Abstract
Bakgrunn
Mangel på pålitelige prediktive biomarkører er en snublestein i forvaltning av prostatakreft (CAP). Prostataspesifikt antigen (PSA) er mye brukt i klinikker har flere begrensninger som en cap biomarkør. Afrikansk-amerikanske Cap pasientene har dårlig prognose enn kaukasiere, og spesielt serum-PSA utfører ikke bra i denne gruppen. Videre, noen menn med lav serum-PSA forbli ubemerket for cap før de utvikler sykdom. Dermed er det et behov for å identifisere en pålitelig diagnose og prediktiv biomarkør av Cap. Her viser vi at BMI1 stamcelle protein er sekretorisk og kan utforskes for biomarkør bruk i Cap pasienter.
Metodikk /hovedfunnene
Semi-kvantitativ analyse av BMI1 ble utført i prostatavevet av TRAMP (stedegne transgen musemodell), menneske Cap pasienter, og i cellebaserte modeller som representerer normale og ulike Cap fenotyper i afrikansk-amerikanske og kaukasiske menn, ved å bruke immunhistokjemi, immunoblotting og Slot-blotting. Kvantitativ analyse av BMI1 og PSA ble utført i blod og kultur-media av siRNA-transfekterte og ikke-transfekterte celler ved å anvende ELISA. BMI1 protein er (i) som utskilles av Cap-celler, (ii) økning i det apikale området av epitelceller og stromal region i prostatatumorer, og (iii) påvist i humant blod. BMI1 kan påvises i blodet hos Cap pasienter i en rekkefølge av økende tumorstadium, viser en positiv korrelasjon med serum-PSA og viktigere er synlig hos pasienter som utviser lav serum-PSA. Den kliniske betydningen av BMI1 som en biomarkør kan fastslås fra observasjon at CAP cellene skiller ut dette proteinet i høyere nivåer enn celler representant for benign prostatahyperplasi (BPH).
Konklusjon /Betydning
BMI1 kunne utvikles som en dual bio-markør (serum og biopsi) for diagnose og prognose av CAP i kaukasiske og afrikansk-amerikanske menn. Selv om bevisende disse dataene garanterer videre etterforskning i en kohort av afrikansk-amerikanske pasienter
Citation. Siddique HR, Parray A, Zhong W, Karnes RJ, Bergstralh EJ, Koochekpour S, et al. (2013) BMI1, stamcellefaktor Fungerende som Novel Serum-biomarkør for kaukasiske og afrikansk-amerikansk prostatakreft. PLoS ONE 8 (1): e52993. doi: 10,1371 /journal.pone.0052993
Redaktør: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, USA
mottatt: 23. oktober 2012; Godkjent: 27 november 2012; Publisert: 07.01.2013
Copyright: © 2013 Siddique et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble delvis støttet av det amerikanske forsvarsdepartementet CDMRP gi W81XWH-08-1-0605 til tilsvarende forfatteren. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Ifølge American Cancer Society, vil 241 740 bli diagnostisert med prostatakreft (CAP) og 28,170 Cap pasienter ble anslått å dø i år 2012 i USA alene [1]. Utilfredsstillende utfallet av overordnet styring (behandlingsstrategier og prognose overvåking) for Cap sykdommen kan være knyttet til mangelen på en pålitelig prognostisk serum-biomarkør. Selv om det er mye brukt, har flere viktige begrensninger er rapportert i serum-PSA som en prognostisk biomarkør [2]. For eksempel, i noen tilfeller Cap, er serum-PSA (a) detektert lite, om noe, (b) mangler tilstrekkelig følsomhet, og (c) ikke klarer å diskriminere potensielt signifikante kreft fra ubetydelige de [2] – [4]. PSA reflekterer ikke kreft biologi og en høy risiko for feilaktige resultater [5] – [6]. Videre har avvik i PSA som en diagnostisk markør mellom ulike etniske grupper som kaukasiere og afrikansk-amerikansk tilbakevist forvaltningen av denne kreftformen [6] – [7]. Derfor et stort behov vedvarer for utvikling av bedre serologiske biomarkører i Cap, som er pålitelig for prognose og diagnose i kaukasiske og afrikansk-amerikanske pasienter.
