Abstract
PKCα (protein kinase C alfa, PRKCA) er et viktig protein som er involvert i flere trinn av signalveier i lungen kreft, og microRNAs (mirnas) har også vist seg å delta i lunge kreftutvikling. Det er imidlertid ikke klart hvordan PKCα og mirnas er korrelert i sykdommen. I denne rapporten ønsket vi å identifisere nye mirnas som er rettet mot PKCα og å studere deres biologiske funksjon. Ved hjelp av bioinformatikk analyse, spådde vi en ny kandidat, MIR-203, og fant differensial uttrykk mønstre av MIR-203 og PKCα i humane lungekreft vev. Videre vi eksperimentelt validert MIR-203 som en direkte regulator av PKCα. Til slutt viste vi at målretting av PKCα av MIR-203 spilte en avgjørende rolle i å regulere celleproliferasjon, apoptose og migrasjon i lunge kreftceller. Oppsummert denne studien identifiserer en roman miRNA som er rettet mot PKCα og illustrerer at nedregulering av PKCα av MIR-203 modulerer biologiske prosesser i lungekreftceller
Citation. Wang C, Wang X, Liang H, Wang T Yan X, Cao M, et al. (2013) MIR-203 Hemmer celleproliferasjon og migrasjon av Lung Cancer Celler av målretting PKCα. PLoS ONE 8 (9): e73985. doi: 10,1371 /journal.pone.0073985
Redaktør: Jun Li, Sun Yat-sen University Medical School, Kina
mottatt: 8 april 2013; Godkjent: 24 juli 2013; Publisert: 10.09.2013
Copyright: © 2013 Wang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Natural Science Foundation National of China (nr. 81101330, 31271378, 81250044 og J1103512) og Foundation Natural Science i Jiangsu-provinsen (nr. BK2011013 og BK2012014). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
lungekreft er den ledende årsak til kreft-relaterte dødsfall på verdensbasis, og ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) står for ca 80% av alle tilfeller [1]. Flertallet av lungekreft (56%) blir diagnostisert ved en fjerntliggende stadium fordi tidlig sykdom er vanligvis asymptomatisk; bare 15% av tilfellene er diagnostisert på en lokal scene [2]. Faktisk pasienter med lungekreft viser ofte svulst celle invasjon og metastasering før diagnose som gjør nåværende behandlinger, inkludert kirurgi, strålebehandling og kjemoterapi ineffektiv. Den samlede fem års overlevelse for ikke-småcellet lungekreft er svært lav (17,1%). Derfor studerer det molekylære grunnlaget for lungekreft er avgjørende for å designe nye terapeutiske midler som vil forbedre overlevelse.
Protein kinase C (PKC) er en serin /treonin kinase som spiller en nøkkelrolle i flere signaltransduksjon trasé, inkludert de som er involvert i cellulær proliferasjon, differensiering og apoptose [3-5]. PKC familie inneholder 10 relaterte isoformer med forskjellige kofaktor krav, vev og subcellulære fordeling, og substrat spesifisitet [6]. Familien er delt inn i konvensjonelle (cPKCs: α, βI, βII, og γ), roman (nPKCs: δ, ε, η, og θ), og atypisk (aPKCs: C, og ι /X) underklasser. PKC, inkludert PKCα (PRKCA), spiller en rolle i lungekreft. Nivået av PKCα protein er vesentlig høyere i NSCLC-cellelinjer (H1355, A549, H1703, H157, og H1155) når sammenlignet med primære humane lunge epitelceller (NHBE); Derfor kan økt PKCα uttrykk være et generelt trekk ved NSCLC celler [7]. Det har vært flere rapporter om rollen til PKCα i cellulær proliferasjon, apoptose og migrering av lungekreftceller. PKCα er blitt vist å binde og fosforylere av stillasprotein skivene stort homologe 1 (DLG1) og fremmer cellemigrering i NSCLC-celler [8]. I tillegg er undertrykkelse av PKCα forbedrer cytotoksisitet og mutagenitet av blyacetat (Pb) behandlede CL3 humane lungekreftceller [9]. Staurosporin, er en potent PKC-inhibitor, styrer celleadhesjon, mobilitet, og invasjon av A549-celler [10]; IL1-beta induserer ekspresjonen av urokinase plasminogen aktivator (uPA) via PKCα, noe som fører til migrasjon av A549 NSCLC-celler [11].
