Abstract
Pinus massoniana
bark proantocyanidiner (PMBPs), en aktiv komponent isolert fra
Pinus massoniana
bark, har blitt rapportert å ha et bredt spekter av biokjemiske egenskaper . Her undersøkte vi anti-tumor effekt av PMBPs på eggstokkreft. Resultatene indikerte at PMBPs betydelig redusert veksten av eggstokkreft celler og indusert dose-avhengig apoptose. De underliggende mekanismer som er involvert ble undersøkt for å omfatte tap av mitokondriemembranpotensialet, nedregulering av den anti-apoptotiske protein Bcl-2 og aktiveringen av caspase 3/9, noe som tyder på at PMBPs utløst apoptose gjennom aktivering av mitokondrier-assosiert apoptotiske reaksjonsvei. I tillegg, sårheling og Transwell kammer analyser avslørte at PMBPs kunne undertrykke migrering og invasjon av eggstokkreft celler. PMBPs dramatisk inhiberer MMP-9 aktivitet og uttrykk, blokkerte aktiviteten av NFkB og aktivering av ERK1 /2 og p38 MAPK. Våre funn tyder på at PMBPs har potensial til å bli utviklet som en anti-tumor medikament for eggstokkreft behandling og /eller sykdom ledelse
Citation. Liu J, Bai J, Jiang G, Li X, Wang J, Wu D, et al. (2015) Anti-tumor effekt av
Pinus massoniana
Bark Proanthocyanidins på Eggstokkreft gjennom Induksjon av Cell apoptose og Hemming av cellevandring. PLoS ONE 10 (11): e0142157. doi: 10,1371 /journal.pone.0142157
Redaktør: Yi-Hsien Hsieh, Institutt for biokjemi og bioteknologi, TAIWAN
mottatt: 1 mai 2015; Godkjent: 19 oktober 2015; Publisert: 05.11.2015
Copyright: © 2015 Liu et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansiert av National Natural Science Foundation of China (No.81302282) (URL: https://www.nsfc.gov.cn/). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
eggstokkreft er fortsatt den femte vanligste krefttypen hos kvinner og den ledende dødsårsaken i gynekologiske kreftformer [1] sikret førstelinje behandling av eggstokkreft er vanligvis tradisjonell kirurgi kombinert med platina-paclitaxel kjemoterapi [2]. Til tross for god første svar på de fleste ovarian kreftpasienter, er 5-års overlevelse fortsatt lav på grunn relapses- en vanlig foreteelse etter førstelinjebehandling [3]. Det har vært noen utvikling i eggstokkreft behandling siden standardisering av cisplatin og paclitaxel narkotika i løpet av de siste 20 årene [4]. Det er et presserende behov for å utvikle nye effektive legemidler for eggstokkreft behandling.
Foreløpig er noen naturlig bioaktivt fytokjemisk brukes til å hindre spredning eller metastasering av kreft celler [5]. Slik fytokjemisk er ikke-toksiske og fri for bivirkninger, slik de er gode alternativer og /eller komplementære til konvensjonelle cytostatika, [5]. Furu bark ekstrakt ble tidligere ansett som et ubeleilig avfallsprodukt i treindustrien men nå anerkjent som rikt på natur proantocyanidiner med potensielle medisinske egenskaper [6]. Det har blitt vist at proantocyanidiner kan anvendes for å forhindre tumor på grunn av deres evne til å modulere aktiviteten av flere mål involvert i karsinogenese [7]. Derfor har anti-tumor aktivitet av furubark ekstrakt fått mest oppmerksomhet den siste tiden.
Pinus massoniana
Lamb av Pinaceae familien er innfødt til sør og sørvest i Kina. Barken har vært brukt i tradisjonell kinesisk medisin for behandling av inflammasjon, artralgi, revmatisme og kreft [8]. Den viktigste komponenten i
Pinus massoniana
bark er også proantocyanidiner. Den anti-tumor aktivitet er påvist i menneskelever Hep G2 celler, livmorhalskreft Hela celler og mus sarkom S180 celler [9,10,11]. Men effekten av
Pinus massoniana
bark proantocyanidiner (PMBPs) på eggstokkreft og mekanismene bak prosessen er ennå ikke avgrenset.
I denne studien har vi vurdert om proantocyanidiner fra
Pinus massoniana
bark kunne utøve anti-tumor effekt på eggstokkreft celler og videre undersøkt de nærmere mekanismene bak denne prosessen. Våre data kan gi grunnlag for fremtidig utvikling av PMBPs som et effektivt legemiddel for eggstokkreft behandling.