Det er økende bevis for at polycomb gruppe (PCG) proteiner spiller en avgjørende rolle i kreftutvikling og tilbakefall av sykdommen [8]. B-celle-spesifikke Moloney murin leukemivirus integreringssete 1 (BMI1) er et velkjent markør som brukes i stamcellebiologi [8] – [9]. BMI1 som har en allestedsnærværende mønster av ekspresjon i nesten alle vev blir ofte oppregulert i ulike typer av kreft hos mennesker [8] – [10]. Vi har nylig anmeldt betydning BMI1 i fremveksten av chemoresistance i ulike typer kreft, inkludert CAP [8]. Den aktuelle studien er den første kliniske bevis som viser at BMI1 er en sekretorisk protein som har et enormt potensial til å bli utviklet som et serum-biomarkør for Cap og sin prognose i både kaukasiske og afrikansk-amerikanske befolkningen. Vi foreslår at serum-BMI1 som en biomarkør ville prestere bedre enn PSA. Videre BMI1 kan brukes som en dual biomarkør i serum samt biopsi.
Materialer og metoder
Prostata vev og Serumprøver fra menneskelige Cap pasientenes
prostata vev kirurgisk høstes fra menneskelige Cap pasienter og matchende parafinblokker ble anskaffet fra Cooperative menneskelig vev Network Midwestern Division, The Ohio State University (Columbus, Ohio). Serumprøver på menneske Cap pasienter ble anskaffet fra serum bank (BioServe, Beltsville, MD). Andre parafininnstøpte deler av menneskelige prostata vev av 70 pasienter med normal og adenokarsinom ble hentet fra ISU Abxis Co Ltd, (Seoul, Sør-Korea).
Cellelinjer
Cellelinjer stammer fra både europear og afrikansk amerikanske mans ble brukt i vår studie. Normal og udødelig prostata epitel cellelinje (RWPE1), Cap cellelinjer (LNCaP, C42b, PC3, Du145, Vcap og PCA- 2b), prostata stromal myofibroblasts (WPMY1), kolon normale epitelceller (FHC) og tykktarmskreft cellelinjer ( SW480, HCT116 og HT29) og human pankreatisk karsinom-cellelinjer PANC1 og AsPC1 ble oppnådd fra ATCC (Manassas, VA). Normale bukspyttkjertelen duktale epitel celler, ble premaligne Kras mutant E6E7-Ras og ondartede Kras mutante E6E7-Kras-st celler hentet fra D. Paul M. Campbell (H. Lee Moffitt kreftsenter, Tampa, Florida) [11]. BPH-1 celler ble anskaffet fra Dr. Simon Hayward (Vanderbilt University, Nashville, Tennessee) som utviklet dem som beskrevet [12]. Etablering og karakterisering av RC77N /E, RC77T /E og E006-celler ble beskrevet tidligere [13] – [14]. Celler ble dyrket i egnet medium supplert med 10% FBS (ATCC, Manassas, VA) og 1% penicillin-streptomycin (Invitrogen, Carlsbad, CA) under standard cellekulturbetingelser av 5% CO
2 i en inkubator ved 37 ° C.
Cell Utvalg
(a) kaukasiske Cells: RWPE1 (normal), BPH-en (ikke-ondartet hyperplasi) og, LNCaP, C4-2B, PC-3, Du145 og Vcap representerer kaukasisk prostatakreft. WPMYI1 stromale fibroblaster ble også anvendt. (B) afroamerikanske Celler:. RC77N /E (normal), og RC77T /E, PCA-2B, E006 representerer African American prostatakreft
Antistoff, plasmider og siRNA
monoklonalt anti- BMI1 antistoff ble anskaffet fra Millipore (Temecula, California). pbabe-BMI1 plasmid (BMI1-overekspresjon) var en slags gave fra Dr. Chi V. Dang (The Johns Hopkins University, Baltimore, MD). . BMI1-sirnas ble kommersielt kjøpt fra Dharmacon (Lafayette, CO)
Immunohistochemistry
Immunhistokjemisk farging ble utført som beskrevet tidligere [15] – [16]. Kort sagt ble parafinsnitt (som skal vurderes for BMI1) forbehandlet med citratbuffer (pH 6) i 10 minutter i en mikrobølgeovn for antigen gjenfinning. Seksjoner ble inkubert med primært antistoff (anti-BMI1) i en fortynning på 1:50 i 12 timer ved 4 ° C. Platene ble deretter inkubert i 2 timer ved romtemperatur med passende HRP-konjugert sekundært antistoff. Lysbilder ble utviklet i tre, 3′-diaminobenzidene (DAB kit, Invitrogen, Carlsbad, California) og teller farget med hematoksylin. De fargede objektglass ble dehydratisert og montert i Permount løsning under dekkglass