microRNAs (mirnas) er viktige regulatorer av genekspresjon [12,13] . Moden mirnas binder mål-mRNA ved komplementære områder i de 3′-utranslaterte regioner (3′-UTR) eller i de kodende sekvensene, for derved å undertrykke ekspresjon av målgenet [14,15]. mirnas er deregulert i human lungekreft og spiller viktige roller i kreftutvikling [16]. For eksempel er lav uttrykk for skuffelse 7a og høy uttrykk for Mir-17-92 klynge assosiert med en dårlig klinisk utfall i lungekreft [17,18]. Mir-34 familien er også undertrykt i kreft og er involvert i p53-assosiert tumor undertrykkelse i mange kreftformer [19-23], inkludert lungekreft [24]. Disse funnene understreker behovet for en grundig søk etter mirnas abnormt uttrykt i lunge kreftutvikling som kan spille viktige roller i regulering av lungekreft vekst eller tumorigenesis.
Selv om deregulering av miRNAs og PKCα spiller viktige roller i lunge kreft , ingen sammenheng mellom PKCα og mirnas har blitt rapportert. I denne studien ser vi etter mirnas som kunne målrette PKCα og innflytelse cellular funksjon.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
Den lungekreft og matchet prøvene normale tilstøtende vev var avledet fra pasienter som gjennomgår et kirurgisk inngrep ved Trommetårnet Hospital (Nanjing, Kina). Alle pasientene eller deres foresatte har gitt skriftlig samtykke og etikkomiteen fra Nanjing University og Nanjing, godkjent Drum Tower Hospital alle aspekter ved denne studien. Vevsfragmentene ble umiddelbart frosset i flytende nitrogen ved tidspunktet for kirurgi og lagret ved -80 ° C. Frosne vev ble homogenisert og total RNA ble ekstrahert ved hjelp TRIzol Reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. De kliniske funksjonene pasientene er oppført i tabell 1.
Age
Kjønn
Patologisk Stage
Tumor Hystotype
148MIIIA (T2b, N2, CMO) plateepitelkarsinom Carcinoma270FIA (T1b, Nei, CMO) Adenocarcinoma362FIIB (T3, nei, CMO) Adenocarcinoma455FIIIA (T3, N2, Mo) Adenocarcinoma567MIB (T1, nei, Mo) Adenocarcinoma649MIV (T4, N2, M1A) AdenocarcinomaTable 1. De kliniske funksjonene i lungekreftpasienter.
CSV Last ned CSV
celler, reagenser og antistoffer
menneske~~POS=TRUNC lunge adenokarsinom A549 celler ble kjøpt fra Kina Cell Culture Center (Shanghai, Kina). Cellene ble opprettholdt i Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM; Gibco, CA, USA) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS; Gibco) og ble dyrket ved 37 ° C i en fuktet atmosfære med 5% CO
2. Syntetiske RNA-molekyler, inkludert pre-MIR-203, og egge ikke-kodende RNA (ncRNA) ble kjøpt fra Ambion (Austin, Texas, USA). Anti-PKCα (H-7) og anti-GAPDH (6C5) antistoffer ble oppnådd fra Santa Cruz Biotechnology (CA, USA). Cell Counting Kit-8 ble kjøpt fra Dojindo (Japan). FITC-Annexin V apoptose Detection Kit jeg ble hentet fra BD Biosciences (CA, USA).
miRNA og siRNA transfeksjon
MIR-203 overekspresjon ble oppnådd ved trans celler med pre-speil 203, en syntetisk RNA-oligonukleotid som etterligner MIR-203-forløper, og en ncRNA tjente som en negativ kontroll. Tre siRNA sekvenser rettet mot ulike områder av menneskelig PKCα cDNA (si-PKCα) ble designet og syntetisert av Invitrogen. En egge siRNA som ikke målrette menneskelig PKCα cDNA ble inkludert som en negativ kontroll. siRNA-sekvensene var som følger: si-PKCα # 1: 5′-GGAUGUGGUGAUUCAGGAU-3 «(sense); si-PKCα # 2: 5»-GCAAAGGACUGAUGACCAA-3 «(sense); si-PKCα # 3: 5»-AAGCUCCAUGUCACAGUACGA-3 «(sense)
A549-celler ble sådd i 6-brønns plater og ble transfektert den følgende dag ved hjelp av Lipofectamine 2000 (Invitrogen) i henhold til produsentens instruksjoner. . For hver brønn, like doser (100 pmol) av egge ncRNA, pre-MIR-203, egge siRNA, eller si-PKCα ble tilsatt. Cellene ble høstet 24 timer etter transfeksjon. Ekspresjonsnivået av MIR-203 ble analysert ved kvantitativ RT-PCR, mens PKCα proteinnivået ble vurdert ved Western blot ved anvendelse av et antistoff mot PKCα. Disse prøver ble normalisert ved blotting med et antistoff mot GAPDH. Den ImageJ programvare ble benyttet for å kvantifisere protein nivåer. SiRNA-sekvensen med den beste interfererende virkning (Si-PKCα # 3) ble valgt og anvendt i videre studier.