Materialer og metoder
Materialer, reagenser og kjemikalier
Antistoffer mot caspase -3, caspase-9, BCL-2 ble kjøpt fra Cell Signaling Technology (Denver, MA). Antistoffer mot MMP-9, NFKB, IκBα og β-aktin ble oppnådd fra Protein Tech Group, Inc. (Chicago, USA). Antistoffer mot fosforylert IκBα, ble ERK1 /2, p38 og JNK hentet fra Sangon Biotech, Kina. Den forbedrede chemiluminescence (ECL) kit ble kjøpt fra Amersham Life Science, Inc. (USA). Den Annexin V-konjugert FITC apoptose deteksjon kit og JC-1 mitokondriemembranen potensial deteksjon kit ble kjøpt fra NanJing KeyGen Biotech Co., Ltd (Nanjing, Kina). Transwells ble kjøpt fra BD Biosciences (San Jose, USA). MTT (3- (4,5-dimetyl-2-yl) -2,5-difenyl tetrazoliumbromid) og DAPI (2- (4-amidinofenyl) -6-indolecarbamidine-dihydroklorid) ble oppnådd fra Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). PMBPs pulver ble kjøpt fra Shaanxi Sciphar Hi-Tech Co., Ltd (Shanxi, Kina). Den inneholdt ca. 95% proantocyanidiner og stabil i minst to år ved 4 ° C.
Cellelinjer og cellekultur
Ovariekreft cellelinje A2780 ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC ) og dyrket i DMEM-medium supplert med 10% FBS (begge innkjøpt fra Gibco BRL, Grand Island, NY, USA). OV2008 ble vennlig levert av Prof. Shiying Cui (Dalian Medical University, Kina) og dyrket i RPMI-1640 medium (Invitrogen, Burlington, ON, Canada) supplert med 10% FBS. Normal ovarie epitelcellelinje IOSE80 ble oppnådd ved Canadian ovarievev Bank og dyrket i medium 199 (Invitrogen) og MCDB 105 (Sigma) supplementert med 10% FBS. Når cellene var 80% sammenflytende, ble de høstet med 0,25% trypsinering. Cellene ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av PMBPs med passende tilsvarende kontroller.
Celleviabilitet assay
Virkningen av PMBPs på levedyktigheten til cellene ble påvist ved MTT-analyse. Cellene (1 x 10
4 /brønn) ble sådd ut i 96-brønners platen og inkubert i 24 timer. Deretter 200 ul medium inneholdende 0, 10, 25, 50, 75, 100 og 120 ug /ml PMBPs ble tilsatt i hver brønn. Hver konsentrasjon av PMBPs var sextupled. Etter 24 timer og 48 timer PMBPs behandling, 20 ul MTT (5 mg /ml i PBS) ble tilsatt til hver brønn og inkubert i 4 timer. MTT-løsning ble fjernet og formazankrystaller ble oppløst i 150 ul DMSO. Absorbans av oppløsningen ble målt ved anvendelse av et Multiskan oppstigning plateavleser ved 540 nm bølgelengde.
DAPI farging assay
Omtrent 4 x 10
4 celler /brønn av eggstokkreft celler ble sådd ut i 6-brønns plate og ble deretter behandlet med PMBE på 0, 25, 50 og 100 ug /ml i 24 timer. Celler i hvert brønner ble farget med DAPI før du fester med 3,7% formaldehyd. Cellene ble deretter vasket med PBS og analysert ved fluorescens mikroskopi.
celle apoptose ved strømningscytometri
Etter behandling med 0, 10, 25, 35 og 50 ug /ml PMBPs til 24 timer, eggstokkreft celler ble høstet og vasket med PBS tre ganger, og deretter inkubert med Annexin V-FITC og PI i 10 min i mørket. Cellene ble oppdaget av en FACS /Calibur strømningscytometer (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA).
analyse for mitokondriemembranen potensial
Endringene av mitokondriemembranen potensialet for eggstokkreft celler ble detektert ved strømningscytometri ved å bruke JC-1 deteksjon kit. Etter behandling med 0, 25, 35, 50 ug /ml PMBPs for 24 timer, ble cellene høstet og inkubert med JC-1 fargestoff i 15 minutter ved 37 ° C i henhold til produsentens protokoll. Cellene ble oppdaget av en FACS /Calibur strømningscytometer.