Western blot-analyse
immunoblot-analyse ble utført som beskrevet tidligere [16] -. [17]. Kort sagt ble cellelysatene fremstilt i kald lyseringsbuffer [(0,05 mmol /L Tris-HCl, 0,15 mmol /l NaCl, 1 mol /liter EGTA, 1 mol /l EDTA, 20 mmol /l NaF, 100 mmol /l Na
3VO4, 0,5% NP-40, 1% Triton X-100, 1 mol /l fenyl metylsulfonyl fluorid (pH 7,4)] med protease inhibitor cocktail (Roche, Indianapolis, IN). lysatet ble samlet og lagret ved -80 ° C. protein~~POS=TRUNC innholdet~~POS=HEADCOMP i lysatene ble målt ved BCA-proteinanalyse (Pierce, Rockford, IL) i henhold til leverandørens protokoll. For Western blot-analyse, ble 40 ug protein løst i 10% SDS-PAGE-geler, overført til PVDF membraner (Millipore, Bedford, MA) og deretter inkubert i blokkeringsbuffer (5% fettfri tørrmelk /1% Tween 20, i 20 mmol /l TBS, pH 7,6). 2 timer Blottene ble inkubert med BMI1 primært antistoff, vasket og inkubert med HRP-konjugert sekundært antistoff (Sigma, St. Louise, MO). Blottene ble detektert med kjemiluminescens (ECL kit, Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). lik lasting av protein ble bekreftet ved stripping av blottene og re-sondering med β-aktin (Sigma, St. Louis, MO). Densitometry målinger av de skannede band ble utført som beskrevet tidligere [16].
Påvisning av protein i cellekultur media
Celler fikk vokse opp til 80% samløpet i fullstendig media. Ved 80% konfluens nivå, ble media fjernet og cellene ble vasket med PBS to ganger. Etter vasking ble cellene tilsatt til serumfritt medium. Celler ble dyrket i serumfritt medium i 24 timer. Etter 24 timer ble mediet samlet og analysert for BMI1 sekretorisk protein ved hjelp Immuno-Slot-blot analysen. Slot-blot analyse ble utført i henhold til produsentens protokoll (Whatman, Florham Park, NJ). I korthet ble Slot-blot-apparat monteres ved hjelp av Whatman filterpapir og en forhåndsfuktet nitrocellulosemembran. Deretter ble Apparatet ble forbundet med en vakuumpumpe. Slots ble fylt med prøver (media /serum) og deretter tegnet av vakuum (ubrukte spor ble fylt med PBS). Membranene ble deretter blokkert i 2 timer i blokkeringsbuffer (5% fettfri tørrmelk). Blottene ble inkubert med primært antistoff BMI1, vasket og inkubert med HRP-konjugert sekundært antistoff (Sigma, St. Louise, MO). Blottene ble oppdaget med chemiluminescence (ECL kit, Amersham Biosciences).
Fjerning av Albumin fra serumprøver
Albumin ble fjernet fra humane serumprøver ved hjelp Albumin Removal Kit (Pierce, Rockford, IL ) som per leverandørens protokoll. Prøver som inneholder 1000 mikrogram total protein ble lastet opp på en enkelt fjerning plate, hvor hver plate er rapportert å ha en bindende kapasitet på . 2 mg albumin
Evaluering av PSA protein nivåer med ELISA
Dette ble utført ved hjelp av menneskelig PSA-spesifikke ELISA (Anogen, Ontario, Canada) som per leverandørens protokoll.
Kvantifisering av sekretorisk BMI1 protein i dyrkningsmedier
Dette ble utført ved hjelp av en BMI1-spesifikke ELISA (Antistoffer-online Inc., Atlanta, GA). Rekombinant BMI1 protein ble brukt til å tjene som standard for denne analysen.
BMI1-siRNA og pbabe-BMI1 (BMI1-uttrykke plasmid) transfeksjon å validere at BMI1 er faktisk skilles ut av hetten celler
trans ble utført ved hjelp Lipofectamine (Invitrogen, Carlsbad, California) som per leverandørens protokoll. Av denne grunn, først intracellulær BMI1 fra kaukasisk Cap (LNCaP og Du145) og African American CAP (E006) epitelceller ble bestemt.