Overekspresjon av PKCα
A pattedyr-ekspresjonsplasmid som koder for det humane PKCα åpen leseramme uten 3′-UTR ble kjøpt fra Invitrogen. Et tomt plasmid tjente som en negativ kontroll. Den PKCα overekspresjon plasmidet ble transfektert inn i A549-celler ved anvendelse av Lipofectamine 2000 (Invitrogen) i overensstemmelse med produsentens instruksjoner.
RNA isolering og kvantitativ RT-PCR
Total RNA ble ekstrahert fra de dyrkede celler ved anvendelse av TRIzol reagens (Invitrogen) i henhold til produsentens instruksjoner. For kvantitativ RT-PCR analyse av PKCα og p-aktin transkripsjoner, 1 mikrogram total RNA ble revers transkribert til cDNA ved hjelp av en oligdT og Thermoscript revers transkriptase (Takara, Dalian, Kina). Real-time PCR for PKCα og p-aktin transkripsjoner ble utført på et Applied Biosystems 7300 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) ved hjelp av SYBR grønt fargestoff (Invitrogen). PCR-reaksjoner ble utført i en 20 ul reaksjons inkludert 1 ul cDNA, 1 x QuantiTect SYBR grønn PCR masterblanding, og 0,5 uM sense og antisense-primere. Reaksjonene ble inkubert i en 96-brønners plate ved 95 ° C i 5 minutter, etterfulgt av 40 sykluser på 95 ° C i 30 s, 60 ° C i 30 s, og 72 ° C i 30 sek. Alle reaksjoner ble kjørt i triplikat. Etter reaksjonene ble kjørt, ble terskel sykluser (C
T) bestemmes ved hjelp av faste terskelinnstillinger. Sekvensen av sense- og antisense-primere anvendt for amplifikasjon av PKCα og β-actin var som følger: PKCα (sense): 5′-GTGGCAAAGGAGCAGAGAAC-3 «; PKCα (antisens) 5»-TGTAAGATGGGGTGCACAAA-3 «; β-aktin (sense): 5»-AGTACTTCCTC TGCCCTGCTGCAG-3 «; β-aktin (antisense). 5»-AGGGCAGGCAGCGTATATACAGGA-3 «
Analyser å kvantifisere moden MIR-203 ble utført ved bruk av Taqman mikroRNA sonder (Applied Biosystems) i henhold til produsentens instruksjoner. I korthet, 1 ug total RNA ble revers-transkribert til cDNA ved anvendelse av AMV revers transkriptase (Takara) og en stilk-sløyfe RT primer (Applied Biosystems). Real-time PCR ble utført ved hjelp av en TaqMan PCR kit på en Applied Biosystems 7300 Sequence Detection System (Applied Biosystems). Alle reaksjoner, inkludert templat-kontroller, ble kjørt i tre eksemplarer. Etter reaksjonene, C
T-verdier ble bestemt ved hjelp av faste terskelinnstillinger. I forsøkene som er presentert her, ble miRNA ekspresjon i cellene normalisert til ekspresjon av U6 snRNA. Den relative mengde av MIR-203 til det interne U6 kontroll ble beregnet ved bruk av ligning 2
-ΔCT, hvor A C
T = C
T MIR-203-C
T U6.
miRNA mål prediksjon
De mirnas som kan målrette PKCα ble bestemt ved hjelp av algoritmer fra TargetScan (https://genes.mit.edu/targetscan/) [25], picTar (http: //pictar .bio.nyu.edu /) [26], og Miranda (https://cbio.mskcc.org/cgi-bin/mirnaviewer/mirnaviewer.pl) [27].