sårtilheling analysen
A2780 og OV2008 celler ble sådd i 6-brønns plater og vokst til å skape en konfluent monolag. Den cellemonolaget ble skrapet i en rett linje med et P200 ul pipettespiss. Platene ble vasket med PBS for å fjerne frigjorte celler og deretter inkubert med komplett vekstmedium inneholdende 0, 5, 10 og 25 ug /ml PMBPs løsning i 24 timer. ble observert celle migrasjon under et fasekontrastmikroskop på 100 × forstørrelse på 0 og 24 timer etter induksjon av skade. Migrerte celler i det utarmede området i hver av seks tilfeldige felt ble målt og kvantifisert ved hjelp av en datastøttet mikroskop.
Transwell kammer analysen
Cell migrasjon og invasjon ble kvantifisert ved transwell kammer analysen. Eggstokkreft celler ble behandlet med 0, 5, 10 og 25 ug /ml PMBPs i 24 timer og høstet. 1 x 10
5-celler i serumfritt DMEM ble tilsatt til hver øvre kammer og DMEM med 10% FBS ble tilsatt til det nedre kammer som et kjemotiltrekkende. Etter 24 timers inkubering ved 37 ° C, ble cellene igjen på den øvre overflate av membranen ble fjernet, og cellene som migrerte til undersiden av membranen farget med 0,1% krystallfiolett i 10 min. De migrerte cellene på undersiden av membranen ble tellet under et mikroskop ved 100 x forstørrelse. Seks tilfeldige felt av hver transwell membran ble talt og i gjennomsnitt.
Gelatin zymografi
Aktiviteten av MMP-9 ble oppdaget av gelatin zymografi. Tumorcellene ble behandlet med 0, 5, 10, 25 ug /ml PMBPs i 24 timer. Deretter ble cellemediet ble oppsamlet og sentrifugert for å fjerne celleavfall. Like stort volum av klaret medium ble elektroforese gjennom 10% SDS-PAGE-gel inneholdende 0,1% (w /v) gelatin ved 4 ° C. Gelen ble vasket med vaskebuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl og 2,5% Triton X-100) og deretter inkubert i aktiveringsbuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 10 mM CaCl
2, 0,02% NaN
3 og 1 mM ZnCl
2) ved 37 ° C over natten. Deretter ble gelen farget med 0,25% (w /v) Coomassie brilliant blue i 45% (v /v) metanol og 1% (v /v) eddiksyre og avfarget med 10% isopropanol /10% eddiksyre (v /v ) løsning. MMP-9 band ble observert ved 92 kDa.
Utarbeidelse av totalt cellelysat og kjernefysiske fraksjons
For totalt cellelysat, cellene ble homogenisert i RIPA buffer (Beyotime, Jiangsu, Kina). Cellelysatene ble sentrifugert ved 12000 rpm i 10 minutter ved 4 ° C, og supernatanten ble oppsamlet. Nuclear fraksjonen ble hentet av en modifisert metode (Yeh, 2012). I korthet ble cellene behandlet med buffer A (10 mM HEPES, 10 mM KC1, 0,1 mM EDTA, 1,5 mM MgCl2, 0,2% NP-40, 1 mM DTT og 0,5 mM fenylmetylsulfonylfluorid) og nukleære pellets ble oppsamlet ved sentrifugering ved 3000 opm i 30 s ved 4 ° C. Den nukleære fraksjonen ble deretter ekstrahert med buffer B (20 mM HEPES, 25% glycerol, 1,5 mM MgCl
2, 0.1 mM EDTA, 420 mM NaCl, 1 mM DTT og 0,5 mM fenylmetylsulfonylfluorid).
Western blot-assay
De totale cellelysater eller nukleære ekstrakter ble separert ved 10% SDS-PAGE og deretter overført til en nitrocellulosemembran ved semi-tørr apparatur i 1 time. Membranen ble blokkert med 5% ikke-fettmelk i 1 time og deretter inkubert med det primære antistoff spesifikt oppløsning over natten ved 4 ° C. Etter inkubasjon med det passende anti-art sekundært antistoff i 1 time, ble proteinbåndene visualisert ved ECL-kit.
