Abstract
GAIP samspill protein C endestasjonen (GIPC) er kjent for å spille en viktig rolle i en rekke fysiologiske og sykdomstilstander. I denne studien har vi identifisert en ny rolle for GIPC som en mester regulator av autofagi og exocytotic trasé i kreft. Vi viser at uttømming av GIPC-indusert autophagy i kreft i bukspyttkjertelen celler, som fremgår av oppregulering av den autophagy markør LC3II. Vi videre rapporterer at GIPC regulerer cellulære trafficking trasé ved å modulere sekresjon, biogenesis, og molekylære sammensetningen av exosomes. Vi identifiserte også involvering av GIPC på metabolsk stress trasé som regulerer autofagi og microvesicular Shedding, og observerte at GIPC status avgjør lasting av mobilnettet last i exosome. Videre har vi vist at overekspresjon av det medikamentresistensgenet ABCG2 i exosomes fra GIPC-utarmet kreft i bukspyttkjertelen celler. Vi viste også at utarming av GIPC fra kreftceller sensitivisert dem til gemcitabin behandling, en vei som kan utforskes som en potensiell terapeutisk strategi for å overvinne resistens i kreft
Citation. Bhattacharya S, Pal K, Sharma AK , Dutta SK, Lau JS, Yan IK, et al. (2014) GAIP Samhandle Protein C-Terminus Regulerer Autophagy og Exosome Biogenesis av bukspyttkjertelkreft gjennom stoffskifte. PLoS ONE 9 (12): e114409. doi: 10,1371 /journal.pone.0114409
Redaktør: Ramani Ramchandran, Medical College of Wisconsin, USA
mottatt: 25 april 2014; Godkjent: 07.11.2014; Publisert: 03.12.2014
Copyright: © 2014 Bhattacharya et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet er støttet av National Institutes of Health gir CA78383 og CA150190 (DM). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Macroautophagy, som vanligvis betegnes som autophagy, er en essensiell prosess katabolsk at celler gjennomføre i forskjellige biologiske og fysiologiske aktiviteter [1], [2]. Under normale cellulære betingelser, opprettholder denne prosess cellulært vev og homeostase på en beskyttende måte ved resirkulering og nedbrytende cellulære komponenter under celledød [2] – [5]. Tidligere ble det antatt at autophagosome, en dobbel-membraned vesikkel, omslutter organ tilfeldig [1], [2], [5]; Imidlertid har nyere studier vist at valg av organeller er regissert av laste spesifikke faktorer [6]. I tillegg spiller autophagy en viktig rolle i mange sykdomsprosesser, inkludert kreft [7]. I flere krefttyper kan autophagy påvirke initiering og progresjon av sykdom [8], [9] og fremme tumorutvikling under metabolsk stress av hypoksi. Fordi mutasjoner av autofagi relaterte gener har blitt rapportert i kreft hos mennesker [10], [11], studier har fokusert på genetisk og kjemisk hemming av autofagi som en terapeutisk strategi [12].
GAIP samspill protein C- terminus (GIPC) ble først identifisert som et samspill partner av GTPase aktiverende protein RGS-GAIP for G-proteinkoblet reseptor subenhet GI alpha [13]. Den PDZ domene GIPC stabiliserer mange trans proteiner, inkludert Glut1 transporter, Semaphorin-F, neuropilin-en, TAX viral protein, dopamin D2 og D3, og IGF1R [14] – [19]. Mens de fleste av PDZ domene-bindende ligander for GIPC er transmembrane proteiner, flere av dem er cytosoliske proteiner, så som APPL1 og RGS19 [13], [20]. Funksjonelt er det N-terminale regionen GIPC involvert i dimerisering og den C-terminale regionen GIPC samhandler med myosin VI (MYO6) [21], [22], fremhever sin rolle som en adapter molekyl for lasting PDZ domene målrettet last på MYO6 motor protein for transport. GIPC er også involvert i smugling av ulike trans proteiner til endocytiske vesikler og avgjørende for smugling av interninte under cellemigrasjon, angiogenese, og cytokinese [23] – [25]. Forhøyede nivåer av GIPC uttrykk er rapportert i flere kreftformer, blant annet i bukspyttkjertelen og brystkreft, fremme deres mobilnettet spredning og overlevelse [19], [26] – [30]. Motsatt, uttømming av GIPC i kreftceller hemmer spredning og fremmer apoptose. Knockdown av GIPC resultater i G
2 cellesyklus arrest og reduserer dødelighet i MDA-MB231 celler, videre tyder rolle GIPC i cytokinese og cellemigrasjon [23], [31].
