin (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA), ble musene bedøvet og anbragt i lys tett kammer av en IVIS 200 bioluminiscens avbildningssystem (Sylinder Liv Sciences, Hopkinton, MA). Data ble samlet inn som fotoner /sek /cm
2 ved hjelp av den levende Image® programvare (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA).
MR ble utført ved hjelp av en 7T lite dyr, 30 cm horisontal boring magnet og Biospec Avance III spektrometer (Bruker, Billerica, MA) med en 116 mm høy effekt gradient sett (600 mT /m) og en 72 mm hele kroppen mus sender /overflate motta spole konfigurasjon. Aksiale og koronale T1-vektet (MSME; TE 10,5 ms, TR 322 ms, 0,5 mm skivetykkelse, matrise 256 × 256, synsfeltet (FOV) 2,8 cm, åtte gjennomsnitt, 40 koronale skiver, skanning tid 22 minutter, og 20 aksiale snitt, scan tid 16 min) og fett-trykt turbo spin ekko T2-vektet (RARE, TE1 14,5 ms, TE2 65,5 ms, TR 4500 ms, 0,5 mm skive tykkelse, Matrix 256 × 256, FOV 2,8 cm, åtte gjennomsnitt, 40 koronale skiver, scan tid 28 minutter, og 20 aksiale snitt, scan tid 28 minutter) bilder ble ervervet, som dekker volumet av hjernen fra luktelappen /frontallappen fissure til cervical ryggmargen. MR-data ble analysert ved hjelp av MEDx3.4.3 programvarepakken (Medical Tall, Virginia, USA) på en Linux-arbeidsstasjon.
cytokin Kvantifisering
Standard ELISA for vurdering av cytokine release av NK-celler (IFN -γ, ble MIP1α, og GM-CSF) utført ved anvendelse av BD OptEIA ELISA-sett (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA) som tidligere beskrevet [18]. Resultatene ble uttrykt som gjennomsnitt cytokin-konsentrasjon (pg /ml) ± SEM.
For intracellulære cytokin-farging, ble enkeltcellesuspensjoner fremstilt og inkubert ved 37 ° C i fire dager i rundbunnede plater (2 x 10
6 celler /brønn), og stimulert med en blanding av PMA (20 ng /ml), ionomycin (1 pg /ml), og Brefeldin A (5 mikrogram /ml) i ytterligere 5 timer ved 37 ° C. Etter høsting ble cellene farget for overflatemarkører, faste og permeabilized med Cytofix /Cytoperm kit (BD Biosciences), deretter farget med anti-IFN-γ mAb (XMG1.2) konjugert med Alexa 647. Alle prøvene ble analysert på en FACSAria
TM bruker Diva
TM programvare.
QRT-PCR
Total RNA ble ekstrahert fra cellesuspensjoner av ryggmargen ved hjelp TRIzol (Invitrogen). Første-tråd cDNA av hver prøve ble syntetisert ved anvendelse av en revers transkripsjon sett (Invitrogen). RT-PCR ble utført som tidligere beskrevet, ved bruk av en ABI Prism 7900-HT-sekvens system (Applied Biosystems) med den QuantiTect SYBR grønn PCR-sett (QIAGEN), i henhold til produsentens instruksjoner. De følgende primere ble anvendt: NF-kB fremover, 5′-ATTTGAAACACTGGAAGCACGG-3 «; NF-kB omvendt, 5’CCGCCTTCTGCTTGTAGATAGG -3 «; IKKα fremover, 5»-TGCACACCGTGCAGAGTCA -3 «; IKKα revers, 5’TGCTTGCAGCCCAACAACT -3 «; hypoksantin-guanin fosforibosyltransferase (HPRT) fremover, 5»-AGCCTAAGATGAGCGCAAGT-3 «; og HPRT omvendt, 5»-TTACTAGGCAGATGGCCACA-3 «. HPRT-genet ble amplifisert og tjente som en endogen kontroll. 1 mL av første-tråd cDNA produktet ble forsterket med platina Taq polymerase (Invitrogen) og gen-spesifikk primer parene. Hver prøve ble analysert i triplikat og forsøkene ble gjentatt to ganger. De relative mengder av mRNA ble beregnet ved å plotte Ct (syklus tall), og mener relative uttrykk ble bestemt av to
-ΔΔCt komparativ metode.