Statistisk analyse
Data ble statistisk analysert ved bruk av Students t test og presentert som gjennomsnitt ± SD for tre uavhengige eksperimenter. SPSS 15,0 programvare ble anvendt for analyser. Verdien av P 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
Effektene av PMBPs på levedyktigheten av eggstokkreft celler
Effektene av PMBPs på levedyktighet av eggstokkene. kreftceller og normale eggstokk-celler ble først påvist ved MTT-analyse. Eggstokkreft celler A2780 og OV2008, så vel som normale eggstokk-celler IOSE80 ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av PMBPs (0, 10, 25, 50, 75, 100, 120 ug /ml) i 24 timer eller 48 timer. Eggstokkreft celler følgende PMBPs behandling viste en dramatisk reduksjon i celleviabilitet fra 25 ug /ml i en doseavhengig måte (
P
0,01), mens samme konsentrasjoner ikke i vesentlig grad påvirker levedyktigheten av normale ovarieceller IOSE80 (fig 1A). IC50 verdi på PMBPs var 48 ± 2,4 ng /ml for A2780 og 67 ± 2,7 ng /ml for OV2008 etter 48 timer (fig 1a).
(A) eggstokkreft celler A2780 og OV2008 og normal eggstokk cellene IOSE80 ble behandlet med PMBPs (0, 10, 25, 50, 75, 100, 120 ug /ml) i 24 timer eller 48 timer. Cellenes levedyktighet ved de forskjellige konsentrasjoner av PMBPs ble påvist ved MTT-analyse og uttrykt i forhold til den av ikke-behandlede celler. Eksperimentene ble gjentatt tre ganger. (B) eggstokkreft celler A2780 og OV2008 og normal ovarie celler IOSE80 ble behandlet med PMBPs (0, 25, 75, 100 ug /ml) i 24 timer, og cellene ble fotografert med invertert kontrastmikroskopi (forstørrelse, 40 x).
I tillegg ble morfologiske endringer av eggstokkreft celler undersøkt under et fasekontrastmikroskop. A2780 og OV2008 celler dyrket uten PMBPs vises karakteristisk normal form med 70% samløpet etter 24 timer. Men cellenes konfluens ble dramatisk redusert med tydelige morfologiske forandringer ved PMBPs behandling. Cellene begynte å krympe, mistet sin normale form, ble rund og til syvende og sist løsgjøres fra kulturskålen (figur 1B). I kontrast, gjorde vi ikke observere slike morfologiske forandringer i normale eggstokkreft celler, IOSE80, etter PMBPs behandling (figur 1B). Alle sammen, disse dataene indikerer at PMBPs selektivt hemme levedyktigheten av eggstokkreft celler med mindre effekt på ikke-ondartede celler.
PMBPs indusere eggstokkreft kreftcellenes apoptose
For å vurdere om de anti-tumor effekter av PMBPs på A2780 og OV2008 celler var assosiert med apoptose ble eggstokkreft celler farget med DAPI og observert under et fluorescens mikroskop (figur 2A). Etter behandling med forskjellige konsentrasjoner av PMBPs til 24 timer, atom kromatin kondensasjon og fragmentert punctata blå kjerne fluorescens ble observert i eggstokkreft celler på en doseavhengig måte, i likhet med de morfologiske endringer i apoptotiske celler, men kontrollcellene viste normal og intakte kjerner. Det tyder på at PMBPs kan indusere apoptose av eggstokkreft celler.
(A) A2780 og OV2008 celler ble behandlet med PMBPs (0, 25, 50, 100 ug /ml) i 24 timer. De morfologiske forandringer av kjerner ble undersøkt ved fluorescensmikroskopi ved bruk av DAPI farging. Pilene viser atom kondens og apoptotiske legemer (forstørrelse, 100 ×). (B) A2780 og OV2008 celler ble behandlet med PMBPs (0, 10, 25, 35, 50 ug /ml) i 24 timer. Strømningscytometri ble brukt til å analysere Annexin V-FITC /PI doble fargede A2780 celler. Den lave høyre (LR) kvadrant av histogrammene indikerer begynnelsen av apoptotiske celler, og øverst til høyre (UR) kvadrant indikerer slutten av apoptotiske og nekrotiske celler. (C) Behandling av A2780 og OV2008 celler med PMBPs resulterte i dramatisk økning i andelen av apoptotiske og nekrotiske celler (inkludert tidlig apoptose, sent apoptose og nekrose). Eksperimentene ble gjentatt tre ganger.
