Abstract
Dødelighet i hode og nakke plateepitelkarsinom (HNSCC) er høy på grunn til fremveksten av terapi motstand som resulterer i lokale og regionale residiv som kan ha sin opprinnelse i resistente kreftstamceller (cscs) eller celler med en epitelial-mesenchymale overgang (EMT) fenotype. I den foreliggende studien undersøker vi muligheten for å bruke celleoverflate-ekspresjon av CD44 og epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR), som begge har vært anvendt som stilk celle markører, for å identifisere subpopulasjoner innenfor HNSCC cellelinjer som skiller seg med hensyn til fenotype og behandling følsomhet. Tre subpopulasjoner, bestående av CD44
høy /EGFR
lav, CD44
høy /EGFR
høye og CD44
lave celler henholdsvis ble samlet av fluorescens-aktivert cellesortering. Den CD44
høy /EGFR
lav befolkning viste en spindel-formet EMT-lignende morfologi, mens CD44
lav befolkning ble dominert av brosteinsformede celler. Den CD44
høy /EGFR
lav befolkning ble beriket med celler i G0 /G1 og viste en relativt lav spredning rente og en høy plating effektivitet. Ved hjelp av en real time PCR array, 27 gener, hvorav 14 var knyttet til en EMT fenotype og to med stemness, ble funnet å være forskjellig uttrykt i CD44
høy /EGFR
lave celler i forhold til CD44
lave celler. Videre CD44
høy /EGFR
lave celler viste lav følsomhet for stråling, cisplatin, cetuximab og gefitinib, og en høy følsomhet for dasatinib i forhold til sin CD44
høy /EGFR
høy og CD44
lave kolleger. Som konklusjon, viser våre resultater at kombinasjonen av CD44 (høy) og EGFR (lav) celleoverflate-ekspresjon kan brukes til å identifisere en behandlingsresistente subpopulasjon med en EMT fenotype i HNSCC-cellelinjer
relasjon:. La Fleur L, Johansson AC, Roberg K (2012) en CD44
høy /EGFR
lav undergruppe innen hode- og halskreft cellelinjer viser en epitelial-Mesenchymale Overgang Phenotype og resistens mot behandlingen. PLoS ONE 7 (9): e44071. doi: 10,1371 /journal.pone.0044071
Redaktør: Andrew Yeudall, Virginia Commonwealth University, USA
mottatt: 5 april 2012; Godkjent: 01.08.2012; Publisert: 25.09.2012
Copyright: © La Fleur et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av den svenske Laryng Foundation, stiftelsen av Signhild Engkvist, Stiftelsen av Åke Wiberg den, den svenske Cancer Society (2008/552, 2010/545), Fylkesordfører i Östergötland og forskningsmidler over Linköping universitetssykehus. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
hode og hals kreft er en kreft som til tross for fremskritt i behandlingen fortsatt er forbundet med alvorlig dødelighet. Dødeligheten er fortsatt høy på grunn av fremveksten av lokale og regionale residiv og utvikling av lymfeknutemetastaser og, av og til, fjernmetastaser. Standard behandling for hode og hals plateepitelkarsinom (HNSCC) pasienter er strålebehandling, ofte i kombinasjon med kirurgi. Kjemoradioterapi har nylig blitt en del av behandlingen av avanserte tumorer, og cisplatin er den vanligste middel i kombinasjon med stråling. I de senere årene har hemming av epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) signaliserte ved bruk av anti-EGFR antistoffer (f.eks cetuximab og panitumumab) eller EGFR tyrosin kinase hemmere (f.eks gefitinib og erlotinib) dukket opp som en ny behandlingsstrategi; derimot, er så langt cetuximab den eneste EGFR-målrettet medikament godkjent for behandling av HNSCC. Radio- og /eller kjemoterapi motstand og tumorer er viktige kliniske problemstillinger i forvaltningen av HNSCCs og behovet for mer effektive behandlingsstrategier haster [1].