Plasmid konstruksjon og luciferase assay
en partiell sekvens av det humane PKCα 3′-UTR, som innbefatter den forutsagte MIR-203 bindingsseter ble syntetisert ved Invitrogen, med en ekstra 3′-fosforylering modifikasjon. Sekvensen var som følger: PKCα 3′-UTR (sense): 5′-CTAGTTCTAAGGACGTTGCTGAACAAGCGTGTGAAATCATTTCAGATCAAGGATAAGCCAGTGTGTACATATGTA-3 «; PKCα 3′-UTR (antisens) 5»-AGCTTACATATGTACACACTGGCTTATCCTTGATCTGAAATGATTTCACACGCTTGTTCAGCAACGTCCTTAGAA-3 «. Et dobbelt-trådet molekyl som ble dannet ved å varmebehandle disse to enkle kjeder ved 60 ° C, og denne dupleks ble innsatt i p-MIR-rapport plasmid (Ambion). Effektiv innsetting ble bekreftet ved sekvensering. For luciferase reporter-analyser, ble cellene dyrket i 6-brønners plater, og hver brønn ble transfektert med 2 ug ildflue luciferase reporter plasmid, 2 ug β-galaktosidase-ekspresjonsvektoren (Ambion), og like mengder av egge ncRNA eller pre-speil 203 bruker Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Den β-galaktosidase vektor ble anvendt som en kontroll transfeksjon. Celler ble analysert ved anvendelse av luciferase-assay kit (Promega, Madison, WI, USA) 24 timer etter transfeksjon. De rapporterte data representerer tre uavhengige eksperimenter.
Celleviabilitet analysen
levedyktighet av A549 celler ble bestemt ved bruk av Cell Counting Kit-8 (Dojindo), i henhold til produsentens instruksjoner. Kort sagt ble A549-celler sådd ut på 5,0 x 10
3-celler per brønn i 96-brønners plater og inkubert over natten i DMEM-medium supplert med 10% FBS. Etter transfeksjon ble 10 ul CCK-8 væske tilsatt til testbrønn og inkubert i 3 timer. Absorbans (
A
) ble deretter målt ved en bølgelengde på 450 nm.
Cellemigrering assay
migrering evne til A549-celler ble testet ved bruk av en Transwell Boyden kammer (6,5 mm, Costar, Cambridge, MA). Celler ble behandlet med ncRNA, pre-MIR-203, eller sirnas i 6 timer og ble suspendert i serumfritt DMEM-medium i en konsentrasjon på 4 x 10
5-celler /ml; deretter, 4 x 10
4 celler /brønn ble tilsatt til det øvre kammer. Samtidig 0,5 ml DMEM supplementert med 10% FBS ble tilsatt til det nedre rom, og transwell-inneholdende plater ble inkubert i 18 timer i en 5% CO
2 atmosfære mettet med H
2O. Ved slutten av inkubasjonen ble cellene som var kommet inn i den nedre flate av filtermembranen (migrerende celler) ble fiksert med 4% paraformaldehyd i 15 minutter ved romtemperatur; cellene ble deretter vasket tre ganger med destillert vann og farget med 0,1% krystallfiolett i 15 min ved romtemperatur. Cellene igjen på den øvre overflate av filtermembranen (ikke-migrerende) ble forsiktig skrapet av med en bomullsdott. Bilder av trekkfugl celler ble tatt med en photomicroscope (BX51, Olympus, Japan). Cellemigrering ble kvantifisert ved telling av blind de migrerte celler på den nedre overflate av membranen; fem felt ble telt per kammer.
Cell apoptose analysen
Tjuefire timer etter transfeksjon med ncRNA, pre-MIR-203, eller siRNA ble A549 celler behandlet med 200 mikrometer hydrogenperoksid ( H
2o
2) i 30 minutter for å indusere apoptose. Som per produsentens instruksjoner av FITC-Annexin V apoptose Detection Kit I (BD Biosciences), ble cellene deretter vasket to ganger med kald PBS og resuspendert i 1 x bindingsbuffer i en konsentrasjon på 1 x 10
6 celler /ml . -Celler (1 x 10
5-celler) ble overført til en 5 ml kultur rør, og FITC-Annexin V og propidiumjodid (PI) ble tilsatt. Cellene ble inkubert i 15 minutter ved romtemperatur i mørke og ble analysert ved flow-cytometri (BD Biosciences) i løpet av 1 time av farging.
