Abstract
SALL4 spiller viktige roller i utvikling og progresjon av mange kreftformer. Men rollen og molekylære mekanismen av SALL4 i livmorkreft forblir unnvikende. I foreliggende undersøkelser har vi vist at ekspresjon av SALL4 ble oppregulert i endometriecancer og positivt korrelert med tumorstadium, metastase og dårlig overlevelse av pasienter. Overekspresjon av SALL4 fremmet invasivitet i endometrial kreft celler, som angitt ved oppregulering av mesenchymale cellemarkør N-cadherin og nedregulering av den epiteliale markør E-cadherin, og invasjons analyser in vitro. I tillegg var det også en økning i legemiddelresistens i disse cellemodeller på grunn av oppregulering av ATP-bindende kassett multidrug transporter ABCB1 uttrykk. Videre fant vi også at ABCB1 var avgjørende for SALL4-indusert resistens. I kontrast, SALL4 knockdown restaurert medikament følsomhet, reverseres EMT, redusert celle metastase og undertrykte nedregulering av E-cadherin og oppregulering av N-cadherin og ABCB1. Videre viste vi at SALL4 oppregulert c-myc uttrykk og c-myc var et direkte mål for SALL4 av Chip analyse, utarming av c-myc med siRNA avskaffet SALL4-indusert nedregulering av E-cadherin, oppregulering av N-cadherin og ABCB1 Dette tyder på at c-Myc var et nedstrøms mål for SALL4 og som kreves for SALL4-indusert EMT, invasjon og narkotika motstand i endometrial kreft celler. Disse resultatene indikerte at SALL4 kan indusere EMT og resistens mot antineoplastiske medikamenter gjennom regulering av c-Myc. SALL4 og c-myc kan være nye terapeutiske mål for livmorkreft
Citation. Liu L, Zhang J Yang X, Fang C, Xu H, Xi X (2015) SALL4 som en epitelial-Mesenchymale Overgang og Drug Resistance induser gjennom regulering av c-myc i livmorkreft. PLoS ONE 10 (9): e0138515. doi: 10,1371 /journal.pone.0138515
Redaktør: Lu-Zhe Sun, University of Texas Health Science Center, UNITED STATES
mottatt: 27 april 2015; Godkjent: 30 august 2015; Publisert: 25.09.2015
Copyright: © 2015 Liu et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette prosjektet ble støttet med tilskudd fra Natural Science Foundation National of China (NSFC nr 81172478). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Livmorkreft kreft~~POS=HEADCOMP er den syvende vanligste kreftformen med nesten 200 000 kvinner diagnosen på verdensbasis hvert år [1]. I Europa er det ca 9000 kvinner dør av livmorkreft hvert år. Tidlig diagnose og behandling har ingen signifikant effekt på dødelighet [2]. Kirurgi, kjemoterapi og adjuvant strålebehandling er de viktigste terapeutiske metoder til livmorkreft. Likevel, et mindretall av pasientene er følsomme for disse terapi [3]. Derfor er det viktig å finne nye terapeutiske mål å utdype de molekylære mekanismene bak livmor karsinogenisitetsstudier.
SALL4, et medlem av SALL genet familien, er en transkripsjonsfaktor. Det er en viktig faktor i opprettholdelsen av pluripotency og selvfornyelse i embryonale stamceller [4-6]. De tidligere undersøkelser har vist at SALL4 deltok i å regulere spredning av blodkreft stamceller [7, 8]. SALL4 er blitt vist å delta i vedlikehold av kjemosensitivitet gjennom regulering av ATP-bindende kassett (ABC) medikament transportør i leukemi [8-10]. Den avvikende ekspresjon av SALL4 ble funnet i mange kreftformer, inkludert bakterier celle svulster [11], brystkreft [12], hepatocellulært karsinom [13, 14], magekreft [15]. Imidlertid er den funksjonelle rolle og molekylære mekanismen av SALL4 ikke godt karakterisert ved livmorkreft.