HNSCC blant annet epiteliale kreftformer, er en svært heterogen sykdom [2], [3]. Det har vært kjent i lang tid at det er subpopulasjoner av celler i en tumor som skiller seg fra hverandre med hensyn til tumorigenisitet og metastatisk potensiale [4] – [6]. Tilbakevendende tumorer er ofte terapiresistente, og kan ha sin opprinnelse i resistente kreft stamceller (cscs) eller i tumorceller med et epitelial-mesenkymale overgang (EMT) fenotype. EMT er en prosess hvorved epitelceller mister sin polaritet og celle-celle-kontakt og skaffe en vandrende mesenchymale fenotype, og det har vist seg at EMT kunne fremme stamcelleegenskaper. Videre, for å
in vitro
følsomheten HNSCC-cellelinjer som anticancermidler, inkludert EGFR-inhibitorer og cisplatin, er blitt vist å være påvirket av ekspresjonen av EMT-assosierte gener [7], [8]. I HNSCC [9], så vel som i mange andre kreftformer, f.eks, hjerne, prostata, lunge, tykktarm, bukspyttkjertel, lever, melanom og hud neoplasmer [10] – [15], tilstedeværelse av cscs er rapportert. Prince et al viste at CD44 +, men ikke CD44-, celler isolert fra primære HNSCC prøvene kan gi opphav til svulster i mus [16]. En høy celleoverflate-ekspresjon av CD44 har også blitt brukt som en markør for cscs i HNSCC cellelinjer [17], [18]. Nylig ble det publisert at EGFR var ikke til stede på overflaten av normale og kreft keratinocytter som tilfredsstiller kriteriene for stamceller, slik som quiescence, sfære formasjon evne og ekspresjon av stamcelle markører, mens keratinocytter viser EGFR hadde en mer differensiert fenotype [19 ]. Dette tyder på at en lav EGFR celleoverflaten uttrykk kan brukes som en markør for cscs i epiteltumorer.
De fleste tradisjonelle kreft behandlinger ikke ta hensyn til muligheten for at subpopulasjoner av kreftceller eksisterer, og at disse kan oppleve varierende følsomhet overfor en bestemt behandling. Faktisk har leukemiske stamceller har vist seg å være mer motstandsdyktig mot standard cytotoksiske behandlinger [20], [21], og begge glioblastom stamceller og brystkreft-initiering av celler er mer radioresistant [22], [23].
Denne studien undersøker eksistens og egenskaper av subpopulasjoner av celler i tre HNSCC cellelinjer, LK0827, LK0863 og LK0923. Basert på celleoverflate-ekspresjon av CD44 og EGFR, ble tre populasjonene identifisert og analysert med hensyn til CSC og EMT egenskaper samt radio-, cisplatin, cetuximab, gefitinib og dasatinib (multi-BCR /ABL og Src-familie-tyrosinkinase-inhibitor) følsomhet.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
Ferske HNSCC tumor biopsier ble samplet i svulsten samlingen (No 416, National board for helse og velferd i Sverige) på Institutt for ENT – Head and Neck Surgery, Linköping universitetssykehus (godkjent av Regional Etisk Review Board ved Linköpings universitet). Kulturer brukt i denne studien (LK0923, LK0827 og LK0863) ble hentet fra denne samlingen og i samsvar med etiske styret. En skriftlig informert samtykke er innhentet fra alle deltakerne i denne studien. All data analyse i forbindelse med disse kulturene ble utført anonymt.