Exosomes er intracellulære vesikler (40-100 nm) som kreves for interkommunikasjon i flercellede organismer [23]. Den molekylære maskineri involvert i exosome biogenesis omfatter fire multiprotein komplekser kjent som endosomal sortering kompleks ansvarlig for transport (ESCRT) -0, -I, -II og-III og tilbehør proteiner som Alix og VPS4. Den ESCRT-0, -I, og -II komplekser gjenkjenne og binder ubiquitinmolekyler membran proteiner på endosomal begrense membranen, mens ESCRT-III-komplekset er ansvarlig for membran spirende og selve fjerningen av intraluminale vesikler (ILVs) [32]. Nylig, Alix (også kjent som PDCD6IP) ble funksjonelt knyttet til exosome biogenesis gjennom sitt samspill med TSG101 og CHMP4 proteiner [33] – [35]. En fersk studie antyder at dannelse og frigjøring av arrestin domene som inneholder protein 1-mediert mikrovesikler (ARMMs) på plasmamembranen avhenger av rekruttering av TSG101 protein [36].
Det er vist at GIPC spiller en viktig rolle i cellulære trafficking. Spesielt GIPC fungerer som et stillas for å kontrollere reseptor-mediert menneskehandel [20], [22], [37] og etter reseptor intern, GIPC knytter forbigående med en pool av endocytiske vesikler nær plasmamembranen [15]. Exosome biogenesis samt dannelsen av autophagosome innebærer endocytotic blemmer. Imidlertid er det ingen klare bevis for at disse to mekanismer for vesikkeldannelse krysstale med hverandre [38]. I denne studien, avslører vi en unik regulerende rolle GIPC på autofagi gjennom metabolske veier og modulering av exosome sekresjon. Vi viser også at utarming av GIPC fra kreftceller sensitizes dem til cellegifter som gemcitabin, en vei som kan bli ytterligere utforsket som en potensiell terapeutisk strategi mot narkotika motstand.
Materialer og metoder
cellekultur GIPC knockdown cellelinjer
bukspyttkjertelkreft cellelinjer ASPC-en og Panc-en ble kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD). Cellelinjer ble dyrket i RPMI 1640 medium (for ASPC-1) eller høy glukose DMEM (for PANC-1) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS), 5% L-glutamin og 1% penicillin /streptomycin (Invitrogen, Carlsbad, CA). Celler ble opprettholdt ved 37 ° C i en atmosfære inneholdende 95% luft-5% CO
2 (v /v). Stabile GIPC knockdown cellelinjer ble generert ved hjelp lentivirus shRNA. Lentivirus Partiklene ble fremstilt ved bruk av 293T-celler kotransfektert med gag-pol ekspresjonsplasmid pCMVΔ8.91, den VSVG konvolutten ekspresjonsplasmidet PMD-G, og vektorplasmidet pLKO.1 som koder cDNA for ekspresjon av GIPC /Synectin shRNA (5 «-CCGGGCAAATGCAATAATGCCCTCACTCGAGTGAG-GGCAT-TATTGCATTTGCTTTTTG-3»). GIPC /Synectin shRNA i pLKO.1 ble kjøpt fra Åpne Biosystems. Supernatanten ble oppsamlet 48 timer etter transfeksjon og frosset ved -80 ° C. PANC-1 eller ASPC-1-cellene ble så infisert natten over ved 37 ° C og stabile kolonier ble isolert etter valg puromycin (1 pg /ml). For å sikre effektiviteten av GIPC /Synectin knockdown, ble proteinlysatene analysert ved immunblot for GIPC /Synectin. Kontrollceller ble transdusert med en tom vektor protein. Retroviral pBABE-puro mCherry-EGFP-LC3B plasmid fra Addgene (Addgene plasmid 22418) ble brukt til å forberede retrovirus partikler ved hjelp av 293T celler etter standard prosedyre. ASPC-1 eller PANC-1-celler ble infisert med retroviruspartikler og stabile kolonier ble isolert etter valg puromycin (1 pg /ml). Eksperimenter ble utført ved 70-80% konfluens celle og bekreftet i minst tre uavhengige eksperimenter.