EMT er en grunnleggende biologisk prosess der epitelceller gjennomgå en dramatisk ombygging av cytoskjelettet, mister basal-apikal polaritet og får en økt kapasitet til å metastasere til fjerntliggende organer [16-18]. Myometrial invasjon er en av de viktigste prognostiske faktorer i endometriet [19]. Men EMT har vært dårlig forstått i livmorkreft i forhold til andre typer kreft [20].
multiresistens er et vanlig fenomen i nesten alle kreftformer og et stort hinder for vellykket kjemoterapi [21]. Store mekanismer for resistens ble nært knyttet til ABC flermedisin transportører aktivert. ABC multidrug-tilhengere som ABCB1, ABCC1 og ABCG2 ble ansett for å være ansvarlig for de fleste av narkotika utstrømning i kreft hos mennesker [21, 22]. En økning i ABC-tilhengere uttrykk hadde noe å gjøre med en dårlig prognose i mange typer kreft. ABCB1, også kalt MDR1, var en av de tidligste ABC transportører for å bli identifisert. Den høye ekspresjon av ABCB1 ble funnet i de fleste av endometrial cancer vev [23]. Likevel, den eksakte rolle for ABCB1 i livmorkreft er ennå ikke klarlagt.
c-myc onkogen kodet et evolusjonært konservert enkel transkripsjonsfaktor, og uttrykk for c-myc var ofte avvikende i mange kreftformer [24, 25]. Overekspresjon av c-myc er blitt funnet å være involvert i differensiering, initiering og progresjon i livmorkreft [26]. Mange studier har vist at overekspresjon av c-Myc var nært knyttet til kjemoterapi motstand og EMT prosess. Derfor er vi interessert i å avgjøre om c-myc er involvert i kjemoterapi motstand og EMT i livmorkreft.
I den foreliggende forskningen, viste vi at SALL4 uttrykket ble oppregulert og forbundet med dårlig overlevelse i livmorkreft. SALL4 i endometrial kreftceller ikke bare indusert oppkjøpet av egenskapene til EMT, men også fremmet migrasjon og invasjon gjennom aktivering av c-myc. I tillegg fant vi også at c-myc fungert som et direkte mål gen av SALL4 og var involvert i SALL4-indusert legemiddelresistens ved å regulere uttrykket av ABCB1. I konklusjonen, disse funnene tyder på at SALL4 spiller viktige roller i livmorkreft metastaser og narkotika motstand, med c-myc som en viktig nedstrøms mål.
Materialer og Metoder
Pasienter og vev
80 endometriekreft prøver og 10 normale endometrial prøver ble innhentet fra pasienter som gjennomgikk kirurgisk behandling 2010-2013 ved Shanghai Jiao Tong University Affiliated Shanghai First Folkets sykehus (Shanghai, Kina). En annen seks par frosne nontumorous vev og matchet tilstøtende endometriekreft vev ble innhentet fra seks pasienter på Shanghai First Folkets sykehus fra 2014 til 2015. Ingen pasienter hadde fått neoadjuvant behandling før operasjonen. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle pasienter. The Human Investigation Etisk komité Shanghai First Folkets sykehus Affiliated Shanghai Jiao Tong University godkjent denne studien.
Cell kultur
livmorkreft cellelinjer RL95-2, Ishikawa, HEC1-A, HEC1-B , AN3CA og KLE ble hentet fra Chinese Academy of Sciences komiteen Type Culture Collection (Shanghai, Kina). Celler ble dyrket i DMEM tilsatt 10% føtalt bovint serum
Immunhistokjemi
Immunhistokjemi ble utført på parafininnstøpte vev ved hjelp av primære antistoffer som følger: a. Anti-SALL4 (Santa Cruz Inc., Santa Cruz, CA, USA). For vurdering av ekspresjonen av SALL4, ble fargeintensitet som mottok 3 (sterk), 2 (middels), 1 (svak), eller 0 (negativ). Graden av farging ble scoret som 4 (76% -100%), 3 (51% -75%), 2 (26% -50%) 1 (1% -25%), eller 0 (0%). Summen av omfanget score og intensiteten Poengsummen ble ansett som den endelige farging poengsum. En endelig farging score ≥ 4 var positiv for uttrykk.