** P .. 0
01
sammenlignet med kontrollgruppen
For ytterligere å kvantifisere apoptose forårsaket av PMBPs, A2780 og OV2008 celler ble merket med Annexin V-FITC /PI og analysert ved strømningscytometri. Den nedre høyre kvadrant (LR) viser prosentandelen av tidlige apoptotiske celler (Annexin V
+ og PI
-) og øvre høyre kvadrant (UR), prosentandel av sen apoptotiske og nekrotiske celler (Annexin V
+ og PI
+). Resultatene viste at PMBPs utløste apoptose av eggstokkreft celler, som starter på 25 ug /ml, i en doseavhengig måte (figur 2B). Prosentandelen av det totale apoptotiske og nekrotiske celler A2780 celler var 1,17% i kontrollceller (LR: 0,2% og UR: 0,97%), 2,46% i celler behandlet med 10 mg /ml PMBPs (LR: 2.42% og UR: 0,04% ), 17,63% i celler behandlet med 25 mg /ml PMBPs (LR: 16,12% og UR: 1,51%), 49,24% i celler behandlet med 35 mg /ml PMBPs (LR: 41.87% og UR: 7,37%) og 77,23% i celler behandlet med 50 ug /ml PMBPs (LR: 71,44% og UR: 5,79%) (figur 2B). Tilsvarende de i OV2008 celler var 5,78% i kontrollcellene (LR: 0,83% og UR: 4,95%), 6,46% i celler behandlet med 10 ug /ml PMBPs (LR: 1,38% og UR: 5,08%) 21,45% i celler behandlet med 25 mg /ml PMBPs (LR: 13.88% og UR: 7,57%), 59.94% i celler behandlet med 35 mg /ml PMBPs (LR: 24,79% og UR: 35,15%) og 55,31% i celler behandlet med 50 ug /ml PMBPs (LR: 10,21% og UR: 45,1%) (figur 2B). Våre resultater viser at PMBPs kunne gi en betydelig indusere både tidlig og sent apoptose i eggstokkreft celler (
p
0,01). (Fig 2C)
PMBPs indusere mitokondriemembranen potensielle tap
det er kjent at mitokondrier skade under apoptose endrer mitokondriemembranpotensialet [12]. For å utforske virkningen av PMBPs på mitokondriemembranpotensialet, ble cellene behandlet med PMBPs detektert ved JC-1 fargestoff. Som vist i figur 3, er den gjennomsnittlige prosentandelen av grønn fluorescens-positive A2780-celler var 2,41% uten behandling, 20,63% ved 25 ug /ml, 43,77% ved 35 ug /ml og 66,6% ved 50 ug /ml PMBPs behandling. Tilsvarende de i OV2008 celler var 0% uten behandling, 36,28% ved 25 ug /ml 43,81% ved 35 ug /ml og 78,79% ved 50 ug /ml (figur 3A). Det var signifikant doseavhengig økning i grønne fluorescens-positive celler (figur 3B) (
p . 0
01
), noe som tyder på at tapet av mitokondriemembranpotensialet korrelert med økende dose av PMBPs behandling. Derfor er apoptose av eggstokkreft celler ved PMBPs forbundet med skade på mitokondriemembranen.
(A) A2780 og OV2008 celler ble behandlet med PMBPs (0, 25, 35, 50 ug /ml) i 24 timer og deretter høstet, farget med JC-1 fargestoff, og endelig analysert ved flow-cytometri. (B) PMBPs behandling resulterte i en betydelig økning av grønn fluorescens-positive (GFP) celler som indikerte tapet av mitokondriemembranpotensialet. Eksperimentene ble gjentatt tre ganger.
** P .. 0
01
sammenlignet med kontrollgruppen
PMBPs oppregulere apoptose relaterte proteiner og undertrykke BCL-2
Siden PMBPs kan indusere apoptose i eggstokkreft celler, vi videre undersøkt noen apoptose relaterte proteiner ved Western blot. Nivået av β-Actin tjente som indre kontroll. Vi fant at uttrykket av anti-apoptotisk protein Bcl-2 i eggstokkreft celler behandlet med PMBPs betydelig redusert på en doseavhengig måte (
p. 0
01
) (fig 4A , 4B og 4C). Caspase medlemmer er viktige formidlere av apoptose [13]. Uttrykk for caspase-3 og caspase-9 ble vurdert. Kløyvet-caspase-3 og spaltes-caspase-9 uttrykk nivåer ble dramatisk oppregulert etter PMBPs behandling i eggstokkreft celler (
p. 0
01
) (figur 4A, 4B, 4D og 4E). Disse resultater antyder at PMBPs aktivere caspase-avhengig apoptose svei.
