Abstract
Bakgrunn
Selv om metastatisk tykktarmskreft er en ledende årsak til kreft dødsfall på verdensbasis, de molekylære mekanismene som gjør at kolon kreftceller til å spre fortsatt uklare. Emerging bevis tyder på at metastatiske celler utvikle ved tilranet transkripsjons nettverk fra embryonale stamceller (ES) celler til rette for en epitelial-mesenchymale overgang (EMT), invasjon, og metastatisk progresjon. Tidligere studier identifisert HMGA1 som en nøkkel transkripsjonsfaktor beriket i ES-celler, tykktarmskreft og andre aggressive svulster, selv om dens rolle i disse innstillingene er dårlig forstått.
Metoder /hovedfunnene
For å finne ut hvordan HMGA1 funksjoner i metastatisk kreft i tykktarmen, vi manipulert
HMGA1
uttrykk i transgene mus og tykktarm kreft celler. Vi oppdaget at HMGA1 driver proliferative endringer, avvikende krypten dannelse, og intestinal polypose i transgene mus. I tykktarm kreft cellelinjer fra dårlig differensierte, metastatiske svulster, knock-down av HMGA1 blokker forankringsuavhengig cellevekst, migrasjon, invasjon, xenograft tumordannelse og tredimensjonal colonosphere formasjon. Hemme
HMGA1
uttrykk blokker tumorigenesis på begrensende fortynninger, i samsvar med uttømming av tumor-initiator celler i knock-down celler. Knock-down av HMGA1 hemmer også metastatisk progresjon til lever
in vivo
. I metastatiske tykktarm kreft celler, induserer HMGA1 uttrykk for
Twist1
, et gen involvert i embryogenese, EMT, og tumorprogresjon, mens HMGA1 represses
E-cadherin
, et gen som er nedregulert under EMT og metastatisk progresjon. I tillegg
er HMGA1
blant de mest beriket genene i tykktarmskreft i forhold til normal slimhinne.
Konklusjoner
Våre funn viser for første gang at HMGA1 driver proliferative endringer og polypp formasjon i tarmen hos transgene mus og induserer metastatisk progresjon og stilk-lignende egenskaper i tykktarm kreft celler. Disse funnene tyder på at HMGA1 er en viktig regulator, både i metastatisk progresjon og opprettholdelse av en stilk lignende tilstand. Våre resultater tyder også på at HMGA1 eller nedstrøms trasé kan være rasjonelle terapeutiske mål i metastatisk, dårlig differensiert tykktarmskreft
Citation. Belton A, Gabrovsky A, Bae YK, Reeves R, Iacobuzio-Donahue C, Huso DL, et al. (2012) HMGA1 Induserer Intestinal polypose i transgene mus og drifter tumorprogresjon og stamcelleegenskaper i tykktarm kreft celler. PLoS ONE 7 (1): e30034. doi: 10,1371 /journal.pone.0030034
Redaktør: Wafik S. El-Deiry, Penn State Hershey Cancer Institute, USA
mottatt: 29 juli 2011; Godkjent: 12 desember 2011; Publisert: 20 januar 2012
Copyright: © 2012 Belton et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Funding kom fra National Institutes of Health (NIH) RO1CA092339 og R21CA2149550 til L. Resar, NIH T32HL007525 til A. Belton, og Maryland Stem Cell Research Fund til L. Resar og A. Belton. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
til tross for nylige fremskritt i tykktarmskreft screening og behandling, forblir metastatisk kolorektalcancer en ledende årsak til kreft dødsfall på verdensbasis [1] – [2]. De molekylære mekanismene som gjør at kreftceller til å metastasere er dårlig forstått, selv om nye bevis indikerer at transkripsjons nettverk kreves for stamcelleegenskaper under embryogenese er co-valgt i løpet av metastatisk progresjon [3] – [4]. Nyere studier identifisert HMGA1 som en nøkkel transkripsjonsfaktor anriket på humane embryonale stamceller (ES-celler) [3], hematopoetiske stamceller [5] – [8], ildfast leukemi [6] – [7], [9] og høyverdig /dårlig differensierte kreftformer fra bryst, hjerne, og blære [3]. Videre svulster overekspresjon
HMGA1 Hotell og åtte andre ES transkripsjonsfaktorgener hadde redusert overlevelse, og understreker viktigheten av disse genene i tumorprogresjon [3]. Flere nylig, fant vi at HMGA1 protein nivåer korrelerer med dårlig differensiering status og redusert overlevelse i kreft i bukspyttkjertelen, videre impliserer HMGA1 i en udifferensiert, stem-lignende tilstand og tumorprogresjon [10].