Resultater
nAChR Expression Profil på NK-celler og bekreftelse av ligandbindende Analyser
for å finne ut nAChR mRNA uttrykk på NK-celler, vi sortert NK-celler fra sammenslåtte splenocytes av RAG2
– /- C57BL /6 mus som er blottet for T-celler, NKT -celler og B-celler. mRNA ble ekstrahert fra høyt rensede NK-celler (figur 1A) og nAChR ekspresjon profil ble bestemt ved PCR. Våre resultater tyder på at NK-celler uttrykker nAChR α4, α5, α6, β2 og β3 men ikke α3, α7, α9; heller β4. Videre uttrykk for β2 var spesielt sterk (figur 1B). Vi deretter undersøkt om nAChR proteiner i stand til å engasjere seg i nikotin radioligandbinding er samlet i NK-celler ved å bruke en
125I-merket epibatidine (I-Epi) bindingsanalysen (200 pM I-Epi +/- 100 mm carbamylcholine), som beskrevet andre steder [14], [19], [20], [21]. NK-celler (~ 1 million) ble renset ved hjelp av FACS, og musehjernebark-homogenat ble anvendt som en positiv kontroll. Spesifikk I-Epi-bindingen var 99 fmol /mg protein i NK-celler, omtrent lik spesifikke bindingsnivåer i mus hele hjernen (figur 1C). Disse data viser at NK-celler uttrykker et betydelig antall sammenstilte nAChR-er (så vel som nAChR underenhets mRNA som tidligere vist) ved nivåer som kan kvantifiseres med denne analysen. Siden I-Epi binder seg til både β2- og ß4 holdige nAChR-er [14], konkurrerende binding med nAChR β2-selektive forbindelse A85380 ble anvendt for å skille mellom disse to reseptorundertyper. Vi fant at A85380 i stor grad opphevet I-Epi-binding, noe som viser at det store flertall av nAChR-er til stede på NK-celler inneholder den β2 underenheten (figur 1C). Samlet våre resultater viser at NK-celler uttrykker en rekke nAChR mRNA og at de fleste av disse underenhetene montere inn p2 holdig nAChR. Den sterke ekspresjon av nAChR β2 i NK-celler, både på mRNA og proteinnivåene antyder at p2-holdige nAChR-er kandidater for formidling av nikotin største virkninger på NK-celleaktivitet.
Milt eller lymfeknutecellesuspensjoner ble oppnådd RAG2
– /- mus, og FACS ble utført som beskrevet i
Materialer og metoder
delen. A. Representative prikkplotter av cellepopulasjoner før og etter sortering vises i venstre og høyre hånd paneler, henholdsvis. Renheten av NK-celler nådd 98% renhet etter sortering. B. mRNA ble renset fra de sorterte NK-celler, og cDNA ble syntetisert ved revers transkripsjon. PCR ble deretter utført ved anvendelse av primere som var spesifikke for hver mus nAChR underenhet. En positiv kontroll (+), ved bruk av hele musehjerne-cDNA, og en negativ kontroll (-), uten cDNA, ble inkludert i hver reaksjon. For hver nAChR-underenhet ble bånd fra den positive kontrollen og i det minste en prøve fra hver celletype sekvensert og bekreftet den korrekte PCR-produkt. C. nAChR uttrykk vurderes av radioligand metning bindende. Data som er avbildet er representant fra to til tre separate forsøk med lignende resultater.
Influence of nAChR β2 mangel på uttrykk for NK celle reseptorer og Effector Molekyler
NK celle funksjoner er diktert av stimulerende og hemmende reseptorer på NK-celler. Aktivering signaler genereres gjennom NK gruppe 2 medlem (NKG2D), som gjenkjenner stress-induserbar molekyler MHC klasse I kjederelaterte proteiner (MICA og MICB) og UL-16-bindende proteiner 1-4 (ULBP1-4), også kjent som Raet proteiner, eller gjennom naturlig cytotoksiske reseptorer (NCR) som gjenkjenner virus hemagglutinin og udefinerbar tumor-assosiert ligand. De inhiberende signaler blir generert ved binding av MHC klasse I-molekyler til killer cell immunoglobulin-lignende reseptorer (kirs) hos mennesker, eller for å Ly49 i mus, i tillegg til CD94 /NKG2A heterodimeren i begge arter [22], [23]. Vi sammenlignet ekspresjonen av flere av disse reseptorer på milt NK-celler isolert fra nikotin eller PBS-eksponerte mus og undersøkt innflytelsen, om noen, av nAChR β2 mangel. Uttrykk for hemmende reseptor NKG2A er ikke vesentlig endret på NK-celler av nikotin; mens uttrykk for NKG2D og Ly49I ble redusert hos mus som fikk nikotin, og slike reduksjoner i stor grad er opphevet i nAChR β2
– /- mus (figur 2A) [13]. Lignende funn ble oppnådd om uttrykk for NK celle effektor molekylær granzyme B og perforin (figur 2B). Vi observerte også at nikotin har en lignende effekt på lunge-avledet NK-celler reseptor profil og effektor molekyler (data ikke vist).