Statistisk analyse
Alle bilder av Western blots, celle apoptose analyser, og trekk assays var representative for minst tre uavhengige eksperimenter. Dataene som vises, er presentert som gjennomsnitt ± standard avvik (S.D.). En 2-tailed Student
t
test ble brukt for sammenligninger, og en
p
verdi. 0,05 ble betraktet som signifikant
Resultater
Tippe av miRNAs som kan målrette PKCα
med hjelp av tre miRNA mål prediksjon programmer (TargetScan, PicTar og Miranda), spådde vi at Mir-203 mål på PKCα mRNA-transkript.
antatte interaksjoner mellom MIR-203 og dets målse i PKCα 3′-UTR er illustrert i figur 1A. Som vist i denne figuren, er det en potensiell MIR-203 målområde i det 3′-UTR av PKCα mRNA sekvens. Minste frie energiverdier for disse interaksjonene er -27,6 kcal /mol, bestemt ved RNA-hybrid-analyse [28]. Dessuten ble perfekt baseparing mellom frøet region (kjernen sekvens som omfatter de første 2-8 baser av den modne miRNA) og beslektede mål bemerkes (figur 1A), og MIR-203 bindende sekvenser i 3′-PKCα UTR er svært konservert over arter (Figur 1b).
En skjematisk beskrivelse av de hypoteser tomannsboliger dannet av samspillet mellom PKCα 3′-UTR bindingsseter og MIR-203. Den forutsagte struktur av base-parede hybrid er vist skjematisk. Sammenkoblede baser er angitt med en
svart linje
, og G: U parene er markert med
tre prikker
. Den forutsagte fri energi av hybrid er indikert. B, sekvenssammenstillingen av de antatte MIR-203 bindingssteder på tvers av arter. Frøet komplementære områder er markert med
rød
, og alle nukleotider i regionene er bevart i flere arter, inkludert menneske, mus og rotter.
Differensial uttrykk mønstre av MIR-203 og PKCα i humane lungekreft vev
mirnas er generelt antatt å negativt regulere uttrykk for sine mål gjennom translasjonsforskning undertrykkelse eller mRNA degradering [29,30]. Derfor, hvis en miRNA formidler degradering av sine målrettede mRNA, dette miRNA og sine mål bør ha motsatt uttrykk mønstre. Basert på dette, undersøkte vi de uttrykk mønstre av MIR-203 og PKCα i de samme 6 par lungekreft og tilsvarende noncancerous vevsprøver. Ved hjelp av kvantitativ real-time PCR-analyse, har vi vist at ekspresjonen av MIR-203 var signifikant lavere i humane lungekreft vev enn i de tilstøtende normale vev (figur 2A); i motsetning PKCα mRNA uttrykk var merkbart høyere i kreftceller (figur 2B).
A, kvantitativ real-time PCR-analyse av den relative MIR-203 uttrykk i 6 par lungekreft vev (LCT) og noncancerous vev (NCT) prøver. B, kvantitativ real-time PCR-analyse av den relative PKCα mRNA nivå i de samme 6 par LCT og NCT prøver. Resultatene i A, og B er presentert som gjennomsnitt ± S.D. av tre uavhengige forsøk (*,
p
0,05; **
p
0,01)
Validering av PKCα regulering av MIR-203
for ytterligere bekreftelse, human lunge adenokarsinom A549-celler ble transfektert med ncRNA eller pre-MIR-203, og cellene ble analysert for ekspresjon av MIR-203 ved kvantitativ RT-PCR 24 timer etter transfeksjon. Alle cellene som ble transfektert med pre-MIR-203 viste en signifikant økt ekspresjon av det modne MIR-203 (figur 3A). For å avgjøre om overekspresjon av MIR-203 hadde noen effekt på nivåene av PKCα, vi gjentok ovenfor eksperimenter og undersøkt uttrykk for PKCα protein og mRNA 24 timer etter transfeksjon. Som vist i figur 3B, ble ekspresjon av PKCα protein betydelig redusert ved innføring av pre-MIR-203, mens celler transfektert med det forvrengte ncRNA opprettholdt en betydelig mengde PKCα protein. Tilsvarende celler transfektert med pre-MIR-203 hadde redusert nivå av PKCα mRNA, i forhold til celler transfektert med ncRNA (figur 3C). Hos dyr er mirnas antas å virke hovedsakelig gjennom translasjonsbevegelse undertrykkelse i stedet for mRNA-spalting [30], men nye studier viser at metazo mirnas kan redusere nivåene av mange av deres mål-transkripter, ikke bare mengden av protein som stammer fra disse transkriptene [31 ]. Våre data tyder på at Mir-203 regulerer uttrykket av PKCα både på transkripsjon og proteinnivåer, og vurderer større nedgang i PKCα protein, kan det handle mer på translasjonell undertrykkelse enn mRNA degradering.