HMGA1
genet koder HMGA1a og HMGA1b kromatin remodeling proteiner, som fungerer til å modulere genekspresjon ved å endre kromatinstruktur og montering transkripsjonsfaktorer komplekser på bestemte arrangører [11] – [18]. Tidligere studier viser at HMGA1 induserer onkogene egenskaper i dyrkede celler [19] – [27] og fører til aggressive tumorer i transgene mus [9], [28] – [32]. De nøyaktige molekylære stier regulert HMGA1 i transformasjon, derimot, er bare begynner å dukke opp og studier for å belyse HMGA1 transkripsjons nettverk er sannsynlig å avdekke grunnleggende trasé som er involvert i tumorprogresjon og utvikling.
Her rapporterer vi for første tid at HMGA1 driver proliferative endringer og polypp formasjon i tarmen hos transgene mus og dirigerer molekylære stier viktige i tumorprogresjon og stamcelleegenskaper i humane tykktarmskreftceller. Samlet utgjør disse funnene tyder på at
HMGA1
fremmer tumorprogresjon hos tykktarmskreft ved å omprogrammere kolonepitelet til en stilk-lignende tilstand.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med en protokoll godkjent av Johns Hopkins University Animal Care og bruk Committee (protokoll # MO08M263). Alle mus ble plassert i et sterilt miljø hvor de hadde fri tilgang til mat og vann som beskrevet i våre institusjonelle retningslinjer.
Kvantitativ revers transkripsjon-PCR (QRT-PCR) analyse.
RNA var fremstilt som vi beskrevet [9], [27]. De primere for
HMGA1 product: [28],
Twist
,
vimentin
,
E-cadherin
,
FOXC2
,
Snail1
,
Slug
,
TCF-3
,
Twist1
,
Twist2
,
SFH1B
) var tidligere rapportert [4].
GAPDH
primere er kommersielt tilgjengelig (Applied Biosystems). QRT-PCR reaksjoner ble gjort i tre eksemplarer og gjentas minst en gang
Western analyse
Vest-analysene ble utført som vi beskrev [9], [19] -.. [20], [33 ] med en kommersiell HMGA1 antistoff (Abcam, katalog # AB4078) fortynnet 1:1000 og β-aktin (Cell Signaling, katalog # 4967) fortynnet 1:1000 som en endogen kontroll.
Cellelinjer linjer~~POS=HEADCOMP.
HCT116 (CCL-247, American Type Culture Collection) og SW480 (CCL-228, American Type Culture Collection) ble dyrket som anbefalt. Transfekterte celler ble valgt i puromycin (3 ug /ml)
vekstkurver
Cellular vekstrater ble bestemt som vi tidligere beskrevet [19] -.. [20], [26] – [ ,,,0],29], [33]
Anchorage uavhengig cellevekst i myke agar, migrasjon og invasjon analyser
Disse analysene ble utført som vi beskrev [19] -.. [20], [ ,,,0],26] – [28], med unntak av at migreringen-analysen ble utført med 60000 celler /brønn og invasjons analyser ble gjort med 20 ul vekstfaktor redusert matrigel
Colonosphere assay
Colonosphere analyser.. ble utført som tidligere beskrevet [34].
In vivo
metastase assay.
Denne analysen ble utført som tidligere beskrevet [35] med celler (10
5 ) injisert per mus (NOD /Shi-
SCID Twitter /IL-2Rγ
null;.. Jackson Laboratory)
Xenotransplantat tumorigenicity
Disse studiene ble gjort i naken (nu – /-) mus som vi beskrev [19] -.. [20]
vektorer
Den korte hårnål RNA (shRNA) forstyrrelser plasmid for
HMGA1
har blitt beskrevet [36]. Den tomme shRNA-vektoren ble anvendt som en kontroll.
Immunhistokjemisk analyse.