Under en
st tilnærming.
BMI1 ble slått ned av shRNA i kaukasiske og afroamerikanske celler. 12 timer etter transfeksjon ble cellene dyrket i komplett medium i 12 timer. Etter 24 timer etter transfeksjon, ble mediene fjernet og cellene ble dyrket i serumfritt medium i 24 timer. Etter 24 timer ble serum-frie medier fra BMI1-knockdown celler samles og skilles-BMI1 nivåene ble målt med ELISA.
Under to
nd tilnærming.
prostata kreft celler som representerer kaukasisk og African American sykdom ble transfektert med BMI1-overekspresjon plasmid. 12 timer etter transfeksjon ble cellene dyrket i komplett medium i 12 timer. Etter 24 timer etter transfeksjon, ble mediene fjernet og cellene ble dyrket i serumfritt medium i 24 timer. Etter 24 timer ble serum-frie medier fra BMI1-overekspresjon celler samles og skilles-BMI1 nivåene ble målt med ELISA.
Androgen behandling av celler
På grunn av dette, kaukasiske og African American prostata epitelceller ble behandlet med androgen analog (R1881) i 12 timer. Etter 12 timer ble mediet fjernet, og cellene ble dyrket i ytterligere 12 timer. Etter 24 timer ble cellene høstet å bli vurdert for intracellulær BMI1 uttrykk av western blot analyse.
Statistiske analyser
Grafiske oversikter over fordelingen av fargeintensitet ble gjort ved hjelp av spredningsplott og boksplott. Enkle lineære egression og korrelasjonsmetoder var bruk for å vurdere sammenhengen mellom BMI1, Ptil og Cap rang (1 = normal, 2 = Stage II, 3 = Stage III, 4 = Stage IV). For å korrigere for skjevhet, ble BMI1 og PSA analysert på en stokk (Base2) skala. En p-verdi på 0,05 ble ansett for å være statistisk signifikant
Resultater
Bmi1 protein nivåer i prostata vev øker med progressive stadier av sykdommen i transgene TRAMP musemodeller
Glinsky et al. [18] tidligere viste at Bmi1 protein er forhøyet i prostata vev av Tramp mus, en innfødt musemodell for Cap utvikling, undersøkte vi om en progressiv økning i nivåene av Bmi1 i prostatavevet kunne oppdages under progressiv alder av Cap. For dette formålet brukte vi prostata vevsprøver innsamlet på ulike aldersgrupper av Tramp transgene mus. Som vist i figur 1A; Bmi1 protein ble observert å være synlig i alle aldre av Tramp mus. Generelt, fargingen var sterkere i prostatiske epitelceller fra eldre mus enn i prostatiske epitelceller fra yngre mus. Glatte muskelceller har mye sterkere farging enn fibroblastceller. Den fargemønster av Bmi1 protein ble sammenlignet i en alder av 17 uker til 45 uker gamle prostata- prøver (fig. 1A). Disse dataene viste økt uttrykk nivåer av Bmi1 protein i prostata av eldre i alderen mus (Fig. 1a). Det var en intens farging i det apikale området av epitelceller. Stromal regioner ble observert å ha en positiv farging (Fig. 1a).
(A) Mikrofotografier representerer farging av BMI1 i prostata vev av transgene Tramp mus. Pilene viser farging for BMI1. Forstørrelse × 40. (Bi) Mikrofotografier viser BMI1-positive neoplastiske og ikke-neoplastiske regioner av prostata eksemplarer av Cap pasienter som vurderes av farging. Pilene viser farging for BMI1. Forstørrelse × 40. (Bii) Boksplott for BMI1 protein basert på poengsummen gjelder farging mønster i normale og Cap eksemplarer i stromal region *, P . 0,05; svarte linjen i boksen, medianverdier.