knockdown av SALL4 i AN3CA celler
Den høye SALL4 uttrykk livmorkreft cellelinje AN3CA ble brukt til å etablere stabile SALL4 knockdown cellelinje. SALL4-shRNA1 og SALL4-shRNA2 lentiviral plasmider (GenePharma, Shanghai, Kina) ble brukt til å utføre knockdown eksperiment. AN3CA celler infisert med en egge shRNA var hensyn som en kontroll. SALL4 knockdown effektivitet ble bekreftet av western blotting. Sekvensene for egge shRNA og SALL4 shRNAs er oppført som følger: SALL4shRNA1: 5’GCCTTGAAACAAGCCAAGCTA3 «; SALL4shRNA2: 5’CTATTTAGCCAAAGGCAAA3». Og Scr-shRNA: 5’CCTAAGGTTAAGTCGCCCTCG3 «
Transfeksjon
Plasmid konstruksjon ble utført i henhold til standardprosedyrer. For kloning av SALL4A (GenBank tilgangsnummer. AY172738) og SALL4B (GenBank tilgangsnummer. AY170621) isoformer, polymerase kjedereaksjon (PCR) primere ble utformet. SALL4A og SALL4B cDNA i et uttrykk vektor ble syntetisert fra GenePharma (Shanghai, Kina). Ishikawa celler ble stabilt transfektert med SALL4A eller SALL4B. Sekvensene for c-Myc siRNA: Sense: 5′-GGACUAUCCUGCUGCCAAGdTdT-3 «, Antisense: 3′-dTdT CCUGAUAGGACGACGGUUC-5». Sekvensene for ABCB1 siRNA: Sense: 5′-AGAGAAGAAACCAGUGGUC-3 «, Antisens: 5′-GACCACUGGUUUCUUCUCU-3». I henhold til protokollen fra produsenten, ble siRNA transfektert ved hjelp av Lipofectamine 2000 (Invitrogen).
Western blotting
Western blotting ble utført som beskrevet tidligere [27]. I korte trekk, ble proteinene ekstrahert fra dyrkede celler og separert ved SDS-PAGE. Proteiner av interesse ble fastsatt ved bruk av tilsvarende spesifikke antistoffer etter overføring til PVDF membraner. De følgende antistoffer ble benyttet for analyse: antistoff mot c-Myc (kanin polyklonalt, Cell Signaling (Beverly, MA, USA); D84C12), anti- SALL4 (mus monoklonalt, Santa Cruz Inc, SC-101 147) og anti-ABCB1 ( mus monoklonalt, Santa Cruz Inc, SC-55510). Anti-E-cadherin (Rabbit Polyclonal, ab53226), anti-N-cadherin (Rabbit Polyclonal, ab18203) og GAPDH (Rabbit monoklonalt, ab181603) ble kjøpt skjema Abcam (Cambridge, UK).
Kvantitativ RT PCR
i henhold til produsentens anvisninger, ble totalt RNA utarbeidet etter TRIzol (Invitrogen) og revers transkribert som tidligere beskrevet [28]. Grunning for ABCB1, E-cadherin, N-cadherin, c-myc og GAPDH gener ble syntetisert fra Invitrogen bioteknologi Corporation (Shanghai, Kina). QRT-PCR reaksjoner ble satt opp med 2 ul cDNA mal, 10 ul SYBR Grønn PCR Master Mix og 1 ul primer blanding. PCR-betingelsene var 95 ° C i 5 minutter, etterfulgt av 40 sykluser ved 94 ° C i 1 min, 60 ° C i 30 s og 72 ° C i 45 s.
Chromatin immunoutfelling
Ifølge produsentens protokoll, var chip analysen gjennomført ved bruk av chip-IT kit (Active Motif). Chromatinimmunoprecipitated DNA ble underkastet PCR-amplifikasjon for SALL4 bindingssetet i promoteren c-Myc. Spesifikke c-myc primere er som følger: frem: 5′-TCAAGAGGCGAACACACAAC-3 «; omvendt: 5»-GGCCTTTTCATTGTTTTCCA-3 «. PCR-produktet (c-Myc: 110bp). Ble oppløst ved elektroforese på en 1% agarosegel og visualisert ved etidiumbromidfarging
Celleviabilitet assay
A forskjellig konsentrasjon av karboplatin (0, 20, 40 og 60μg /ml) behandlede celler sådd ut i 96-brønners plater. Celletelling leder-8 (Dojindo, Japan) ble brukt for å vurdere cellelevedyktigheten etter behandling med karboplatin i 24 timer. Absorbansen ble undersøkt ved 450 nm gjennom en mikroplateleser.