Vevssnitt (4 um tykke) fra tynn- og tykktarmen av transgene og kontrollmus ble samlet og deparaffinized i xylen og deretter hydrert i en gradert alkohol serien. Termisk induserte epitop gjenfinning ble utført i en autoklav i 10 minutter i natriumcitratbuffer (pH 6,0). Endogen peroksidaseaktivitet ble inaktivert ved inkubering av seksjonene i 4% H
2o
2 i 5 minutter. Etter skylling i fosfat-bufret saltvann, ble seksjonene inkubert med kanin-monoklonalt anti-Ki-67-antistoff (klon 30-9, Ventana, Tucson, AZ, katalog # 790-4286) i 1 time ved romtemperatur. Positiv farging ble visualisert med DAKO EnVision Plus-HRP deteksjon kit (DAKO, Carpinteria, CA) i henhold til produsentens instruksjoner. Ki-67-positive celler ble tellet i 5 tilfeldig utvalgte felter fra sammenlignbare områder i tynn- og tykktarmen fra transgene og kontrollmusene ved 20 x forstørrelse. Til sammen 100 krypter for hver mus ble talt fra farget seksjoner fra transgene og kontroll mus (2 mus /gruppe).
Cell morfologi og størrelse bestemmelser.
Celler ble belagt og lov til å vokse til 80% sammenflytning. Fotografier for morfologisk vurdering og diameter målingene ble oppnådd ved bruk av Zeiss Inverted M-scope med Olympus DP72 kamera og programvare (JHMI Confocal Facility). Minst fem tilfeldige felt ble fotografert for hver cellelinje med eller uten HMGA1 knock-down. Den største diameter (um) ble målt for 700-1000 celler fra hver gruppe. De største diameter var representert som gjennomsnittet ± standardavvik; signifikans ble bestemt ved hjelp av t-test.
Resultater
HMGA1a
transgene utvikle polypper og ekspansjon i stamcelle
For å definere rollen av HMGA1 i tumorigenesis, utviklet vi transgene mus med muse
hmga1a
transgen drevet av H2K promoter og immunglobulin mu enhancer [9], [27] – [29]. Som tidligere rapportert, alle mus bukke under for aggressiv lymfoid malignitet [9] og hunnene utvikle livmor sarkom [28] – [29]. For å avgjøre om HMGA1 fremmer neoplastisk transformasjon i tarmepitelet, undersøkte vi tarmen hos disse musene. Transgenet blir uttrykt i tynn- og tykktarmen fra 4 til 7 ganger høyere enn det som finnes i kontrollgruppen (fig. S1). Ved obduksjon tarmen er hyperemiske med en fortykket slimhinne og økt i vekt sammenlignet med kontroller (fig. 1A-D). Histologisk både store og små tarmen utstillings merket proliferative endringer, ektopisk krypten dannelse, og polypp dannelse (Fig. 1C-D). Det var en signifikant økning i Ki-67 i både tynn- og tykktarm, en markør for spredning (fig. 2A-B). Økningen i krypten tall antyder at disse musene kan ha utvidelse av tarmstamcelle [37].
(A)
HMGA1
transgene tarmen er hyperemiske med øket vekt sammenlignet med kontroller ( n = 7 i hver gruppe;. p = 0,000000138 av student t-test) (B) polyp tall i de transgene og kontrollene (n = 7 i hver gruppe; p = 0,000426 ved students t-test). Tarm sprer (høyre panel) er farget med 1,5% metylenblått å fremheve polypper for telling. (C) Hematoxylin og eosin farging av tynn- og tykktarmen viser markert proliferative endringer i transgene (bar = 50 uM). (D) Utvidelse av den proliferative sone resulterer i et diffust hyperplastisk opptreden av slimhinnen og cystically dilaterte krypter i transgene. Jo høyere makt utsikt over den lille tarmslimhinnen viser dannelsen av ektopisk krypten foci (piler).
(A) Ki-67 farging av små og store tarmen fra
HMGA1
transgene ( bunnplater) og kontrollmusene (topp paneler) viser en betydelig økning i Ki-67 immunoreaktivitets i
HMGA1
transgene (20 × forstørrelse). (B) Ki-67 positive celler i
HMGA1
transgene og kontroll mus ble oppregnet i krypter i tynn- og tykktarmen ved 20 × forstørrelse. Gjennomsnitt ± standardavvik av Ki-67 positive celler per krypt for 100 krypter for hvert par av mus på hvert sted er vist. Signifikante forskjeller ble påvist mellom transgene og kontroller i både små og store tarmen (p 0,00001, t-test) (C)
HMGA1
uttrykk ble undersøkt ved QRT-PCR og økt i den primære, høy klasse (klasse 3-4) kolon adenokarsinomer i forhold til tilstøtende, normal colonic vev.