BMI1 protein uttrykk i prostata vevsprøver fra Cap pasienter
Spesielt noen epitelceller transgen muse prostata epitelceller viste tett apikale flekker som tyder på at Bmi1 kan være et sekretorisk protein. Vi neste identifisert uttrykk for BMI1 i menneskelige Cap prøvene ved immunhistokjemisk analyse og bestemt dens uttrykk nivåer i stromale regioner i 70 pair-matchet eksemplarer av normal og Cap representerer alle kreft etapper. Intensiteten av immunoperoksidasefarging for BMI1 ble scoret som 0 (negativ), 1 (svak), 2 (middels) og 3 (sterk). Immunostains viste flekker i både ikke-neoplastiske og neoplastiske stroma. Generelt, fargingen var sterkere i neoplastiske stroma enn i ikke-neoplastiske stroma. Epitelcellene viste også positiv farging for antistoffet (Fig. 1Bi). Glatte muskelceller har mye sterkere farging (3) enn fibroblastceller (0-1 +). Den fargemønster av BMI1 protein ble sammenlignet i stadium II-IV Cap prøver (Fig. 1Bi). Disse dataene viste økt uttrykk nivåer av BMI1 protein i høy klasse svulst i menneskelig Cap (Fig. 1Bi). Boksen plott av dataene for BMI1 protein ekspresjon i stroma oppviste en bred inter-prøven variasjon i kreft prøver, sammenlignet med normale vev, og viste en signifikant forskjell i nivået av protein mellom normale og netting vev (p. 0.05, fig 1Bii ). Den gjennomsnittlige poengsum for fargeintensitet av BMI1 i stroma av normalt vev var 0,81 ± 0,07 (n = 70), og var betydelig lavere enn høyverdig stadium II (1,8 ± 0,08, n = 36), stadium III (2,26 ± 0,10 n = 28) og stadium IV (2,8 ± 0,11; n = 6) cancerprøver (fig 1Bii;. p 0,05). Et lignende mønster av flekker i par-matchet med netting prøvene ble observert i epithelial av prostata prøver. Samlet utgjør disse dataene viser at uttrykket av BMI1 øker med økende stadium av hetten.
BMI1 uttrykk i normale og neoplastiske prostata celler som representerer Cap sykdom hos kaukasiske menn
Som et forsøk mot å identifisere uttrykket av BMI1 i Cap progresjon, vi først målt protein uttrykk nivåer av immunoblot analyse i flere humane kaukasiske Cap cellelinjer, LNCaP, Du145 og PC3 og sammenlignet dem med NHPE (normal primær prostata epitelceller) og RWPE1 (som representerer normale udødeliggjort prostata epitelceller) hhv. Blant de Cap cellelinjer som benyttes, er LNCaP androgen-avhengige mens Du145 og PC3 er androgen-uavhengig. Valget av disse cellene var basert på det faktum at 80% netting at pasienten har androgen-avhengige sykdom ved tidspunktet for diagnose som senere omdannes til mer aggressiv, androgen-uavhengig sykdom [19]. Som vist i figur 2 (Ai-ii), All Cap cellelinjer utviste en høyere ekspresjon av BMI1 protein enn i normale prostata epitelceller. Når protein ekspresjon av BMI1 ble sammenlignet, basert på densitometrisk analyse av immunoblot, sterkt aggressive PC3-celler og Du145 viste høyere enn ekspresjon i LNCaP-celler (fig. 2Aii). Interessant nok har vi også oppdaget BMI1 ekspresjon i prostata stromale celler (WPMY1) (Fig. 2Ai-ii). Interessant nok var BMI1 uttrykk funnet å være meget lav i prostata epitelceller som representerer benign prostatahyperplasi (BPH) tilstand (data ikke vist).