Colony formasjon analysen
Om 10
3 celler ble sådd ut i en seks-brønns kultur plate. Celler ble fiksert med 10% formaldehyd-løsning og farget med 10% Giemsa etter behandling med 20 ug /ml karboplatin ved 37 ° C inkubator i 10 dager. Antallet kolonier inneholdende 50 celler ble tellet under et mikroskop
sårhelende assay
En ripe ble trukket inn i cellelaget etter 24 timers inkubering i en 6-brønns plate. . Fotografier ble tatt ved 0 timer og 48 timer for å måle overføringen. Avstanden av celler migrering ble undersøkt.
celle invasjon assay
1 x 10
5-celler ble sådd ut i det øvre kammer av 24-brønners plater Transwell (Corning, NY, USA) belagt med BD matrigel basalmembran matrise med serumfritt medium. DMEM /F12 supplert med 10% føtalt bovint serum ble tilsatt til det nedre kammer. Etter inkubering i 16 timer ble de invasive cellene tellet under et mikroskop. Alle prøvene ble platet i triplikat.
Statistiske analyser
Alle dataene er presentert som gjennomsnitt ± standardavvik. Statistisk signifikans ble analysert ved t-test. Khikvadrattest for 2 × 2 bord ble brukt til å sammenligne kategoriske data. Verdien av P 0,05 ble betraktet som signifikant. Alle forsøkene ble utført i tre eksemplarer.
Resultater
Uttrykket av SALL4 er oppregulert og forbundet med dårlig overlevelse i livmorkreft
For å identifisere funksjonen til SALL4 i livmorkreft, vi først vurderte uttrykk for SALL4 i seks ferske nontumorous vev og matchet tilstøtende endometriekreft vev. Som vist i figur 1A, SALL4 ekspresjon i endometrial cancer vev var signifikant høyere enn i nontumorous vev (p 0,05). Uttrykket av SALL4 i 80 endometriekreft vev og 10 normale endometrial vev ble undersøkt gjennom immunhistokjemi. Vi fant at SALL4 var høyere i livmorkreft (56/80) sammenlignet med vanlige endometriale vev (0/10) (figur 1B, S1 tabell). Differansen var statistisk signifikant i de to gruppene (p 0,01). Sammenhengen mellom ekspresjonen av SALL4 og clinicopathological egenskaper ble vist i tabell 1. Vi har vist at en øket SALL4 uttrykk i endometrial cancer var signifikant assosiert med lymfeknutemetastaser (P = 0,048), tumorstadium (P = 0,001), myometrial invasjon ( P = 0,007) og dårlig overlevelse (figur 1C). Som konklusjon viser disse resultater indikerer at SALL4 ekspresjon i endometrial cancer er nært knyttet til dårlig overlevelse av pasienter.
(A) Et uttrykk for SALL4 i endometrial cancer vev og nontumorous vev ble undersøkt ved western blotting. (B) Bildene viste immunhistokjemisk farging av SALL4 i normale endometrium og endometriekreft vev (00D7200). (C) Kaplan-Meier analyse indikerte at uttrykket av SALL4 var assosiert med dårlig overlevelse av pasienter.