β-actin
ble brukt til å kontrollere for lasting og normalt vev ble arbritrarily tildelt en verdi på 1,0. (D) Western blot-analyse for HMGA1 og kontroll protein (GAPDH) ble utført på 3 tumorer med tilstrekkelig prøven og viste økende HMGA1 protein med avtagende differensiering og økende invasivitet eller frank metastase. Karakteren, differensiering status, invasivitet, og tilstedeværelse av metastatisk sykdom er indikert.
HMGA1
er beriket i menneskelige kolon karsinom
Høye nivåer av HMGA1 protein eller mRNA ble rapportert i tykktarm kreft cellelinjer eller primære svulster i en liten pilotstudie [38]. For å avgjøre om
HMGA1
er overuttrykt i større studier av primære tykktarm kreft, spørres vi genuttrykk profilanalyse av primære tykktarm kreft fra seks uavhengige studier gjennom Oncomine ™ offentlig database (Compendia Bioscience, Ann Arbor, MI). Vi fant ut at
HMGA1
er høyanriket i colon adenokarsinom i forhold til normalt vev i 5/5 tidligere studier. I alle disse studiene var HMGA1 blant de 10% av beriket gener, og i 4 studier, var blant de øverste 1-3% av beriket gener. I en pilot av 10 primær, høy grad (grad III-IV) tykktarm kreft (en generøs gave fra Bert Vogel), fant vi at HMGA1 uttrykket ble økt i de fleste tykktarm kreft prøver (8/11) i forhold til tilstøtende normalt vev fra den samme pasient. Videre ble den midlere HMGA1 ekspresjon fra alle tumorer økte med 3 ganger sammenlignet med tilstøtende styre vev (Fig. 2C). Vi har også vurdert protein uttrykk i en undergruppe av primære colontumorer med tilstrekkelig materiale og fant de høyeste nivåene av HMGA1 protein i høy klasse, metastatiske svulster med ikke målbare nivåer i tilstøtende normalt vev (Fig. 2D).
HMGA1 er nødvendig for forankringsuavhengig cellevekst, migrasjon, invasjon, og tumorigenesis i tykktarm kreft celler
for å undersøke den funksjonelle rollen HMGA1 i tykktarmskreft, vi hemmet
HMGA1
uttrykk i to kolon kreft cellelinjer som stammer fra dårlig differensiert (grad 4), metastatisk tykktarm kreft (HCT116 og SW480) ved hjelp av en shRNA tilnærming. Transfeksjon av celler med en
HMGA1
shRNA vektor resulterte i en signifikant, stabil reduksjon i HMGA1-proteinet (fig. 3A) i de shRNA-celler sammenlignet med celler transfektert med kontroll-vektoren. Vi fant ut at knock-down av HMGA1 blokkert forankringsuavhengig cellevekst eller foci dannelse i soft agar, migrasjon og invasjon i både HCT116 og SW480 celler (Fig. 3B-C). Videre finnes det ikke noen tumorer dannet i nakne mus etter injeksjon av HCT116-celler med HMGA1 knock-down (10
5 eller 10
4 celler), mens tumorer dannet fra cellene transfektert med kontroll-vektorene (fig. 3D). Det var ingen signifikant forskjell i vekstrater i cellelinjer med eller uten HMGA1 knock-down
in vitro plakater (fig. S2), noe som indikerer at
HMGA1
shRNA var ikke giftig for kolon kreftceller. Disse resultater viser at HMGA1 driver cellulære egenskaper som er nødvendige for både startfasen (forankrings-uavhengig cellevekst, tumordannelse) og tumorprogresjon (migrasjon, invasjon).