(Ai) Figur representerer nivået av BMI1 protein i normale og Cap celler av kaukasisk opprinnelse som bedømt ved immunblotanalyse. Lik belastning av protein ble bekreftet ved immunblot reprobing for β-aktin. Blottet som vises her er representative for tre prøver. (Aii) Histogram som viser densitometry analyse av immunoblot av BMI1. *, P 0,05; svart strek i grå boks, medianverdier. (Bi) Figur representerer nivået av BMI1 protein i normale og Cap celler av afrikansk amerikansk opprinnelse som vurderes av immunoblot analyse. Lik belastning av protein ble bekreftet ved immunblot reprobing for β-aktin. Blottene som vises her er representative for tre prøver. (Bii) Histogram som viser densitometry analyse av immunoblot av BMI1. *, P 0,05; svart strek i grå boks, medianverdier. (C) Figur representerer deteksjon av BMI1 i kondisjonkulturmedium av forskjellige celler som vurdert ved slot-blot-analyse. Blottene data som vises her er representative for tre prøver. (D) Deteksjon av utskilt BMI1 protein i kondisjonert kulturmedium av celler. Hver søyle i histogrammet representerer gjennomsnitt ± SE av 3 uavhengige eksperimenter, * representerer P. 0,05
BMI1 uttrykk i normale og neoplastiske prostataceller representerer Cap sykdom i Afrika-amerikanske menn
Aldersjusterte justerte~~POS=HEADCOMP data fra seer studie viste at afrikansk-amerikanske menn har en 60% høyere insidens og 125% høyere dødelighet fra Cap enn kaukasiske menn [1], [13]. Race og familiens historie er de to mest anerkjente risikofaktorer for denne sykdommen [1]. Forstå de underliggende biologiske mekanismene som er ansvarlig for Cap progresjon vil til slutt føre til utvikling av mer effektive terapeutiske strategier. Vi bestemte nivåene av BMI1 uttrykk i en celle-basert in vitro modell som representerer ulike fenotyper av Cap sykdom i afrikansk-amerikanske menn. Disse inkluderer RC77N /E (som representerer normale prostata epitelceller i afrikansk-amerikanske menn), RC77T /E (som representerer androgen-avhengige tumorigene prostata epitelceller), E006 (som representerer androgen-avhengige ikke-tumorigene prostata epitelceller) og PCa-2b ( representerer CRPC fenotype, men beholde androgen respons) [13] – [14]. Som vist i figur 2 (Bi-ii), All Cap cellelinjer RC77T /E, PCa2b og E006 utviste en høyere ekspresjon av BMI1 protein enn i normale celler RC77N /E. Disse dataene (fig. 2A-B) antyder en mulighet for at ekspresjon av intracellulær BMI1 proteinet kan være korrelert med de sekretoriske BMI1 nivåer i humant vev, og kan spille en rolle i aggressivitet av human hetten.
BMI1 er en sekretorisk protein: Detection i serum-frie medier fra Cap cellekulturer
tilstedeværelsen av BMI1 i den apikale delen av prostata epitelceller og stromal regionen bedt oss om å hypoteser om at det kunne være en sekretorisk protein i naturen. For å teste vår hypotese vi spurte om BMI1 utskilles av kreftceller i oppdrett. For å oppdage BMI1 protein i dyrkningsmedier Cap celler, ansatt vi Slot-blot teknikk. Celler i en sammenflytning nivå på 80% ble tillatt å vokse i friskt serumfritt medium i 24 timer. Som det fremgår av fig. 2C, serum frie medier (høstet fra Cap celler kultur) testet positivt for BMI1 protein. Spesielt, media innhentet fra kulturer av epitelceller representative for normal og BPH tilstand viste svært lav BMI1 protein (Fig. 2C).
Kvantifisering av sekretorisk BMI1 i kultur media av celler som representerer cap i kaukasiske og afrikansk-amerikanske menn
ved å ansette et menneske bestemt BMI1-ELISA teknikk, var vi i stand til å oppdage og kvantifisere BMI1 protein utskilt av celler som representerer cap i kaukasiske og afrikansk-amerikanske menn (fig. 2D). Vi er fast bestemt utskilt BMI1protein nivåer (a) i kulturen media av normal, BPH1, og (b) i kulturen media av kreftceller som representerer ulike krefttyper. BMI1 ble påvist i kulturmediet av normale celler (prostata RWPE1; 0,45 ng /ml media) og interessant nivåene av BMI1 ikke ble forhøyet i BPH1 celler (figur 2D.). Sammenlignet med normale RWPE1 celler, oppviste CAP-celler økte sekretoriske BMI1 proteinnivåene i media (fig. 2D). LNCaP, ble observert C42b, PC3 og Du145 celler til å utskille BMI1 protein i et område på 1.3-3.4 ng /ml media (fig. 2D). Det er bemerkelsesverdig at BMI1 utskilt protein ble observert i serumfrie dyrkningsmedier av alle typer Cap cellelinjer som representerer fra normal RWPE1 til mindre aggressive LNCaP til kastreringsresistent prostatakreft (CRPC) celler C42b gjennom svært aggressive Du145 og PC3 celler. Dette funnet bekrefter med data innhentet Cap pasienter som representerer progressive stadier av sykdommen som ble analysert for serum-BMI1 protein nivåer. Spesielt, media hentet fra kulturer av epitelceller E006 (avledet fra African American Cap pasient) viste signifikant høy BMI1 protein (Fig. 2D). Tvert imot, kulturmediet av prostata stromale celler (WPMY1), normale tykktarm epitelceller (FHC) og normal pankreas ductal epitelceller (PDE) ikke oppviser noen utskilte BMI1 nivåer (data ikke vist). Interessant, utskilt BMI1 nivåer ble ikke å bli observert i alle typer bukspyttkjertelen (Kras-mutant PDE, E6E7-Ras og E6E7-Ras-st) og tykktarmskreft cellelinjer (SW480, HCT116), men bare i svært aggressive bukspyttkjertelen cellelinjer AsPC1 (ved meget lave nivåer, og data ikke vist) og tykktarm HT29-celler (data ikke vist). ELISA data fra sekretorisk BMI1 overensstemmelse med våre observasjoner i immunhistochemical analyse av Cap vevsprøver hvor vi observerte en økt stromal farging for BMI1 protein. Dette vil være den første rapporten som viser BMI1 som et sekretorisk protein fra kreftceller.