SALL4 induserer EMT og invasiv fenotype i livmorkreftceller
Vi ønsket å finne ut om SALL4 var involvert i EMT og metastasering blant endometrial kreft celler, ble SALL4 uttrykk evalueres til å velge hensiktsmessige cellelinjer for vår forskning i livmorkreft cellelinjer: AN3CA, KLE, HEC1-B, HEC1-A, RL-952 og Ishikawa. Som vist i figur 2A, AN3CA og KLE celler viste åpenbare mesenchymale fenotype, men Ishikawa og RL-952-celler viste åpen epitelceller egenskaper (S1 Fig). Uttrykket av SALL4 var assosiert med epitel /mesenchymale egenskaper i disse livmorkreft cellelinjer. Cellene som er forbundet med relativt sterke mesenchymale egenskaper viste en høy SALL4 uttrykk. To shRNAs spesielt rettet mot både SALL4A og SALL4B ble brukt til å slå ned endogen SALL4 i AN3CA celler med relativt høyere uttrykk av SALL4. Knockdown av SALL4 proteinnivåer i AN3CA celler førte til økt protein og mRNA-nivåer i epitel etikett E-cadherin og reduserte den for mesenchymale markør N-cadherin, følger med celler morfologisk overgang fra en spredt spindel-formet mesenchymale utseende til en rund, tettpakket morfologi (fig 2B, 2C og 2D). I tillegg knockdown av SALL4 (figur 2E og 2F) i AN3CA celler dempes cellemigrering og invasjon evne. Tvert imot ble Ishikawa celler med lav endogen nivå SALL4 transfektert med SALL4A og SALL4B cDNA vektor (kontroll vektor). Overekspresjon SALL4 førte til en morfologisk endring fra en tettpakket, rund morfologi til en spindel-formet spredt morfologi i Ishikawa-celler, redusere protein- og mRNA-nivåer i epitel etikett E-cadherin og øke den for mesenchymale markør N-cadherin (Fig 2B , 2C og 2D). Overekspresjon av SALL4 dramatisk økt migrasjon og invasjon evne Ishikawa celler (Fig 2E og 2F). I korte trekk, disse data tyder på at SALL4 induserer EMT og metastase i endometrial kreft celler
(A) N-cadherin, E-cadherin, ble SALL4A og SALL4B vurdert av western blotting i livmorkreft cellelinjer. AN3CA , KLE, HEC1-B, HEC1-A, RL-952 og Ishikawa. (B) Cell morfologi ble undersøkt i Ishikawa celler transfektert med SALL4A eller SALL4B ekspresjonsvektor og AN3CA celler transfektert med SALL4-SH1 eller SALL4-SH2. (C) (D) protein og mRNA-nivåer av E-cadherin og N-cadherin ble analysert i Ishikawa-celler transfektert med SALL4A eller SALL4B ekspresjonsvektor og AN3CA-celler transfektert med SALL4-SH1 eller SALL4-SH2. (E) Cell migrasjon og invasjon av Ishikawa eller AN3CA ble undersøkt gjennom sårtilheling analyse og transwell invasjon analysen. (F) Graden av migrering og invasjon i Ishikawa og AN3CA-celler ble analysert. * P. 0,01
SALL4 stasjoner kjemoterapeutisk legemiddelresistens i livmorkreftceller
Drug motstand er et betydelig hinder som påvirker den totale overlevelsen for avanserte og tilbakevendende livmorkreftpasienter. Vi ønsket å teste om SALL4 i livmorkreftceller deltatt i formidling cellular motstand mot cellegifter. Det ble avslørt ved hjelp av cellelevedyktighet assay som en økning i cellelevedyktighet når det utsettes for karboplatin var mye mer uttalt i Ishikawa-celler transfektert med enten SALL4A eller SALL4B enn i celler transfektert med tom vektor (figur 3A). I mellomtiden ble overekspresjon SALL4 i rollen av celler spredning undersøkt gjennom klon dannelsesbestemmelsen i Ishikawa-celler behandlet med 20 ug /ml karboplatin. Ishikawa-celler transfektert med SALL4A eller SALL4B vises øket motstand karboplatin og celleproliferasjon sammenlignet med kontrollen (Fig 3B). Tvert imot, celleviabilitet analysen og klone-analysen indikerte at knockdown av SALL4 betydelig redusert motstand mot karboplatin i AN3CA celler (figur 3A og 3B). I sammendraget, disse funnene tyder på at SALL4 induserer resistens i livmorkreftceller.