(A) Transfeksjon med en shRNA knockdown vektor for
HMGA1
i spesielt aggressive, dårlig differensierte humane tarmkreftceller (HCT116 og SW480) resulterer i en signifikant reduksjon i HMGA1 protein. (B) Migrasjon og invasjon ble vurdert i kontroll (mørke søyler) og HMGA1 knock-down (åpen bar) tykktarmskreftceller (HCT116 og SW480). Grafen viser gjennomsnitt ± standardavvik fra 2 eksperimenter utført i tre eksemplarer. (P-verdier bestemmes av student t-tester er vist). (C) Anchorage uavhengig cellevekst i myk agar i kontroll (mørke søyler) og HMGA1 knock-down (åpne søyler) tykktarmskreftceller (HCT116 og SW480). All foci 50 mikrometer ble talt opp. Den søylediagram som viser gjennomsnitt ± standardavvik fra to forsøk utført i tre eksemplarer. (P-verdier bestemmes av student t-tester er vist). (D) Tabellen viser at knock-down av HMGA1 blokker svulstdannelse ved begrensende fortynninger. Bildet viser representative hårløse mus 4 uker etter injeksjon med kontroll eller HMGA1 knock-down i HCT116-celler (10
5 /injeksjon). Ingen svulster dannes i HMGA1 knock-down cellene.
HMGA1 avhengige stamcelleegenskaper i tykktarm kreft celler
Fordi
HMGA1
er beriket på stamceller [ ,,,0],5] – [8] og fører til endringer i mus tarmen som kan være forenlig med ekspansjon i tarmstamcelle, forsøkte vi å finne ut om
HMGA1
er involvert i stamcelleegenskaper i tykktarm kreft celler. For å oppnå dette, vurdert vi tredimensjonal colonosphere dannelsen i koloncancercellelinjer med eller uten knock-down av HMGA1. Vi har oppdaget en signifikant reduksjon i antall colonospheres både i HCT116 og SW460-celler med HMGA1 knock-down sammenlignet med kontroller (fig. 4A). Disse funnene tyder på at HMGA1 er nødvendig for dette stamcelle-fenotypen (tredimensjonal vekst) i tykktarmskreftceller. I begrensende fortynning tumorgenisitet eksperimenter, knock-down av HMGA1 blokkerte tumordannelse ved 104 eller 105-celler ble injisert, mens tumorer dannet i kontrollcellene. Svulster dannet i både kontroll og knock-down grupper hvis 106 celler ble injisert (Fig.3D). Disse resultatene indikerer at knock-down av HMGA1 utarmer de tumor-initiator celler.
(A) Tredimensjonal colonosphere formasjonen i kontroll (mørke søyler) og HMGA1 knock-down (åpne søyler) tykktarmskreftceller (HCT116 og SW480). Sfærer ble tellet etter 10 dager. Grafen viser gjennomsnitt ± standardavvik fra 3 eksperimenter utført i tre eksemplarer. (P-verdier bestemmes av student t-tester er vist). (B) metastaser i leveren ble tellet 5 uker etter injeksjon av kontroll (mørke søyler) eller HMGA1 knock-down (åpne søyler) HCT116-celler (1 x 10
5) inn i milten av nakne mus. Den søylediagram som viser gjennomsnitt ± standardavvik av metastaser fra to forsøk utført i tre eksemplarer. Musene injisert med kontrollceller (sort strek) ble sammenlignet med mus injisert med HMGA1 knock-down celler (åpne søyler, p-verdier bestemmes av student t-tester er vist). (C) Brutto fotografier av metastaser til leveren etter injeksjon av HCT116-celler i milten Judas mus. Den venstre Leveren er tatt fra en representativ mus injisert med kontrollceller; den høyre leveren tas fra en representativ mus injisert med HMGA1 knock-down-celler. Fotografier viser representative lever fra mus som fikk kontroll eller
HMGA1
knock-down celler. (D) Histologisk undersøkelse av lever bekreftet at de metastaser er betydelig økt fra milten injisert med kontrollceller sammenlignet med HMGA1 knock-down celler (Bar = 100 nm).
HMGA1 er nødvendig for metastatisk progresjon i tykktarmskreft
for å finne ut om HMGA1 er nødvendig for tumorprogresjon, vi brukte en preklinisk modell for metastatisk progresjon i tykktarm kreft [35]. HCT116 tykktarmskreftceller ble injisert direkte inn i milten av mus med immunsvikt og levermetastaser ble vurdert etter 5 uker. Påfallende, fant vi en markant nedgang i metastaser i leveren fra mus injisert med HMGA1 knock-down celler (Fig. 4B-C). Disse resultatene understreker den kritiske rollen HMGA1 i metastatisk progresjon i denne modellen.