Wild type (β2
+ /+) eller nAChR P2 knock-out ( β2
– /-) mus fikk nikotin (Nic) eller PBS i 21 dager før de ble scarified. Enkeltcellesuspensjoner ble fremstilt fra milt. Frekvens og fenotyper av NK-celler i løpet av de mononukleære celler ble analysert ved FACS. A. Expression of NKG2D, NKG2A og Ly49I på gated NK1.1
+ CD3
– celler. B. Uttrykk for perforin og granzyme B skilles ut av gated NK1.1
+ CD3
– celler. Tomten data representerer resultater fra to separate forsøk (n = 3-4 mus /gruppe). P-verdier, Student
t
-test, * p. 0,05
nAChR β2 Deficiency Snur den hemmende effekten av nikotin på NK celle funksjoner
For å forstå biologiske konsekvensen av forandret NK-celle-reseptor-ekspresjon indusert ved eksponering nikotin, undersøkte vi effekten av nikotin på NK-celle-mediert dreping av målceller, så vel som frigjøring av cytokiner ved hjelp av NK-celler. NK-celler normalt utgjør 5-10% av perifere mononukleære blodceller i human og 1-3% av monocytter i mus milt eller lymfeknute. For NK-celler til å utføre sine oppgaver, må disse cellene sprer henhold patologiske situasjoner. Således vi først vurderes påvirkning av nikotin på NK-celleformering og funnet at nikotin nedsatt NK-celleformering og nummer (figur 3A, B). nAChR β2 mangel i stor grad gjenopprettet kapasiteten til NK-celler til å proliferere og tall i nærvær av nikotin (figur 3A, B).
NK-celler ble sortert fra splenocytt enkeltcellesuspensjoner av villtype (β2
+ /+) eller nAChR P2 knock-out (β2
– /-). A. Cellene ble deretter dyrket i nærvær av forskjellige konsentrasjoner av nikotin (0,1, 1, 10 eller 100 uM) og [
3H] tymidin inkorporering ble målt (10
3 cpm ± SEM; ordinaten). B. NK-celletall ble bestemt fra β2
+ /+ og β2
– /- mus i nærvær eller fravær av nikotin. (N = 6-8 per gruppe, Student
t
-test, * p 0,05). C.
51Cr-labbed målcelle YAC-1 ble inkubert med NK-celler avledet fra β2
+ /+ og β2
– /- mus i nærvær eller fravær av nikotin, ved den angitte effektor /target celle-forhold. Avliving av målceller måles ved
51 Cr frigjøring analysen. D. B16-celler ble inkubert med NK-celler avledet fra β2
+ /+ og β2
– /- mus i nærvær eller fravær av nikotin. D-Luciferin ble tilsatt til hver brønn, og platen ble fotografert for å få fotoner /s per celle. Brønner med celler alene (ikke i noe nikotin) eller celler (tilsatt nikotin) ble inkludert som kontroller. Drapet på B16 celler måles via bioluminesens imaging. Dataene i ett eksperiment av to utførte er vist, n = 3-4 mus /gruppe. P-verdier, Student
t
-test, * p 0,05. E. Produksjon av IFN-γ ble målt ved intracellulær cytokin farging. Prikkplott er representative for to separate forsøk (n = 6-18 mus). F. Fremstilling av IFN-γ, TNF-α, GM-CSF, MIP-1α og MIP-β av sorterte NK-celler ble målt ved ELISA. P-verdier, Student
t
-test, * p. 0,05
Deretter vurderes vi påvirkning av nikotin på NK celle lytisk aktivitet og mulige roller for nAChR β2. Sammenlignet med kontroll-mus som fikk PBS, NK-celler fra nikotin-behandlede mus oppviste redusert cytotoksisitet mot YAC-1, et klassisk NK-målcellen med lavere MHC klasse I ekspresjon (figur 3C). Primære humane og mus melanoma, eller cellelinjer, felles uttrykk for ligander for naturlige cytotoksiske reseptorer (NCR) og DNAX tilbehør molekyl-1 (DNAM-1), de to vekst NK-cellereseptorer viktige for kreft gjenkjennelse [15]. Videre, disse cellene har lav MHC klasse I ekspresjon [15]. NK-celler er således i stand til å gjenkjenne og lysere humane og mus-melanomceller in vitro og in vivo, og for å forhindre melanom metastase i adoptive overføringsforsøk [24]. Vi brukte derfor den murine B16-cellelinjen, avledet fra spontan murin melanoma, og viste at NK-celler lett kan drepe B16-tumorceller, og at denne effekten var signifikant redusert ved eksponering til nikotin (figur 3C, D). For å undersøke bidrag fra nAChR β2-reseptoren å megle effekten av nikotin, utfører vi disse eksperimentene ved hjelp nAChR β2
– /- NK-celler (figur 3C, D). I alle forsøkene, nAChR β2 mangel avskaffet betydelig effektene av nikotin.