RNA-interferens, transfeksjon
Etter en 24-timers inkubering med antibiotika-fritt medium ble cellene transfektert med anti-GIPC liten interfererende RNA (siRNA) ved hjelp av DharmaFECT 2 Transfeksjon Reagent (Dharmacon, Lafayette, CO). Sytti-to til 96 timer etter transfeksjon, ble GIPC knockdown bekreftet ved Western blot analyse. En lignende siRNA tilnærming ble vedtatt for anti-Atg7 og anti-Beclin1 knockdown. For glukose sult forsøk ble begge styre siRNA og GIPC siRNA behandlet ASPC-1-celler holdes i glukosefritt RPMI supplert med 10% FBS for siste 16 timer av den 96 timers eksperimentet. For autophagic flux eksperimenter, både kontroll siRNA og GIPC siRNA behandlet ASPC-en og PANC-1 celler ble behandlet med angitte konsentrasjoner av pepstatin-A og E-64d for slutt 24 h 96 h forsøket.
Antistoffer og immunoblot analyse
Hele cellelysater ble utarbeidet i NP-40 lysebuffer supplert med en proteasehemmer cocktail (Sigma, St. Louis, MO) og Halt fosfatase inhibitor cocktail (Thermo Scientific, Waltham, MA). Supernatanten ble oppsamlet etter sentrifugering ved 13 000 rpm i 10 min ved 4 ° C og separert ved SDS-PAGE. Anti-GIPC, anti-PLCγ, og pepperrot peroksidase-konjugert sekundære antistoffer ble innkjøpt fra Santa Cruz Biotechnology. Antistoffer mot ABCG2, mTOR, fosfor-mTOR, p70S6K, fosfo-p70S6K, Atg7, Beclin1, AMPK-α, og fosfor-AMPK-α ble kjøpt fra cellesignalisering Technologies. Anti-CHMP4b og anti-TSG101 ble kjøpt fra Abcam; anti-β-actin ble kjøpt fra Sigma; og Alix antistoff ble kjøpt fra Thermo Scientific. Western blot ble utviklet ved hjelp av SuperSignal West Pico substrat (Thermo Scientific) og immunoutfellinger ble utført som tidligere beskrevet [19].
Immunofluorescence
Celler (2 x 10
4) ble sådd på et dekkglass i antibiotika-fritt medium i 24 timer. Cellene ble så transfektert med GIPC siRNA eller kryptert siRNA (Dharmacon) og mediet ble forandret 48 timer post-transfeksjon. Etter 96 timer ble cellene vasket og fiksert med 4% paraformaldehyd. Etter blokkering med 10% geiteserum i 15 minutter, ble cellene permeabilisert med 0,2% Triton X-100 ved romtemperatur i 5 min. Glassene ble deretter farget med primære antistoffer mot LC3 i 2 timer i 1% geiteserum. Etter inkubering av lysbilder med sekundære antistoffer konjugert til AlexaFluor 488 (1:200, Life Technologies, Grand Island, NY) i 1 time, ble objektglass montert med Vectashield (Vector Laboratories, Burlingame, CA) inneholdende 4 «, 6-diamidino-2- -phenylindole (DAPI) og konfokalmikroskopi ble utført. I et annet sett av eksperimenter ble celler som uttrykker mCherry-EGFP-LC3B sådd i Dekk og transfektert med GIPC siRNA eller kryptert siRNA. Etter 96 timer ble cellene vasket og fiksert med 4% paraformaldehyd. Objektglassene ble montert med Vectashield innehold DAPI som tidligere beskrevet.