(A, B) A2780 og OV2008 celler ble behandlet med PMBPs (0, 15, 25, 35, 50 ug /ml) i 24 h og deretter høstet. Cellelysater ble fremstilt og utsatt for Western blot-analyse. Protein nivåer av BCL-2, spaltet-kaspase-3 og spaltet-caspase-9 ble målt ved Western blot. (C, D, E) histogrammer viser betyr uttrykket nivåer av BCL-2, spaltet-kaspase-3 og kaspase-spaltet-9 (± SD), henholdsvis fra tre uavhengige eksperimenter. Bcl-2, spaltet-caspase-3 og spaltede-caspase-9 nivåer ble uttrykt i forhold til lastekontroll, β-aktin. Alle forsøk ble gjentatt tre ganger
** P .. 0
01
sammenlignet med kontrollgruppen
PMBPs hemme migrasjon og invasjon av eggstokkreft. celler
Cell migrasjon og invasjon er kjennetegn for kreftceller. For å undersøke hvorvidt PMBPs svekket migrering og invasjon av eggstokkreft celler, utførte vi sårheling analysen med forskjellig, ikke apoptotisk (5 ug /ml og 10 ug /ml), konsentrasjoner av PMBPs i 24 timer. Vi fant at PMBPs doseavhengig redusert bevegelse av A2780 og OV2008-celler (figur 5). De sår nedleggelse priser av PMBPs behandlede cellene var lavere enn for ikke-behandlede celler (
P . 0
01
) (figur 5B og 5C). I tillegg undersøkte vi invasivitet av disse cellene ved anvendelse av en 24-brønners transwell kammer i nærvær av forskjellige konsentrasjoner av PMBPs i 24 timer. PMBPs vesentlig hemmet migrasjon og invasjon potensialet i eggstokkreft celler i en doseavhengig måte (
P . 0
01
) (figur 6). Behandling med 5-25 ug /ml PMBPs hemmet migrering og invasjon av 27% -66%, henholdsvis, i A2780-celler, og 11% -40% i OV2008 celler, sammenlignet med kontroller (figur 6B og 6C). Både sårheling analyse og transwell kammer analysen tyder på at PMBPs kunne undertrykke migrasjon og invasjon av eggstokkreft celler.
monolag av A2780 og OV2008 celler ble skrapet med en pipette tips og behandlet med PMBPs (0, 5, 10 , 25 ug /ml) i 24 timer. (A) Representative bilder av trekkende celler i henhold mikroskop ved 100 x forstørrelse feltet, før og etter skade. (B, C) Migrering av A2780 og OV2008 celler ble kvantifisert ved å måle lukking av sår områder før og etter skade. Eksperimentene ble gjentatt tre ganger. **
P 0
01 Hotell og ***
P … 0
001
sammenlignet med kontrollgruppen
A2780 og OV2008 celler ble behandlet med PMBPs (0, 5, 10, 25 ug /ml) i 24 timer. (A) Representative bilder av cellene som migrerte og invaderte på undersiden av transwell membran ved 100 x forstørrelse under et mikroskop. (B, C) Antall celler fra hvert felt ble tellet og beregnet. Invaderte celler ble uttrykt i forhold til den i kontrollgruppen. Eksperimentene ble gjentatt tre ganger. **
P 0
01 Hotell og ***
P … 0
001
sammenlignet med kontrollgruppen
Inhibering av MMP-9 aktivitet og ekspresjon av PMBPs
Gitt virkningene av PMBPs for ovarial cancer cellemigrering og invasjon, vi undersøkt videre mekanismene for denne prosessen. Siden MMP-9 spiller en viktig rolle i kreft invasjon, vi neste detekterte MMP-9-enzymaktivitet og uttrykk etter PMBPs behandling. MMP-9 aktivitet i kondisjonert medium ble undersøkt ved zymografi gelatin, og MMP-9-ekspresjon ble undersøkt ved Western blot. PMBPs doseavhengig trykt MMP-9 aktivitet (figur 7A) og redusert MMP-9 protein uttrykk nivå (
P . 0
05
) (figur 7B). Dermed kan den inhiberende aktivitet av PMBPs på invasivitet av eggstokkreft være, i det minste delvis, på grunn av undertrykkelse av MMP-9 aktivitet.