A, overekspresjon av MIR -203. A549-celler ble sådd i en 6-brønns plate og transfekteres den neste dag. For hver brønn, 100 pmol egge ncRNA eller pre-MIR-203 ble lagt. Nivåene av MIR-203 ble evaluert ved kvantitativ RT-PCR 24 timer etter transfeksjon. Til sammenligning ble uttrykket nivåer av MIR-203 i ncRNA-transfekterte celler satt til 1.
y
-aksen viser vilkårlige enheter som representerer de relative Mir-203 uttrykk nivåer. Resultatene er presentert som gjennomsnitt ± S.D. av tre uavhengige forsøk (***
p
0,001). B, Immunoblot for endogent PKCα protein i A549-celler som enten var narretransfekterte eller transfektert med ncRNA eller pre-MIR-203 i 24 timer. GAPDH ble anvendt som en kontroll lasting. Bilder av Western blot-analyse ble analysert ved hjelp av ImageJ programvare, og en statistisk analyse er vist i panelet til høyre (gjennomsnitt ± S.D .; **
p
0,01). C, kvantitativ RT-PCR analyse av PKCα mRNA nivåer i A549 celler behandlet med egge ncRNA eller pre-MIR-203.
y
-aksen viser relative PKCα mRNA nivåer normalisert til nivåer av β-aktin (gjennomsnitt ± S.D .; *,
p
0,05). D, direkte anerkjennelse av PKCα 3′-UTR av MIR-203. Enten villtype (wt) eller mutant (Mut) MIR-203 bindingssteder (sekvensen som samhandler med 2-8 baser av MIR-203 ble muterte) i PKCα 3′-UTR er avbildet. Ildflue luciferase reportere inneholdende enten villtype (wt) eller mutant (mut) humant PKCα 3′-UTR ble ko-transfektert inn i A549-celler sammen med egge ncRNA, eller pre-MIR-203. Ved 24 timer etter transfeksjon, ble cellene analysert ved hjelp av et luciferase-analysesett. Ildflue luciferase-verdier ble normalisert til B- galactosidase-aktivitet og plottet som relativ luciferaseaktivitet. For sammenligning ble det luciferaseaktiviteten i ncRNA-transfekterte celler som angitt 1. Resultatene er presentert som gjennomsnitt ± S.D. av tre uavhengige forsøk (**
p
0,01).
PKCα er et direkte mål på MIR-203
For å avgjøre om de negative regulatoriske effekter MIR-203 som utøves på PKCα ekspresjon ble mediert gjennom bindingen av MIR-203 til de antatte områder i den 3′-UTR av PKCα mRNA, vi kondensert del av den PKCα 3′-UTR, som innbefatter den forutsagte MIR-203 bindings nettsteder, nedstrøms ildflue luciferase reporter plasmid. Det resulterende plasmid ble innført i A549-celler sammen med en transfeksjon kontroll plasmid ekspresjonsvektorer β-galaktosidase og pre-MIR-203 eller forvrengt ncRNA. Som forventet, overekspresjon av MIR-203 resulterte i en signifikant nedgang i luciferase-rapportøraktivitet, som ble normalisert til B- galactosidase-aktivitet, sammenlignet med celler behandlet med det forvrengte ncRNA (figur 3D). Videre introduserte vi punktmutasjoner i de tilsvarende frø komplementære områder i PKCα 3′-UTR å eliminere spådd MIR-203 bindingssetet. Som vist i figur 3D, mutasjoner i de komplementære områder frø nesten fullstendig reddet undertrykkelse av reporteraktiviteten forårsaket av ekspresjon av pre-MIR-203. Dette tyder på at bindingsstedet bidrar sterkt til miRNA: mRNA interaksjon som formidler post-transcriptional hemming av PKCα uttrykk. I konklusjonen, våre resultater viser at MIR-203 direkte gjenkjenner 3′-UTR av PKCα mRNA transkripsjon og binder seg til det å nedregulere sitt uttrykk.