glukoseopptak og Intracellulær glukosemåling assay
Stabil celler, transfektert med enten GIPC shRNA eller kontrollvektor, ble sådd i 6-brønns plater og dyrket i 48 timer. Glukoseopptaket ble målt ved bruk av glukoseopptak cellebaserte analysen Kit (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI) ved hjelp av et fluorescensmerket deoksyglukose analog. For en intracellulær glukosekonsentrasjonsmåling, ble Amplex Red glukoseanalysesett (Life Technologies) som brukes sammen med en liten endring til produsentens protokoll som tidligere beskrevet [39]. Celler ble oppsamlet ved sentrifugering og den resulterende cellepellet ble vasket to ganger i PBS og dispergert i 1 x reaksjonsbuffer fra settet. Celler ble lysert ved sonikering sonde med tre sykluser med 10 sekunder på, 30 sekunder av ved 20% effekt under kontinuerlig holdes på is. Femti pl av reaksjonsløsning (10 mM Amplex Red, 10 U /ml HRP, 100 U /ml glukoseoksydase, 50 mM natriumfosfatbuffer, pH 7,4) ble tilsatt til 50 ul cellelysat i en 96-brønns plate og inkubert i mørket ved 37 ° C i 30 min. Fluorescens (eksitasjon: 544, Emisjon: 590). Deretter ble målt ved hjelp av en SpectraMax plateleser og verdier ble uttrykt som relative Fluorescens Units (RFU) /mg protein
Exosome isolasjon
Exosomes var isolert fra kondisjonert medium av PANC-1 og ASPC-1-celler ved differensiell sentrifugering. Celler ble dyrket til 70-80% konfluens og mediet ble erstattet med media inneholdende 10% føtalt bovint serum berøvet mikropartikler ved sentrifugering (60 minutter ved 100 000 x
g
). Etter 72 timers inkubasjon, ble supernatanter samlet og ryddet for mobilnettet rusk og døde celler med to påfølgende spinn ved 4 ° C, 3000 ×
g
i 10 min. Ryddet supernatanter ble deretter ytterligere sentrifugert ved 4 ° C, 60.000 x
g
i 70 min. De resulterende exosome pelleter ble vasket med fosfat-bufret saltvann (PBS) løsning, og deretter igjen sentrifugert ved 4 ° C, 100000 x
g
i 70 min. De endelige exosome pellets ble resuspendert i PBS eller vann, avhengig av forsøket.
Elektronmikros
Nylaget exosomes resuspendert i vann ble ytterligere spredt i Trump fiksativ løsning, bestående av fire % (v) formaldehyd og 1% (volum) glutaraldehyd i 0,1 M fosfatbuffer ved pH 7,2. De exosomes ble deretter vasket med 0,1 M fosfatbuffer, 1% osmiumtetroksyd i 0,1 M fosfatbuffer, destillert vann, 2% (volum) uranylacetat, destillert vann, etanol og absolutt aceton i rekkefølge. Endelig exosomes ble plassert på en TEM rutenett for undersøkelse ved hjelp av en
Philips Technai
T12.
proteomikk analyse
Protein identifikasjon ble utført via i-gel trypsin fordøyelsen hjelp nanoLC- MS /MS med hybrid orbitrap /lineær ionefelle massespektrometri. I korthet protein fra exosomes av GIPC-manglende stabile cellelinjer ble løst på en 4-12% NuPage gel (MOPS-buffer) med 20 ul SDS-PAGE prøvebuffer inneholdende 50 mM DTT. Gelene ble farget med BIOSAFE kolloidal blå fargestoff (BioRad) og de ønskede bånd ble skåret ut fra gelen for massespektrometri-analyse ved anvendelse av følgende fremgangsmåter. Kolloidale blå fargede gel bånd ble avfarget i 50% acetonitril /50 mM Tris, pH 8,1 inntil den var klar. Båndene ble deretter redusert med 50 mM TCEP /50 mM Tris, pH 8,1 ved 55 ° C i 40 min og alkylert med 20 mM jodacetamid /50 mM Tris, pH 8,1 ved romtemperatur i 60 min i mørket. Proteiner ble spaltet
in situ