(A) Ishikawa celler transfektert med SALL4A eller SALL4B uttrykk vektor og AN3CA celler transfektert med SALL4-SH1 eller SALL4-sh2 ble behandlet med indikerte konsentrasjoner av karboplatin, og celleviabilitet-analyse ble utført. (B) Ishikawa celler transfektert med SALL4A eller SALL4B ekspresjonsvektor og AN3CA celler transfektert med SALL4-SH1 eller SALL4-sh2 ble behandlet med carboplatin, ble klone-analysen utføres. ** P 0,01, * P. 0,05
ABCB1 er kritisk for SALL4-indusert resistens
De fleste av resistens i kreft hos mennesker er forbundet med ATP-bindende kassett (ABC) multidrug-tilhengere. Det er ikke klart om ABCB1 er involvert med SALL4-indusert kjemoterapi motstand og en nedstrøms target gen direkte regulert av SALL4 i livmorkreft. Det ble avdekket gjennom western blotting som SALL4 oppregulering i SALL4A- eller SALL4B-transfektert Ishikawa celler betydelig økt protein uttrykk for ABCB1 sammenlignet med tom vektor (fig 4A). En lignende SALL4 knockdown forsøket ble satt i kraft i AN3CA celler. Som vist i figur 4A, kan SALL4 stanse tilsynelatende nedgang ABCB1 protein uttrykk. Disse data indikerte at SALL4 kunne oppregulere uttrykk for ABCB1. Fordi ABCB1 (MDR1) var avgjørende for legemiddelresistens og oppregulert i livmorkreft, ønsket vi å finne ut om ABCB1 var involvert i SALL4-indusert resistens. Vi videre Silenced ABCB1 uttrykk av spesifikke siRNA i Ishikawa celler som overuttrykker SALL4, og funnet ut at nedregulering av ABCB1 redusert SALL4-indusert resistens (fig 4B og 4C). Den nedregulering av mRNA og proteinnivåer ABCB1 ble bekreftet ved QRT-PCR og Western blotting (fig 4D og 4E). Samlet utgjør disse dataene viser at SALL4 induserer kjemoterapeutisk legemiddelresistens gjennom regulering av ABCB1 i livmorkreftceller.
(A) Western blotting viste at ektopisk overekspresjon av SALL4 oppregulert ABCB1 protein uttrykk i Ishikawa celler og knockdown av SALL4 i AN3CA celler downregulated ABCB1 uttrykk. (B) (C) Ishikawa-celler transfektert med SALL4A eller SALL4B vektor eller kontroll vektor ble transfektert med si-ABCB1 eller kontrollere siRNA. Medikamentsensitivitet av Ishikawa celler til karboplatin ble undersøkt ved hjelp av cellelevedyktighet analysen og klon formasjon assay. (D) (E) Et protein og mRNA-nivåer av ABCB1 ble vurdert ved Western blotting og QRT-PCR. ** P. 0,01
c-myc er nødvendig for SALL4-indusert EMT og narkotika motstand
c-myc spiller viktige roller i mange onkogene prosesser, herunder svulst legemiddelresistens og metastasering. Den tidligere forskning har vist at SALL4 i livmorkreftceller fremmet c-myc transkripsjonen aktivitet [29]. Vi var interessert i å avgjøre om c-myc var nødvendig for SALL4-indusert EMT og kjemoterapi motstand. I samsvar med forrige undersøkelse, viste vi at uttrykket av c-myc var positivt korrelert med at av SALL4 av western blotting, og c-myc var et direkte mål på SALL4 gjennom ChIP analysen i livmorkreftceller (figur 5A, 5B og S2 fig). Vi neste forstummet c-myc uttrykk av siRNA i SALL4A- og SALL4B-transfekterte Ishikawa celler, og viste at c-myc downregulation dramatisk redusert SALL4-indusert celle invasjon og narkotika motstand (figur 5C, 5D og 5E). Protein- og mRNA-nivåer av c-myc ble påvist ved western blotting og QRT-PCR (figur 5F og 5G). Videre ble reversering av invasiv fenotype indusert av c-myc stanse i SALL4 overekspresjon i Ishikawa celler bekreftet av nedregulering av mesenchymale markør N-cadherin og oppregulering av epitel markør E-cadherin av western blotting og QRT-PCR (Fig 5F og 5H ). Samtidig fant vi også at c-myc siRNA behandling betydelig redusert SALL4-indusert ABCB1 proteinnivå (figur 5F). Disse resultatene indikerer at c-myc er nødvendig for SALL4-indusert EMT og kjemoterapi motstand.