Cells og kulturforhold
HNSCC cellelinjer LK0923 (strupehode kreft), LK0827 (tungen kreft) og LK0863 (strupehode kreft), var etablert fra ferske HNSCC tumorprøver ved Institutt for ENT – Head and Neck Surgery, Linköping universitetssykehus som tidligere beskrevet [24]. Umiddelbart etter utskjæring, ble tumorprøver neddykket i Ca
2 + – og Mg
2 + -fri fosfatbufret saltvann (PBS-A). Vevet ble vasket, hakket i 1 til 2 mm stykker og plassert i kulturflasker for forplantning. Deretter ble vekstmedium (keratinocytt-SFM; GIBCO, Invitrogen Corporation, Paisley, UK) supplert med antibiotika (penicillin 50 IU /ml, streptomycin 50 ug /ml), Fungizone (0,25 ug /ml) og 20% føtalt bovint serum (FBS ; alt fra GIBCO) ble tilsatt, og tumor eksplantater ble inkubert ved 37 ° C i 5% CO
2 fuktet luft. Fibroblaster forurensende kulturene ble kontinuerlig fjernet ved differensial trypsinering (0,25% trypsin + 0,02% EDTA [ethylendiamintetraeddiksyre]). Etablerte cellekulturer ble dyrket i keratinocytt-SFM supplementert med antibiotika og 1% FBS, gitt friskt kulturmedier to ganger i uken og subdyrket ved konfluens ved bruk av 0,25% trypsin + 0,02% EDTA med en ukentlig deleforhold på ca. 01:02. Celler ble screenet med jevne mellomrom for mycoplasma forurensning ved hjelp av DAPI flekker og /eller Universal Mycoplasma Detection Kit (ATCC, Manassas, VA, USA). Kulturer i passasjene 8 til 15 ble anvendt i eksperimentene.
Strømningscytometri og fluorescens-aktivert cellesortering (FACS)
Cellene ble løsnet ved hjelp av Accutase (PAA Laboratories, Pasching, Østerrike) og underkastet til direkte immunfluorescens farging. Celler ble inkubert i 10% FBS i PBS-A ved 4 ° C, deretter vasket i PBS-A med 1% FBS og inkubert med antistoffer mot CD44 (APC-CD44; Becton Dickinson, San Jose, CA, USA; 01:10 ) og EGFR (PE-EGFR, Abcam, Cambridge, MA, USA; 1:10) eller isotypekontrollantistoffer (APC mus IgG2b, Becton Dickinson og PE rotte IgG2a; eBioscience, San Diego, CA, USA, henholdsvis). Cellene ble vasket, suspendert i PBS-A og ført gjennom 50 um filtre (Becton Dickinson). Prøvene ble analysert på en FACS Aria (Becton Dickinson, FACS Aria spesiell rekkefølge system) og celler med høy CD44 og lav EGFR celleoverflaten uttrykk (CD44
høy /EGFR
lav), celler med høy ekspresjon av begge merkene ( CD44
høy /EGFR
høy), og celler med lav CD44 overflate uttrykk (CD44
lav) ble samlet.
spredningsanalyse og behandling følsomhet
Umiddelbart etter cellesortering ved hjelp av FACS, ble subpopulasjoner utsådd i 12-brønners plater. Etter 10 dagers kultur celler ble fiksert i 4% paraformaldehyd (PFA), farget med krystallfiolett (0,04% i 1% etanol) og deretter oppløst i 1% natriumdodecylsulfat (SDS). Den optiske tetthet ved 550 nm ble målt ved anvendelse av en Victor plateleser (EG Novocastra Laboratories Ltd., Newcastle, UK) i 0,1% saponin og 5% føtalt kalveserum i PBS-A over natten. Som et sekundært antistoff geit anti-mus AlexaFluor 488 konjugert antistoff (1:400; Molecular Probes, Invitrogen, Paisley, UK) ble anvendt. Celler ble montert i Vectashield medium (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) og undersøkt i et Olympus Vanox AHBS3 fluorescens mikroskop. Bilder ble samlet inn ved hjelp av et Olympus DP50 kamera.