Utskilt BMI1 i kulturen media er direkte relatert til intracellulære BMI1 av tumorceller
Siden BMI1 ble observert å skille ut i kultur media, forsøkte vi å finne ut om denne utskillelsen er relatert til intracellulære BMI1. Vi benyttet en toveis tilnærming der BMI1 ble enten slått ned eller overexpressed i Cap celler. Etter 24 timer etter transfeksjon, BMI1-trykkes og BMI1-overuttrykt celler ble dyrket i serum-fritt medium for ytterligere 24 timer. Deretter ble serumfritt medium fra transfekterte cellekulturer høstet og analysert for BMI protein ved anvendelse av en ELISA. BMI1 protein nivåer ble observert å være sterkt redusert i BMI1-slått ned celler og økt i BMI1-overuttrykt celler (figur 3A-F; p. 0,05). Disse data viser at BMI1-stilnet tumorceller i betydelig grad utskiller lave nivåer av BMI1 protein og BMI1-overuttrykt CAP-celler utskilte signifikant høye nivåer av BMI1 protein i dyrkningsmedier, tyder dataene på at intracellulær BMI1 er direkte korrelert med de sekretoriske BMI1 proteinnivåer ( fig 3A-F; p. 0,05). Vi spekulerer i at økningen i intracellulære BMI1 nivåer i Cap celler utgjør dens påfølgende utgivelsen av epitelceller i det ekstracellulære rom og fører til en topp i de sekretoriske BMI1 protein nivåer.
(A-F) Figur representerer effekten av (A-C) BMI1-taushet (D-F) BM11-overekspresjon på nivået av utskilt BMI1 protein i kondisjon media av forskjellige celler som vurdert ved ELISA-analyse. Lik belastning av protein ble bekreftet ved reprobing immunoblot for β-aktin. Hver søyle i histogrammet representerer gjennomsnitt ± SE av 3 uavhengige eksperimenter, * representerer P 0,05. (Gi) Figur representerer nivået av BMI1 protein i androgen (R1881) som ble behandlet og ikke-behandlet CAP-celler som vurdert ved immunblotanalyse. Lik belastning av protein ble bekreftet ved immunblot reprobing for β-aktin. (Gii) Histogram som viser densitometry analyse av immunoblot av BMI1. *, P 0,05; svart strek i grå boks, medianverdier.
BMI1 uttrykk i celler som representerer cap i kaukasiske og afrikansk-amerikanske menn er uavhengig av påvirkning av androgen
Forskjellene mellom løpene i androgen konsentrasjoner og følsomhet anses som viktige faktorer for den rasistiske ulikheter i Cap [20]. Men ikke androgen konsentrasjoner ikke alltid relateres til PSA hos kreftpasienter, og noen ganger villede utfallet [21]. Vi neste spurte om BMI1 nivå hos mennesker CAP sykdom har en sammenheng med tilstedeværelse eller fravær av androgen. For dette formålet har vi valgt Vcap (som representerer androgen-uavhengig CRPC fenotype i kaukasiske befolkningen), E006 (som representerer androgen-avhengige ikke-tumorigene prostata epitelceller fra afrikansk-amerikanske befolkningen) og PCa-2b (androgen respons CRPC celler fra afrikansk-amerikanske befolkningen ). Androgen behandling (R1881; 1 nM) av VCap, E006, og PCa-2b-celler førte ikke til vesentlig endring i nivået av BMI1 protein (fig 3Gi-ii;. P 0,05) som således antyder at BMI1 uttrykk er uavhengig av androgen status . Denne informasjonen er viktig fordi aggressive cap i både kaukasiske og afrikansk-amerikaner er ofte androgen uavhengig [6], [19].