(A) ekspresjon av c-myc var positivt assosiert med den for SALL4 i Ishikawa og AN3CA celler ved western-blotting-analyse. (B) c-myc var et direkte mål på SALL4 gjennom ChIP analysen. (C) nedregulering av c-myc av spesifikke siRNA redusert SALL4-indusert invasjonen i Ishikawa celler som overuttrykker SALL4 av transwell analysen. (D) (E) nedregulering av c-Myc redusert SALL4-indusert legemiddelresistens i Ishikawa-celler som overuttrykker SALL4 gjennom levedyktighet assay og klon formasjon assay. (F) Et uttrykk for EMT-relaterte markører og ABCB1 ble undersøkt ved western-blotting i Ishikawa-celler. (G) (H) mRNA nivåene av c-Myc, E-cadherin og N-cadherin ble påvist gjennom QRT-PCR i Ishikawa-celler. ** P. 0,01
Diskusjoner
Det blir stadig klarere at aggressive kreftceller vises en plast, multipotent fenotype ligner på pluripotent /stilk lignende tilstand i embryonale celler og basal-lignende tumorceller [30]. Embryonale stamcelleliknende genekspresjon signatur har vist seg å være nært knyttet til dårlig differensierte aggressive humane svulster og har blitt sett på som et potensielt mål for fremtidige kreftterapi [31]. SALL4 er en transkripsjonsfaktor som opprettholder pluripotency og selvfornyelse i embryonale stamceller og spiller en viktig rolle i fosterutviklingen. Imidlertid er de funksjonelle roller og molekylære mekanismen av SALL4 i livmorkreft ikke godt karakterisert.
I denne studien, viste vi at SALL4 uttrykket ble oppregulert i livmorkreft og positivt korrelert med dårlig prognose og aggressive egenskaper. Vi har vist at en økt ekspresjon av SALL4 fremmes metastase av EMT prosessen så vel som kjemoterapi motstand gjennom modulering av ABCB1 i endometrial kreft celler. Betydelig, fant vi ut at en nedstrøms mål for SALL4, c-myc, var uunnværlig for å SALL4-indusert EMT og uttrykk for ABCB1. Disse funnene viser at SALL4 og c-myc kan være lovende terapeutiske mål i livmorkreft (fig 6).
SALL4 indusert EMT og ABCB1 uttrykk, som senere bidro til invasjonen og chemoresistance i livmorkreftceller. ABCB1 var kritisk til SALL4-indusert chemoresistance. I tillegg SALL4 også oppregulert c-myc uttrykk, som var nødvendig for SALL4-indusert EMT og ABCB1 uttrykk. I sammendraget, SALL4-indusert EMT og narkotika motstand gjennom aktivering av c-myc i livmorkreft.
SALL4 spiller viktige roller i flere tumorassosierte prosesser, inkludert cellen metastaser og medikamentresistens. Metastase er ikke bare den viktigste årsaken til kreftdød men også de ondartede egenskaper kreft. Kreftceller som gjennomgår EMT prosessen vil overta invasivitet og metastase evne. Den foreliggende forskning viste at SALL4 indusert EMT-relaterte proteiner inkludert en reduksjon i cellulære adhesjonsmolekyler E-cadherin og en økning i mesenchymale markeringen N-cadherin. Uttrykket av E-cadherin og N-cadherin var nært knyttet til kreftceller invasiv og metastatisk kapasitet. Våre resultater ble støttet av tidligere studier som viser at downregulated uttrykk for E-cadherin var signifikant assosiert med myometriets invasjon og pasient overlevelse i livmorkreft [32, 33]. Den nylige undersøkelser har vist at SALL4 var involvert i metastase og progresjon i kolorektal kreft [34]. I tillegg SALL4 overekspresjon indusert EMT i magekreftceller, med øket ekspresjon av Twist1, N-cadherin og redusert ekspresjon av E-cadherin [15]. I mellomtiden ble det rapportert at SALL4 undertrykket ekspresjon av genet adhesjon CDH1 (E-cadherin), og positivt regulerte CDH1 suppressor ZEB1 og vedlikeholdes celle dispersjon i basal-lignende brystkreft [35]. Dette bevis antydet at SALL4 kan indusere EMT og fremme invasjon i en rekke av tumorer. Etter avtale med en tidligere studie [29], fant vi at oppregulering av SALL4 betydelig økt livmorkreftceller migrasjon og invasjon. Enda viktigere, vi demonstrert at overekspresjon SALL4 var i stand til å indusere EMT og fremme metastaser i livmorkreftceller.