Cellene ble behandlet med PMBPs (0, 5, 10, 25 ug /ml) i 24 timer. (A) Aktivitet av MMP-9 i cellesupernatanten ved forskjellige konsentrasjoner av PMBPs ble undersøkt ved hjelp av gelatin-zymografi assay. De hvite bånd representerer MMP-9-mediert gelatin fordøyelse. (B) Et protein ekspresjon av MMP-9 i A2780-celler ved forskjellige konsentrasjoner av PMBPs ble vurdert ved Western blot. Histogram viser gjennomsnittlig nivå av MMP-9 (± SD) fra tre uavhengige eksperimenter. MMP-9-proteinet nivået ble uttrykt i forhold til lastekontroll, β-aktin, og standardisert til den ikke-behandlede kontrollgruppe. *
P . 0
05 Hotell og **
P .. 0
01
sammenlignet med kontrollgruppen
PMBPs svekke NFkB kjernefysisk translokasjon og MAPK veien aktivering
Mange studier har vist at å hemme NFkB aktivitet kan undertrykke kreftcelle invasjon [14,15,16]. Vi har derfor undersøkt effekten av PMBPs på NFkB aktivitet i eggstokkreft celler. Behandling av A2780 celler med PMBPs betydelig redusert kjernefysiske translokasjon av NFkB og fosforylering av IκBα (
P . 0
05
) (Fig 8A og 8C). Disse blir bedt om at PMBPs kan, i det minste delvis, undertrykke ovarial cancer celle invasjon ved inhibering av NFkB-aktivitet. Flere studier har indikert at aktivering av mitgen-activatied proteinkinaser (MAPK) inkludert ERK1 /2, p38MAPK, JNK er involvert i tumor migrering og invasjon, og at disse MAPK opptrer oppstrøms av NFkB [17,18,19]. Derfor aktiveringsstatusen til ERK1 /2, p38MAPK og JNK ble undersøkt i A2780 celler behandlet med forskjellige konsentrasjoner av PMBPs. PMBPs betydelig hemmet ERK1 /2 og p38MAPK aktivisering, men ikke JNK (
P . 0
05
) (fig 8B og 8D). Således kan undertrykkelse av ERK1 /2 og p38MAPK aktivering ved PMBPs bidra til nedsatt invasjon potensialet av eggstokkreft celler.
(A, B) Cellene ble behandlet med PMBPs (0, 5, 10, 25 ug /ml) i 24 timer. Cellelysater ble fremstilt og utsatt for Western blot-analyse. Proteininnholdet av kjernefysisk p65, p-IκBα, IκBα, p-ERK, p-p38 og p-JNK ble målt. (C, D) histogrammer viser gjennomsnittlig (± SD) nivå av kjernefysisk p65, p-IκBα, IκBα, p-ERK, p-p38 og p-JNK fra tre uavhengige eksperimenter. Den kjernefysiske p65, p-IκBα, ble IκBα, p-ERK, p-p38 og p-JNK ekspresjonsnivåer uttrykt i forhold til laste- styrings β-aktin og standardisert til den ikke-behandlede kontrollgruppe. *
P . 0
05 Hotell og **
P .. 0
01
sammenlignet med kontrollgruppen
Diskusjoner
Eggstokkreft er fortsatt den ledende dødsårsaken i gynekologisk kreft i stor grad på grunn av sent stadium diagnose og begrensede effektive behandlinger, spesielt i tilbakevendende sykdom [20]. Naturlige produkter som stammer fra planter er lovende terapeutiske midler for kreftbehandling [21]. Derfor har vi utforsket den potensielle nytten av proantocyanidiner fra
Pinus massoniana
bark på eggstokkreft celler i oppdrag å finne nye effektive legemidler for eggstokkreft behandling. Våre data her vist at PMBPs redusert spredning, apoptose og undertrykte migrasjon av eggstokkreft celler.
Pinus massoniana
bark ekstrakt har blitt rapportert å hemme veksten av flere typer kreft. Det selektivt hindret spredning av menneskelig lever BEL-7402 og HepG2 celler, men litt fremmet veksten av humane normale leverceller L-02 in vitro [8,9,22]. Det er også undertrykkes veksten av humane cervikale kreft HeLa-celler og indusert apoptose. I denne studien fant vi at proantocyanidiner hentet fra
Pinus massoniana Lamb bark vesentlig hemmet spredning av eggstokkreft celler, men ikke påvirke normal eggstokkceller. Vi observerte også at kreftcellene krympet og løsrevet fra kultur retter etter PMBPs behandling, noe som tyder på at PMBPs selektivt hindre vekst av eggstokkreft celler og forårsake celledød.