med 30 ul (0,005 ug /ul) trypsin (Promega Corporation, Madison, WI) i 20 mM Tris pH 8,1 /0,0002% Zwittergent 3-16, ved 55 ° C i 2 timer, etterfulgt av peptid ekstraksjon med 10 ul 2% trifluoreddiksyre og deretter 60 ul acetonitril. De samlede ekstrakter ble konsentrert til mindre enn 5 pl på en Speed-Vac konsentrator (Savant Instruments, Holbrook, New York) og deretter brakt opp i 0,2% trifluoreddiksyre for protein identifikasjon av nano-flow væskekromatografi elektro tandem massespektrometri (nanoLC-ESI -MS /MS) med en ThermoFinnigan Orbitrap Elite hybrid Mass Spectrometer (Thermo Fisher Scientific, Bremen, Tyskland) koblet til en Eksigent nanoLC-2D HPLC system (Eksigent, Dublin, CA). Den fordøyd peptid blanding ble fylt på en 250 nl OPTI-PAK felle (Optimaliser Technologies, Oregon City, OR), spesialpakket med Michrom magi C8 fast fase (Michrom Bioressurser, Auburn, CA). Kromatografi ble utført ved anvendelse av 0,2% maursyre i både et oppløsningsmiddel (98% vann /2% acetonitril) og B løsningsmiddel (80% acetonitril /10% isopropanol /10% vann), og en 2% B til 45% B-gradient i løpet 70 min på 300 nl /min gjennom en håndpakket PicoFrit (New Mål, Woburn, MA) 75 mikrometer × 200 mm kolonne (Michrom magi C18, tre mikrometer). Den Orbitrap Elite massespektrometer eksperiment ble satt til å utføre en fullstendig FT skanning fra 340-1500 m /z med oppløsning satt til 120 000 (ved 400 m /z), etterfulgt av lineær ion trap CID-MS /MS-skanninger på toppen femten ioner. Dynamisk utelukkelse ble satt til 1 og utvalgte ioner ble plassert på en ekskluderingsliste i 30 sekunder
Database søker
Tandem massespektra ble hentet av msconvert (versjon 3.0.4019, ProteoWizard). Og alle MS /MS-prøvene ble analysert ved hjelp av Mascot (Matrix Science, London, UK, versjon 2.4.0), Sequest (Thermo Fisher Scientific, versjon 27, rev. 12) og X1 Tandem (GPM, thegpm.org; versjon CYCLONE (2010,12 .01.1)). Mascot, Sequest, og X1 Tandem ble satt opp for å søke i februar 2012 Swissprot database, begrenset til menneske med en lokkedue omvendt database, og forutsatt at fordøyelsen enzymet trypsin. Mascot og X1 Tandem ble søkt med et fragment ion masse toleranse for 0,60 Da og en forelder ion toleranse på 10,0 PPM. Sequest ble søkt med et fragment ion masse toleranse på 0,60 og en forelder ion toleranse på 0,01 Da. Oksidasjon av metionin og iodoacetamide derivat av cystein ble spesifisert i Mascot, Sequest, og X1 Tandem som variable modifikasjoner.
RNA isolering og kvantitativ PCR-analyse
Total RNA ble isolert fra cellelinjer og exosomes hjelp den miRCURY RNA Isolation Kit – Cell Plant (Exiqon, Woburn, MA) etterfulgt med spektrofotometri (Nanodrop, Thermo Scientific) for kvantifisering og kvalitativ analyse. Like mengder total RNA ble revers-transkribert av oligo (dT) priming bruker iScript cDNA Synthesis kit (Bio-Rad, Hercules, CA) etter produsentens anvisninger. Real-time PCR ble utført ved hjelp av ABI 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, California) og SYBR Grønn PCR Master Mix (Applied Biosystems) som beskrevet tidligere [40]. Glut1 og β-Actin primere ble kjøpt fra SABiosciences (Frederick, MD).
Drug følsomhet analysen
I korthet, 5 × 10
3 celler ble sådd per brønn i tre eksemplarer, i 96 -vel flatbunnede plater med 100 mL av medium. Etter 24 timer ble varierende konsentrasjoner av gemcitabin (ug /ml) tilsatt, og cellene ble inkubert i ytterligere 72 timer. Ved slutten av behandlingsperioden ble 20 ul av MTS-løsning inneholdende PMS (MTS:. PMS = 20:01 volumforhold) ble tilsatt til hver brønn og cellene ble inkubert ved 37 ° C i 1 til 2 timer. Absorbansen ved 490 nm ble målt ved anvendelse av en SpectraFluor PLUS (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) og den halve maksimale inhiberende konsentrasjon (IC50) verdier ble beregnet som konsentrasjoner som tilsvarer en 50% reduksjon av cellevekst. Før medikamentsensitivitet testing, ble cellelevedyktigheten bestemt ved MTS-analysen (Promega, Madison, WI).