Påvisning av BMI1 protein i blodet hos mennesker Cap pasienter
Siden, BMI1 protein ble observert å bli utskilt av humane prostatiske epitelceller in vitro. Vi neste spurte om BMI1 kunne påvises i serum hos Cap pasienter. Ved å ansette Slot-blot analyse, vi fast bestemt på nivåene av BMI1 protein i albumin fritt ryddet sera, fremstilt fra humant blod (tilfeldig valgt fra normal og Cap pasienter). Som det fremgår av fig. 4A, BMI1 protein ble detektert i serumet til pasienter Cap.
(A) Figur representerer deteksjon av BMI1 i humant serum som bedømt ved slot-blot-analyser. Blottet data som vises her er representative for tre prøver. (B) Plot av BMI1 (ng /ml, log-2) versus cap Gruppe rang (n = 58). Horisontal linje er gruppen gjennomsnittet. (C) Plot av PSA (ng /ml, log-2) versus cap Gruppe rang (n = 58). Horisontal linje er gruppen gjennomsnittet. Hver gruppe (Fig F . G) representert som 1 = Normal, 2 = Stage II, 3 = Stage III, og 4 = Stage IV cap. (D) Figur representerer korrelasjonen mellom serum-PSA (ng /ml, log-2) og serum-BMI1 (ng /ml, log-2) (Spearman r = 0,58, p 0,001) i 58 menn. Line er fra enkel lineær regresjon.
Serum-BMI1 protein nivåene øker progressivt med Cap utvikling hos mennesker
neste spurte om serum-BMI1 protein nivåer bære translasjonsforskning relevans som en potensiell biomarkør for iscenesettelse og utvikling av Cap sykdom hos mennesker. For dette formålet undersøkte vi om serum-BMI1 protein nivåer viser en betydelig forskjell med hensyn til ulike stadier av Cap. Vi er fast bestemt serum-BMI1 nivåer i en kohort av 58 forsøkspersoner som representerer normal sykdomsfri tilstand, og ulike Cap stadier, nemlig., Normal (n = 10), Stage II CAP (n = 16), Stage III CAP (n = 15 ), og Stage IV CAP (n = 17). De gjennomsnittlige proteinnivåer i serum-BMI1 i normale mennesker (n = 10) ble estimert til å være ca 1,72 ± 0,30 ng /ml serum (tabell 1). Serum BMI1 nivå for hver enkelt pasient er gitt i Tabell 2. Serum-BMI1 nivåene var lavere i normale humane individer enn i Cap pasienter. BMI1 protein nivåer i humane Cap pasienter var 3,91 ± 0,60 ng /ml i trinn II Cap, 8,55 ± 1,95 ng /ml i stadium III cap og 10,84 ± 2,44 ng /ml i stadium IV CAP (tabell 1). Disse dataene viste at gjennomsnitts serum-BMI1 protein nivåer ble gradvis økte med økende stadium av Cap sykdom hos mennesker (r = 0,72, p 0,001, figur 4B.). Disse data tyder på at serum BMI1 protein nivåer har en translasjonsforskning potensial til å bli utviklet som en roman serum-biomarkør for Cap sykdoms imidlertid videre studier i en stor kohort av pasienter er garantert.
Serum -BMI1protein nivåer ble korrelert med serum PSA nivå
Neste vi undersøkt om en økning i BMI1 løpet Cap utviklingen har en sammenheng med PSA nivåer i disse pasientene (n = 58). I denne Cohort of Cap pasienter, sammenslutning av PSA med progresjon av Cap ble også observert (r = 0,57, p 0,001, figur 4C.). Serum PSA-nivå for hver pasient er gitt i tabell 2. BMI1 ble i liten grad korrelert med PSA (r = 0,58, p 0,001, figur 4D.). BMI1 forble signifikant (p 0,001). Justert for PSA i en regresjonsmodell forutsi kreft stadium gruppe
Diskusjoner
En prognostisk biomarkør gir bevis om pasientens eventuelle utfall fra en sykdom uavhengig av en gitt terapi, mens en prediktiv-biomarkør anslår sannsynligheten for respons /fordel for en bestemt terapi i en bestemt sammenheng [22].