Vi undersøkt videre anti-tumor mekanismer ansatt i PMBPs på eggstokkreft celler. Apoptose spiller en svært viktig rolle i å eliminere mutert eller hyper-voksende kreftceller [23]. Det finnes flere typer av naturlige produkter som har blitt rapportert å hindre vekst av kreftceller via apoptoseinduksjon [24]. Noen studier har vist at
Pinus massoniana
barkekstrakt indusere apoptose i humane cervikale kreft HeLa-celler, humane hepatomceller HepG2-celler og muse-sarcoma S180-celler på en doseavhengig måte [9,10,11]. I denne studien, DAPI flekker data viste at celler behandlet med PMBPs vises spesifikke apoptotiske morfologiske endringer. Flowcytometri data videre indikert at andelen av apoptotiske celler signifikant økt etter PMBPs behandling. Alle disse resultatene tyder på at PMBPs induserer apoptose i eggstokkreft celler.
induksjon av apoptose er relatert til undertrykkelse av anti-apoptotiske proteiner og oppregulering av pro-apoptotiske proteiner [25]. Det har blitt rapportert at Bcl-2-protein er viktig i reguleringen av mitokondriene-assosierte apoptotiske reaksjonsvei [26]. Nedregulering av Bcl-2 resulterer i tap av mitokondriemembranpotensialet og frigjøring av cytokrom
c
fra mitokondrier til cytosol å aktivere caspase-9 [27]. Den spaltede-caspase-9 aktiveres ytterligere caspase-3, en av de viktigste enzymer i den indre apoptotiske reaksjonsvei, for å indusere følgende apoptotiske arrangementer [28]. Heri våre resultater viste at PMBPs induserte et betydelig tap av mitokondriemembranpotensialet. I tillegg observerte vi reduksjonen av Bcl-2-ekspresjon sammen med forhøyede nivåer av spaltede-kaspase-9 og spaltet-caspase-3 in ovarian cancer celler behandlet med PMBPs. Det kan anses som PMBPs kan indusere apoptose gjennom mitokondriene assosierte apoptotiske sti.
Vi fant at PMBPs effektivt undertrykt eggstokkreft migrasjon og invasjon. En viktig faktor som muliggjør metastatisk spredning av kreftceller er proteolytiske enzymer som nedbryter den omgivende ekstracellulære matriks, og dermed letter cellemigrering gjennom basalmembranen. Matriks-metalloproteinaser (MMP) er involvert i matrisen remodellering [29]. Med hensyn til kreft i eggstokkene, har ekspresjonen av MMP-9 blitt koblet med invasive undertyper [30]. Vårt arbeid viser at PMBPs kunne nedregulerer MMP-9-ekspresjon og aktivitet. Derfor kan PMBPs undertrykke MMP-9 aktivitet for å svekke de migrasjons- og invasjons mulighetene eggstokkreft celler.
Aktivering av NFkB er avgjørende for migrasjon og invasjon av eggstokkreft celler [31,32,33]. Vi foreslo at PMBPs kan undertrykke NFkB aktivitet og hemme eggstokkreft invasjon. Fosforyleringen av IκBα kan slippe NFkB subenheter som transporteres fra cytoplasma til kjernen av celler for å regulere målgener [34]. I denne studien vi observert at IκBα fosforylering og NFkB translokasjon fra cytoplasma til kjernen hemmet av PMBPs behandling (Fig 8A og 8C). NFkB fungerer som transkripsjonsfaktor for MMP-9 regulering [35,36]. Våre resultater viser at PMBPs undertrykke NFkB aktivitet og dette positivt korrelert med nedregulering av MMP-9 uttrykk.
MAPK signalkaskade, inkludert ERK1 /2, p38 MAPK og JNK, har vært innblandet i migrasjon og invasjon av mange kreftcelletyper [37,38,39]. I denne studien spekulert vi at PMBPs kan motvirke MAPK signalveier å undertrykke migrasjon og invasjon av eggstokkreft celler. Våre data antyder at det PMBPs behandling inhiberte aktiveringen av ERK1 /2 og p38 MAPK i en doseavhengig måte, men hadde liten effekt på JNK-reaksjonsveien (figur 8B og 8D).