Statistisk analyse
Dataene i stolpediagrammene representerer gjennomsnitt ± standardavvik av minst tre uavhengige forsøk, hvert utført med triplikate prøver. Statistiske analyser ble utført ved hjelp av en Student t test, med en to-tailed verdi av P 0,05 til å bli vurdert som signifikante
Resultater
GIPC uttømming induserer autofagi i kreft i bukspyttkjertelen celler
Utnytte GIPC-utarmet ASPC-en og PANC-1 bukspyttkjertelen cellelinjer, undersøkte vi om GIPC modulert autofagi ved å vurdere autofagi relaterte microtubule-assosiert protein lett kjede 3 (LC3) konverteringer (LC3-i til LC3-II) via Western blot-analyse. Det er vel kjent at omdannelsen av den lette kjede 3-I (LC3-I), ved konjugering til fosfatidyletanolamin (PE), danner konjugatet lettkjedet 3′-II (LC3-II) som deretter rekruttert til membraner av autophagosomes [13], [20]. LC3 ekspresjon har blitt mye brukt til å overvåke og fastslå tilstanden av autophagy som mengden av LC3II korrelerer med antallet autophagosomes [41]. Etter en grundig undersøkelse av LC3-II-nivået i de pankreatiske stabile cellelinjer, observerte vi en forhøyet LC3-II-nivå i celler som mangler for GIPC, noe som indikerer aktivering av autophagy (figur 1A). Vi har også observert en økning i LC3-II (grønn) puncta dannelse i GIPC-utarmet celler ved immunfluorescens studie (figur 1B). GIPC knockdown i nærvær av lysosomale proteasehemmere, pepstatin-A og E-64d, ytterligere øket LC3-II på en doseavhengig måte sammenlignet med GIPC knockdown alene, noe som indikerer forbedring av autophagic fluks (figur S1A). Videre har vi brukt en tandem fusjonsprotein mCherry-EGFP-LC3B inneholder syre-insensitive mCherry og syre-sensitive EGFP som autophagic fluks reporter system [42], [43]. Under autophagosome formasjonen, er begge EGFP og mCherry oppdaget i autophagosomes som vises som gule puncta. Men når autophagosomes sikring med lysosomer, lyser den grønne fluorescens tapt på grunn av nedbrytning av EGFP ved syre lysosomale proteaser som resulterer bare rødt puncta. Derfor er nærværet av både gult og rødt puncta angir en funksjonell autophagic fluks prosess. Her har vi brukt både ASPC-en og PANC-en cellelinjer stabilt uttrykker mCherry-EGFP-LC3B vise økningen i både gult og rødt puncta på GIPC knockdown som også indikert en økning i autophagic fluks (Figur S1B). Disse funnene antydet at GIPC knockdown induserer dannelsen av autophagosomes i kreft i bukspyttkjertelen celler.
A) ASPC-1 og PANC-1 celler ble infisert med lentivirus uttrykker shRNAs til GIPC og egge kontroll. En like stor mengde av hel-cellelysater fra ASPC-1 og PANC-1 GIPC utarmet celler ble analysert ved hjelp av immunoblotting (IB) med antistoffene for GIPC og LC3II. β-Actin brukes som lasting kontroll. B) En representativ immunofluorescens-analyse av PANC-1-celler for ekspresjon av LC3 II (grønn) i GIPC utarmet PANC-1 celler sammenlignet med kontrollceller. Celler ble kontra med DAPI (blå).