HMGA1 induserer uttrykk for EMT gener
Twist1 Hotell og
vimentin
Fordi nyere studier knytter EMT til epitelial stamcelleegenskaper [3] – [4], vi søkt å fastslå om HMGA1 regulerer EMT gener i tykktarmskreft. For å oppnå dette, vurderte vi ekspresjonsnivåer av 11 gener som tidligere er vist å spille en viktig rolle i EMT og kreft initiator celler [4]. I HCT116 cellene, fant vi at både
Twist1 Hotell og
vimentin
ble betydelig undertrykt i celler med HMGA1 knock-down (Fig. 5A), noe som indikerer at HMGA1 induserer deres uttrykk. I SW480 celler,
E-cadherin
er oppregulert i knock-down celler, noe som tyder på at HMGA1 normalt undertrykker sitt uttrykk (Fig. 5B).
Twist1
ble også betydelig undertrykt i SW480 knock-down celler, men mindre enn det vi observerte i HCT116 cellene. Til sammen våre studier tyder på at HMGA1 fremmer tumorprogresjon gjennom transkripsjons nettverk som letter metastatisk progresjon og en stilk-lignende tilstand, i hvert fall delvis, ved å fremkalle den
Twist1 Hotell og
vimentin
, mens undertrykke
E-cadherin
. Av notatet, var det ingen endringer i cellen morfologi eller størrelse på knock-down-celler (fig. S3), noe som tyder på at nedregulering av HMGA1 i disse cellene er ikke tilstrekkelig til å indusere morfologiske forandringer forenlig med en tilbakevending til en mer epitelial tilstand når vokst som et enkeltlag. Som tidligere angitt, var det betydelige forandringer i vekstegenskaper når de dyrkes i en forankrings-uavhengig måte eller etter implantering i mus. Variasjonen i EMT gener modulert av HMGA1 i disse to forskjellige cellelinjer gjenspeiler sannsynlig ulike miljø og omprogrammering potensial i kreftcellene basert på underliggende genetiske og epigenetiske forandringer.
(A) I HCT116-celler,
Twist1
, og
vimentin
mRNA uttrykk ble undertrykt av QRT-PCR i HMGA1 knock-down cellene sammenlignet med kontrollceller.
E-cadherin Hotell og andre EMT gener ble ikke berørt i disse cellene. (P-verdier bestemmes av studentens t-testene er vist). (B) I SW480 celler,
vimentin
er undertrykt og
E-cadherin
induseres i cellene med HMGA1 knock-down. (P-verdier bestemmes av studentens t-testene er vist).
Diskusjoner
metastatisk kreft i tykktarmen er svært dødelig, og forekomsten er økende, særlig hos yngre individer [1] – [2]. Nåværende behandlingsformer er begrenset av fremveksten av metastatiske kreftceller som er resistente mot behandling. Nyere bevis tyder på at disse ildfaste celler utvikle fordi de co-opt mobiltelefonnettverkene er involvert i fosterutviklingen og bli i stand til metastasering og unndra terapi [3] – [4].
HMGA1
onkogen ble nylig identifisert som en nøkkel transkripsjonsfaktor beriket i ES-celler og høy klasse svulster med dårlige resultater [3], selv om dens funksjon i disse miljøene har vært unnvikende. Dette genet er medlem av
hmga
genet familien, som også inkluderer
HMGA1 product: [11] – [18] og
HMGA2 product: [31], [39] – [40]. Alle hmga proteiner er små, lav molekylvekt (og dermed høy mobilitet gruppe proteiner) med en AT-krok DNA-bindende domene som formidler binding til AT-rike regioner i mindre sporet av kromatin. HMGA1 og andre AT-krok proteiner er tenkt å fungere ved å modulere kromatinstruktur og genuttrykk [15] – [18], [41] – [42]. Her viser vi for første gang at
HMGA1
induserer proliferative endringer og polypp formasjon i tarmen hos transgene mus. Dessuten
HMGA1
er nødvendig for begrensende fortynning tumorigenesis
in vivo
sammen med 3-dimensjonal colonosphere formasjon
in vitro
, som begge er karakteristiske for fenotyper epiteliale stamceller. Videre inhibering
HMGA1
uttrykk blokker ikke bare transformasjons egenskaper som er involvert i startfasen (forankrings-uavhengig cellevekst, tumorgenisitet), men også cellulære egenskaper som fremmer metastatisk progresjon (invasjon og migrasjon). Vi har også oppdaget at
HMGA1
kreves for metastatisk progresjon til leveren
in vivo
. Spesielt har flere nyere studier har også vist at
HMGA1
er anriket i normale stamceller, inkludert embryonale og hematopoietiske stamceller [3] – [8], i tillegg til dårlig differensierte, eller ildfaste stammeliknende kreft [ ,,,0],8] – [32], som tyder på at HMGA1 bidrar til å drive en stilk lignende tilstand, både i normal utvikling og kreft.