Rollen MIR-203 mediert PKCα downregulation i celle spredning, apoptose, og cellemigrasjon
for å undersøke de cellulære fenotyper utløst av Mir-203-mediert nedregulering av PKCα, A549 celler ble transfektert med enten pre-MIR-203 eller si-PKCα og analysert for endringer i celleproliferasjon, apoptose og migrering.
Som vist i figur 4A, mest mulig effektiv innblanding av PKCα ekspresjon kan bli oppnådd ved si-PKCα # 3 (kalt Si-PKCα etterpå) transfeksjon, sammenlignet med kontroll siRNA. Vi er fast bestemt på spredning priser av A549 celler med redusert uttrykk av PKCα eller overekspresjon av MIR-203 bruker Cell Counting Kit-8. I motsetning til kontroll siRNA-transfekterte celler, celler transfektert med si-PKCα proliferert ved en betydelig lavere hastighet (figur 4B). Videre ble det observert en signifikant forskjell i spredning priser mellom cellene transfektert med ncRNA og pre-MIR-203 (figur 4C).
A, validering av siRNA mot PKCα. Tre sirnas rettet mot ulike områder av menneskelig PKCα cDNA og en egge kontroll siRNA ble transfektert inn i A549 cellene ved hjelp Lipofectamine 2000. Western blot analyse viser PKCα protein nivåer på 24 timer etter transfeksjon. Normalisert kvantifisering av immunoblotter ble gjennomført fra uavhengige forsøk. Data er presentert som gjennomsnitt ± S.D. (**
p
0,01). B, celleviabilitet analyse ved 12, 24, 36, og 48 timer etter transfeksjon av A549-celler med like doser av kontroll siRNA eller Si-PKCα, eller C, like doser på kryptert ncRNA eller pre-MIR-203 (gjennomsnitt ± SD; **
p
0,01). D, Western blot analyse av protein nivået av PKCα i A549 celler transfektert med ncRNA, pre-MIR-203, eller pre-MIR-203 pluss PKCα overekspresjon plasmid, og en statistisk analyse er vist i panelet til høyre (gjennomsnitt ± SD; **
p
0,01). E, Immunoblot for PKCα protein i A549-celler som enten var narretransfekterte eller transfektert med plasmid PKCα overekspresjon. F, celleviabilitet assay ved 12, 24, 36, og 48 timer etter transfeksjon av A549-celler med ncRNA, pre-MIR-203, pre-MIR-203 pluss PKCα overekspresjon plasmid, eller PKCα overekspresjon plasmid alene (gjennomsnitt ± SD; * *
p
0,01; ***
p
. 0,001)
Deretter undersøkte vi om overekspresjon av PKCα er tilstrekkelig til å reversere hemmende effekter av MIR-203 på PKCα og biologiske prosesser i lungekreftceller. Et plasmid konstruert for å uttrykke spesielt full-lengde åpen leseramme (ORF) av PKCα uten MIR-203-responsive 3′-UTR ble konstruert og transfektert inn i pre-MIR-203 transfekterte A549-celler. Sammenlignet med celler transfektert med pre-MIR-203 cellene transfektert med pre-MIR-203 og den PKCα overekspresjon plasmid oppviste betydelig høyere nivåer av PKCα (figur 4D), noe som tyder på at MIR-203-resistente PKCα reddet PKCα undertrykkelse forårsaket av MIR-203. Celler transfektert med plasmid PKCα overekspresjon alene viste også mer uttrykksnivå PKCα sammenlignet med celler transfektert med et tomt plasmid kontroll (figur 4E). Derfor overekspresjon av PKCα reddet MIR-203 mediert nedregulering av sprednings priser av A549 celler (Figur 4F). Disse resultater antyder at MIR-203 kan hemme celleproliferering av stanse PKCα.
Etter at A549-celler ble transfektert med forhånds MIR-203, ncRNA, eller Si-PKCα i 24 timer, ble de behandlet med 200 pM hydrogen peroksyd i 30 minutter for å indusere apoptose. Vi deretter undersøkt apoptose i celler med økt Mir-203 uttrykk eller taushet PKCα ved flowcytometri analyse. Når sammenlignet med celler transfektert med ncRNA, andelen av apoptotiske celler i pre-MIR-203 transfeksjon gruppe var betydelig høyere, fra 7,64% til 14,01%, henholdsvis (figur 5). Når sammenlignet med celler transfektert med kontroll siRNA, transfeksjon med Si-PKCα litt, men ikke signifikant øker andelen av apoptotiske celler, fra 7,98% til 10,16%, henholdsvis. Disse resultater antyder at MIR-203 kan fremme celle apoptose, men denne effekten bare delvis er avhengig av sin nedregulering av PKCα.