Vi undersøkte videre effekten av to autofagi relaterte gener, Atg7 og Beclin1 på GIPC-mediert autophagic regulering. For å vurdere samspillet mellom Atg7 og Beclin1, vi redusert nivå av Atg7 og Beclin1 av RNA interferens (RNAi) i begge PANC-1 og ASPC-1 celler. Som vist i figur 2A og 2B, hadde vi ikke observere noen signifikant endring i Atg7 eller Beclin1 uttrykk etter GIPC reduksjon i både kreft i bukspyttkjertelen celler. Som Atg7 og Beclin1 er to viktige komponenter for autophagosome biogenesis, vi også observert en nedgang i LC3 II konvertering fra LC3 jeg på knockdown av Atg7 og Beclin1 i både kreft i bukspyttkjertelen celler. I ASPC-1 celler, la vi merke til at induksjon av autofagi med utarming av GIPC ble betydelig vanskeliggjort ved reduksjon av Atg7 og Beclin1. Tvert imot, i PANC-1-celler, Atg7 og Beclin1 kunne ikke påvirke LC3II omdannelse lagt GIPC uttømming. Vi ytterligere utforsket sammenslutning av GIPC med Atg7 og Beclin1 av co-immunoutfellingsstudier eksperimenter og fant Beclin1 å være i samme kompleks med GIPC (Tall 2C), men fikk ikke avgjørende resultat for Atg7 (data ikke vist).
A) Immunoblot-analyse av den Atg7 uttrykk i ASPC-1 og PANC-1-cellelysater transfektert med siRNA til GIPC, Atg7 og egge kontroll. β-Actin brukes som lasting kontroll. B) Immun analyse av Beclin1 uttrykk i ASPC-en og PANC-1 cellelysater transfektert med siRNA til GIPC, Beclin1 og egge kontroll. β-Actin brukes som lasting kontroll. C) Co-immunoprecipitation (IP) av PANC-1 cellelysater transfektert med siRNA til GIPC og egge kontroll ved hjelp GIPC antistoff. Immunkomplekser ble analysert ved immunoblotting (IB) med antistoffer mot Beclin1 og GIPC.
GIPC formidler autofagi gjennom metabolsk stress trasé
Glut1 er assosiert med glukoseopptak i kreftceller og GIPC er kjent for å stabilisere Glut1 i cellemembranen som en PDZ domene-inneholdende interaksjon partner [14]. I denne forbindelse, undersøkte vi om å slå ned GIPC i kreft i bukspyttkjertelen celler ville destabilisere Glut1 og forstyrre glukoseopptak i disse cellene. Som ventet, har vi funnet en signifikant reduksjon i Glut1 ekspresjon i både mRNA og proteinnivå på GIPC knockdown i ASPC-1 og PANC-1-celler (figur 3A 0,01). D) Intracellulære glukosenivåene ble også betydelig redusert i GIPC utarmet ASPC-en og PANC-1 cellelinjer som bekrefter rollen GIPC i glukosemetabolismen (** betyr p 0,01)
A) Immun. av cellelysatene fra GIPC oppbrukt og tak ASPC-1 og PANC-1-celler blir probet med p-AMPK-α, total AMPK-α. β-Actin brukes som lasting kontroll. B) Videre immunoblot av cellelysater ovenfra tilstand ble analysert med p-mTOR, total mTOR, p-p70S6K og total p70S6K. β-Actin brukes som lasting kontroll.
Vi undersøkte videre den molekylære mekanismen for autofagi ved å undersøke molekylære av AMPK-α veien. Vi observerte reduserte nivåer av mTOR fosforylering etter GIPC knockdown i ASPC-en og PANC-1 celler; men det gjorde total mTOR uttrykk ikke endres. I tillegg observerte vi en reduksjon på kjent nedstrøms effektor av mTOR, fosfo-p70S6K til p70S6k-forhold, i GIPC-utarmet cellelysater sammenlignet med kontrollparentale celler (figur 4B). Fjerning av ekstracellulære glukose ytterligere forbedret AMPK-α fosforylering og redusert mTOR fosforylering samt p70S6K fosforylering (figur S2). Imidlertid LC3-nivåene ble redusert ved fjerning av ekstracellulær glukose som bekrefter med tidligere rapporter [46] som tyder ekstracellulære glukosefjerning dreper cellene enten ved apoptose eller nekrose i stedet for å indusere autophagy som en prosurvival effekt. Til sammen våre resultater tyder på at GIPC styrer autofagi gjennom regulering av metabolske veier i bukspyttkjertelen adenokarcinomceller.