HMGA1
er også sterkt uttrykk under embryogenese, med lav eller ikke målbare uttrykk i de differensierte, voksen vev [43].
For å finne ut hvordan HMGA1 orkestrerer tumorprogresjon og stamcelle fenotyper, undersøkte vi uttrykket av gener som tidligere har blitt vist seg å være viktig i EMT, utvikling og svulst initiativtaker celler [4]. I HCT116-celler, fant vi at HMGA1 opp-regulerer uttrykket av både
Twist1 Hotell og
vimentin
. I SW480 celler, HMGA1 også opp-regulerer
Twist1
, mens den undertrykker
E-cadherin
.
E-cadherin
endret ikke i HCT116 tykktarm kreft celler med knock-down av
HMGA1
, noe som kan gjenspeile stabil stanse av
E-cadherin
i disse mesenchymale, høyt metastatisk tykktarmskreft cellelinjer. Transkripsjons nettverk regulert av HMGA1 avhenger sannsynligvis av den cellulære miljøet og underliggende genetiske og epigenetiske egenskaper.
I sammendraget, våre undersøkelser gir første bevis knytter HMGA1 til cellulære egenskaper og transkripsjons nettverk viktige i stamceller, EMT, og metastatisk progresjon i tykktarmskreft. Selv om videre arbeid er nødvendig, disse resultatene understreker rollen HMGA1 som en viktig regulator i tumorprogresjon og en stilk lignende tilstand i tykktarmskreft og foreslår at målretting HMGA1 trasé kan være nyttig i behandling for tykktarmskreft. Fordi
HMGA1
er anriket i embryonale stamceller, vevsspesifikke stamceller, og praktisk talt alle aggressive tumorer undersøkt til dags dato, våre funn er sannsynligvis relevante ikke bare for forskjellige humane cancere, men også til normal utvikling.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
HMGA1
transgene uttrykk gjennom de små og store tarmen i transgene (TG) mus sammenlignet med villtype (WT) kontroller. QRT-PCR for
HMGA1 Hotell og kontroll genet,
GAPDH
, ble utført fra vev oppnådd gjennom tynntarmen (tolvfingertarmen, jejunum og ileum) og tykktarmen (colon ascendens, betegnet A tykktarm, og synkende kolon, utpekt D colon) fra TG og WT mus.
HMGA1
ekspresjon i TG tarmen er økt med 4 til 8 ganger over det som ble observert i de WT mus, som ble vilkårlig tildelt en verdi på 1. Alle QRT-PCR-reaksjoner ble utført i triplikat og gjentatt minst gang
doi:. 10,1371 /journal.pone.0030034.s001 plakater (TIF)
Figur S2.
Formerinasanalyse priser i HCT116 eller SW480 tykktarmskreftceller med HMGA1 knock-down eller kontroll vektor. (A) Vekstrater i HCT116 cellene transfektert med
HMGA1
shRNA vektor for å banke ned HMGA1 (røde firkanter) eller kontroll vektor (blå sirkler) viser en lignende spredning rate. Standard avvik er ≤10% og derfor ikke er synlig. (B) en vekstrate på de SW480 celler transfektert med kontroll vektor (blå sirkler) eller
HMGA1
shRNA vektor (røde firkanter) viser en lignende spredning rate. Standardavvik er ≤10% og derfor ikke synlig
doi:. 10,1371 /journal.pone.0030034.s002 plakater (TIF)
Figur S3.
HMGA1 knock-down resulterer i endringer i EMT gener uten endringer i cellen morfologi. (A) Knock-down av HMGA1 i HCT116-celler ikke fører til forandringer i cellemorfologi eller diameter sammenlignet med kontrollene. (B) Knock-down av HMGA1 i SW480 celler som ikke fører til forandringer i cellemorfologi eller diameter sammenlignet med kontrollene. Bildene ble tatt av levende celler ved hjelp av en 10 × mål; skala bar, 100 mikrometer
doi:. 10,1371 /journal.pone.0030034.s003 plakater (PPTX)