A549-celler ble transfektert med like doser av egge ncRNA eller pre-MIR-203, eller like doser av kontroll siRNA eller si-PKCα. Celle apoptose-profiler ble analysert ved hjelp av strømningscytometri. Den biparametric Histogrammet viser celler i tidlig (nederst til høyre kvadrant) og sene apoptotiske stater (øvre høyre kvadrant). Levedyktige celler er dobbel negativ (nederst til venstre kvadrant). Forsøket ble gjentatt tre ganger, og en statistisk analyse er vist i panelet til høyre (gjennomsnitt ± SD; **
p
0,01)
Vi vurderte rolle. MIR-203 i celle migrasjon ved hjelp av transwell analysen. Som vist i figur 6A, ble migreringshastighet på A549-celler transfektert med forhånds MIR-203 signifikant redusert sammenlignet med celler transfektert med kontroll ncRNA. I tillegg transfeksjon med si-PKCα bemerkelsesverdig redusert antall A549 celler som passerte gjennom transwell kammeret. Videre, når A549 celler ble samtidig tilført med pre-MIR-203 og PKCα overekspresjon plasmid, PKCα dramatisk utvinnes migrasjon svekkes av MIR-203 (figur 6B). Til sammen våre data tyder på at Mir-203 trolig modulere celle migrasjon av downregulating PKCα.
A, Transwell analyse av A549 celler behandlet med like doser av egge ncRNA eller pre-MIR-203, eller like doser av kontroll siRNA eller si-PKCα. Representative bilder fra tre uavhengige eksperimenter er vist i panelet til venstre, og en statistisk analyse er vist i panelet til høyre (gjennomsnitt ± S.D .; **
p
0,01). B, representative bilder av Transwell analyse av A549-celler som ble transfektert med ncRNA, pre-MIR-203, pre-MIR-203 pluss PKCα overekspresjon plasmid, eller PKCα overekspresjon plasmid alene, er vist i det øvre panelet, og en statistisk analyse er vist i nedre panel (gjennomsnitt ± SD; **
p
0,01).
Diskusjoner
i tillegg til lungekreft, er PKCα også en kritisk faktor i mange andre kreftformer. Det er blitt funnet at PKCα, δ og ι var signifikant mer rikelig i hepatocellulær karsinom (HCC) vev sammenlignet med ikke-tumor levervev [32]. Immunhistokjemi analyser bekreftet at oven normale PKCα nivåer kan finnes i menneskets HCC [33,34]. Når PKCα ble innført i MCF-7 brystkreftcellelinje, cellemigrering og invasjon økes [35]. Det ble rapportert at behandling av SK-Hep-1 HCC med antisense PKCα undertrykte betydelig cellevekst, cellemigrering og invasjon [36]. De samme resultatene ble gjengitt ved hjelp av PKCα /β-hemmer Go6976, som var i stand til å hemme spredning, migrasjon og invasjon i dårlig differensierte HCC celler. Disse eksperimenter antyder at PKCα er en praktisk forskning retning for å forstå kreftutvikling.
MIR-203 ble rapportert til å virke som en tumorundertrykkende mikroRNA, og dens ekspresjon ble nedregulert i laryngeal carcinoma celler [37]. Studier fra en annen gruppe viste at Mir-203 uttrykk ble nedregulert i LNCaP, Du145, PC3, Vcap, og MDA-PCA-2b prostatakreft cellelinjer [38]. Vi har funnet at ekspresjonen av MIR-203 i lungekreft vev var signifikant lavere enn for de tilstøtende normale vev. Det har også blitt vist at MIR-203-funksjoner i ulike kreftformer. Ektopisk uttrykk for MIR-203 i prostatakreftcellelinjer kan påvirke spredning, apoptose, og migrasjon [38,39], mens overekspresjon av MIR-203 i strupekreft cellene redusert celle levedyktighet og førte til en cellesyklus arrest i G1 fasen [37].