GIPC påvirker exosome sekresjon og biogenesis
Med exosomes samlet inn fra de stabile transfektanter, vi utførte enzymatiske analyser for acetylcholin-esterase-aktivitet som tidligere beskrevet [14]. Denne analysen avslørte en større overflod av exosomes i det kondisjonerte medium av GIPC-mangelcellelinjer. En 3,5 eller større gangers økning i exosome produksjonen ble observert i kondisjonert medium oppsamlet fra GIPC-utarmet ASPC-1-celler sammenlignet med kontrollen (figur 5A). Vi har fått lignende resultat med GIPC-utarmet PANC-1 celler i tillegg (data ikke vist). Vi har også bestemt at konsentrasjonen av total RNA i disse exosomes som et annet mål på exosome overflod og funnet lignende resultater (Tall 5B 5C). Nanopartikkel sporing analyse bruker NanoSight LM10 bekreftet størrelsen distribusjon av våre exosome forberedelser. Med en modus på ca. 100 nm, deres størrelse var i overensstemmelse med den aktuelle exosome definisjonen (figur 5D).
Exosomes ble isolert fra dyrkningsmedier av ASPC-1 og PANC-1 GIPC utarmet og kontrollcellekultur. For kvalitativ måling samme mengde celler ble sådd ut på kulturskåler. A) En sammenligning av aktiviteten av acetylcholin-esterase er avbildet for exosomes samlet fra GIPC oppbrukt og tak ASPC-1 cellelinje. B & C) En sammenligning av total RNA innholdet i exosome preparat fra ASPC-1 og PANC-1 cellekultur blir vist. D) En representativ størrelsefordeling profil av exosome preparatet oppnådd ved bruk av Nanosight. E) En representativ transmisjonselektronmikroskop (TEM) av exosomes er vist i denne figuren. Scale bar er 500 nm. F) En høyere forstørrelse TEM-bilde av exosomes er presentert. Målestokken er 200 nm. G) Immun utført med celler lysates samlet inn fra GIPC knockdown celler samt kontrollceller ble analysert med TSG 101, Alix, og CHMP 4B. PLC γ brukes som lasting kontroll.
Vi deretter utført morfologisk karakterisering av exosome forberedelse med en ultra-strukturell analyse av exosome pellets av heavy metal negativ farging og transmisjonselektronmikroskopi (TEM). Analyse av TEM bilder bekreftet exosome dimensjoner i våre eksempler. Figur 5E viser den typiske morfologi av den samlede exosome populasjonen i en lavere TEM forstørrelse. Videre analyse av TEM bilder på høyere forstørrelse bekreftet den typiske velvet form strukturen i exosomes (figur 5F). Disse analysene bekreftet at tilstedeværelse eller fravær av GIPC ikke påvirke exosome morfologi.
For å bekrefte om de økte exosomes i GIPC-utarmet celler korrelerte med aktivering av exosome biosyntesen maskiner, vi sjekket uttrykket av viktige gener ( Alix, TSG101, CHMP4B) involvert i exosome biogenesis av immunoblot. Vi observerte en økt uttrykk av Alix, TSG101, og CHMP4B i GIPC knockdown celler sammenlignet med kontrollceller (Figur 5G).
GIPC påvirker exosome innhold og sensitizes bukspyttkjertelkreft cellelinjer til cellegifter
å sammenligne exosome innhold i GIPC knockdown og villtype celler, vi utført proteomikk analyser på exosomes samlet inn fra PANC-1 stabile cellelinjer. For proteom analyse, ble protein ekstrahert fra utskilte exosomes og vi fant at innholdet av exosomes sterkt variert avhengig GIPC status. Til støtte for robustheten og følsomheten av de analysemetoder, proteomics data bekreftet fraværet av GIPC protein i exosomes isolert fra GIPC manglende celler, men ikke i kontrollprøvene. Dette viste også for første gang i nærvær av GIPC i exosomes. Videre proteomikk analyse av exosomes isolert fra PANC-1 stabil-celler viste en betydelig anrikning av gener involvert i medikamentresistens (data ikke vist).