Siste undersøker vi effekten av nikotin på cytokin produksjon av NK-celler. Sammenlignet med kontrollmusene, IFN-y, GM-CSF, MIP-1a, MIP-1 p og TNF-α sekresjon ble redusert hos mus mottok nikotin (figur 3E, F). Igjen ble disse parameterne reversert for en stor del i nAChR β2
– /- mus. Kollektivt, våre resultater viser at nikotin svekker NK-cellefunksjoner, inkludert proliferasjon, cytotoksisitet mot YAC-1-celle, og B16-tumorceller, og produksjon av cytokiner. Våre funn viser også at til tross for ekspresjon av flere nAChR-er, nAChR β2 dukket opp som et viktig mediator for nikotin virkninger på NK-celler, som mangel på nAChR α7 klarte ikke å vesentlig endre påvirkningen av nikotin på NK-celler (data ikke vist).
Nikotin hemmer NF-kB trans i NK-celler gjennom nAChR β2
Mobilisering av transkripsjonsfaktoren NF-kB er et viktig skritt for NK-celleaktivering og fortsetter sin cytotoxicic aktivitet og produksjon av cytokiner. For å evaluere effekten av nikotin på NF-kB aktivitet på NK-celler, sortert vi NK-celler fra milten av RAG2
– /- mus, og kultivert de isolerte NK-celler alene eller sammen med nikotin i 24 timer. Vi utførte en serie med real-time PCR eksperimenter se på endringer i transkripsjon overflod, og så at tillegg av nikotin trykkes gentranskripsjon av NF-kB, og IKKα, en alternativ regulator av NF-kB i NK-celler (figur 4). For å avgjøre om nAChR β2 er involvert, vi kryss-avlet RAG2
– /- med nAChR β2
– /- mus til å generere dobbelt knockout mus. Når NK-celler avledet fra disse mus ble anvendt, blir effekten av nikotin på NF-kB og IKKα transkripsjon minimum (figur 4). Således formidler nAChR β2 effekten av nikotin på NK-celle transkripsjons gener som er kritiske for deres funksjoner
NK-celler ble sortert fra splenocytt enkeltcellesuspensjoner av RAG2
-. /- Og RAG2
– /-β2
– /- mus. NF-kB og IKKα mRNA av sortert NK-celler i β2
+ /+ eller β2
– /- mus fikk nikotin (Nic) ble målt ved QRT-PCR. Dataene i ett eksperiment av to utførte er vist, n = 3-4 mus /gruppe. P-verdier, Student
t
-test, * p. 0,05
Nikotin Exposure Fremmer Lung metastaser, en prosess Avhengig nAChR β2
Sigarettrøyk har vært eksperimentelt vist å øke lungemetastatisk tumorbelastning [11]. Som flere kjemikalier som finnes i sigarettrøyk kan ha denne effekten, søkte vi spesielt ta rollen som nikotin eksponering i denne prosessen. For å oppnå dette, har vi tatt i murine B16-cellelinjen avledet fra spontan murin melanom. Fordi B16-tumorceller har høyt lungemetastasepotensiale og slike metastase kan hemmes ved hjelp av NK-celler, er denne modellen enkelt å adressere rollen til nikotin og dets reseptorer i dette patologisk prosess. For dette formål, C57BL /6 RAG2
– /- mus ble behandlet med nikotin eller PBS via osmotisk pumpe implantasjon i 14 dager og utover. Doseringen valget er basert på røykere og begrunnet i detalj i metodedelen og i våre tidligere publikasjoner [7], [8]. Disse mus ble deretter utfordret i.v. med 1 × 10
6 B16- melanomceller. Basert på litteraturen [11], [15], [16], vi gjorde forberedelser eksperimenter der tumorbelastning og overlevelse ble sammenlignet hos mus som fikk 1 × 10
5, 2,5 × 10
5, 5 × 10
5, 1 × 10
6 og 2,5 × 10
6 B16 celler.