Kjemoterapeutika er den mest effektive behandlingen for pasienter med metastatisk kreft. Men legemiddelresistens er fortsatt et alvorlig hinder for vellykket kjemoterapi [21]. Blant ulike mekanismer som er involvert i kjemoterapeutisk motstand, ble ABC transportører antatt å være nært knyttet til resistens. Montering bevis indikerte at ABC transportører spilt viktige roller i SALL4-indusert kjemoterapeutiske motstand i en rekke kreftformer. For eksempel ble det nylig rapportert at SALL4 var involvert i kjemoterapeutisk motstand ved direkte å regulere nedstrøms målet genet ABCA3 i akutt myelogen leukemi [10]. Dessuten har de siste rapportene viser at SALL4 positivt regulert uttrykk for ABCA3, påvirker følsomheten til kjemoterapi narkotika i kronisk myelogen leukemi [36]. Overekspresjon av SALL4 ført til en økt celleformering forbundet med oppregulert ekspresjon av (ATP) -binding kassett-G2 (ABCG2) i hepatocellulært karsinom [13]. ABCB1 er prototypen på dette gen-superfamilien, og dens deregulering har vært forbundet med legemiddelresistens i flere typer kreft [21]. Bevis hadde vist at uttrykket av ABCB1 var unormalt i livmorkreft [23]. Disse funnene bedt oss om å undersøke om ABCB1 deltatt i SALL4-indusert kjemoterapi motstand i livmorkreft. I samsvar med rollen som SALL4-indusert resistens via moduler ABC transportører i andre krefttyper, har vi funnet at ABCB1 var involvert i SALL4-indusert resistens i livmorkreft. Nedregulering av ABCB1 betydelig blokkert SALL4-indusert resistens. Disse data antydet at ABCB1 var en viktig mediator blant SALL4-indusert resistens i livmorkreft.
Den tidligere studie har vist at c-myc indusert EMT i mammary epitelceller [37]. I tillegg kan c-myc bidra til kreftceller kjemoresistent fenotype gjennom regulerings ABC transporter gener [38]. Det ble rapportert at c-myc kombinert med epigenetiske mekanismer regulert ABC transporter gener uttrykk i KML [39]. I denne studien fant vi at c-myc var et direkte mål for SALL4 og nødvendig for EMT og ABCB1 uttrykk indusert av SALL4, som fører til metastasering og resistens i livmorkreftceller. Det ble demonstrert av tidligere studier som høyere ekspresjon av c-myc var signifikant assosiert med redusert totaloverlevelse i endometrial carcinoma pasienter [40, 41]. Dessuten ble det også rapportert at den transkripsjonelle aktiviteten til c-myc ble regulert direkte ved SALL4 i endometrial kreft celler [29]. Våre data var i samsvar med den foregående disse resultatene. Men denne studien var mangel på data som er involvert i å vurdere uttrykket av ABCB1 og c-myc i endometriekreft prøver. Det ville være mer overbevisende hvis dataene at ekspresjonsnivået av SALL4 var positivt assosiert med de av ABCB1 og c-Myc i en undergruppe av endometriekreft prøvene ble tilsatt. I sammendraget, c-myc var av essensen i SALL4-indusert EMT og stoffet motstand og kan være et terapeutisk mål for livmorkreft.
Til sammen har vi vist at SALL4 uttrykk ble oppregulert i livmorkreft og positivt korrelert med dårlig prognose og aggressive egenskaper. Vi identifiserte at SALL4 ikke bare indusert EMT, men også økt resistens gjennom ABCB1 i livmorkreftceller. Vi viste videre at c-myc var uunnværlig for SALL4-indusert EMT og kjemoterapi motstand. Konklusjonen vår studie gitt en potensiell molekylære mekanismer knyttet til SALL4-indusert invasjon og kjemoterapi motstand i livmorkreft. SALL4 og c-myc kan være nye terapeutiske mål for livmorkreft.
Hjelpemiddel Informasjon
S1 Fig. SALL4 induserer EMT i livmorkreftceller product: (A) mRNA nivået av E-cadherin og N-cadherin ble vurdert gjennom QRT-PCR i livmorkreft cellelinjer:. AN3CA, KLE, HEC1-B, HEC1-A, RL . -952 og Ishikawa
doi: 10,1371 /journal.pone.0138515.s001 plakater (TIF)
S2 fig.