Custom RT
2 Profiler ™ PCR rekke
Uttrykket av 87 gener primært knyttet til EMT, stemness, og apoptose ble analysert ved hjelp av en egendefinert -laget PCR rekke plate fra SABiosciences (Frederick, MD, USA). PCR reaksjonen ble utført i henhold til produsentens protokoll.
Total RNA ble ekstrahert med RNeasy Mini Kit (Qiagen, Solna, Sverige) og cDNA ble kjøpt ved hjelp av RT
2 First Strand Kit (SABiosciences) . DNA og RNA kontaminering ble vurdert ved anvendelse av en genomisk DNA-kontroll og en positiv PCR-kontroll, respektivt. Gjennomsnittet av fem husholdningsgener (beta-2-mikroglobulin [B2M], hypoxantin phosphribosyltransferase 1 [HPRT1], ribosomalt protein L13a [RPL13A], glyceraldehyd-3-fosfat-dehydrogenase [GAPDH], og beta-aktin [ACTB]) ble benyttet å normalisere Ct-verdier. Data ble beregnet ved hjelp av komparative Ct metode for å presentere dataene som en fold forskjell i uttrykksnivået i forhold til en kontrollprøve [26].
kvantitativ real-time PCR (qPCR)
Total RNA ble ekstrahert med RNeasy Mini Kit (Qiagen, Solna, Sverige) eller høy Pure RNA Isolation Kit (Roche, Mannheim, Tyskland), og cDNA ble oppnådd ved bruk av høykapasitets RNA-til-cDNA Kit (Applied Biosystems, Stockholm, Sverige). MRNA uttrykk for CDH1, CDH2, Nanog, SOX1, TWIST1, FOXC2, FN1 og MMP7 ble analysert ved hjelp av en 7 500 Fast Real-Time PCR system og FAM /MGB prober (Applied Biosystems). Alle reaksjoner ble utført i henhold til produsentens instruksjoner. GAPDH ble amplifisert som en indre standard, og dataene ble beregnet ved hjelp av den sammenlignende Ct-metoden.
Western blot-analyse
Alikvoter på 50 pg protein, ble underkastet Western blot-analyse som beskrevet andre steder [27] . Antistoffene som ble brukt var: mus anti-Nanog (1:100, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), mus anti-SOX1 (1:10000, R D Systems, Minneapolis, Minnesota, USA), mus anti- vimentin (1:200, Santa Cruz), kanin anti-N-cadherin (1:1000; Abcam), kanin anti-fibronectin1 (1:200, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), mus anti-CD44 ( 1:1000, Cell Signaling, Danvers, MA, USA) og kanin-anti-EGFR (1:1000, Santa Cruz) etterfulgt av et HRP (pepperrotperoksidase) konjugert geite-anti-kanin-antistoff (1:1500, Santa Cruz) eller et HRP-konjugert geit anti-mus antistoff (1:1500, Santa Cruz). Lik lasting ble verifisert av reprobing membraner med en HRP-konjugert anti-aktin antistoff (1:2000, Santa Cruz).
Statistisk analyse
Data ble statistisk evaluert med enveis ANOVA fulgt ved Bonferroni multiple sammenligningstest. Signifikansnivået ble satt til p≤0.05.
Resultater
Identifikasjon av subpopulasjoner av celler i HNSCC cellelinjer
For å identifisere subpopulasjoner med ulike fenotyper, overflaten ekspresjon av CD44 ble undersøkt i tre HNSCC cellelinjer (LK0923, LK0827 og LK0863) ved flowcytometri. I de LK0923 og LK0827 cellelinjer, to distinkte undergrupper av celler, med enten høy eller lav CD44 celleoverflate-ekspresjon, ble identifisert; kan imidlertid ingen slike populasjoner observeres i LK0863 cellelinje (figur 1A). Den CD44
lav gruppen var mer rikelig i forhold til CD44
høy undergruppe (72,3% ± 9,1 vs 23,6% ± 9,2 i LK0923, 68,9% ± 9,6 vs 27,6 ± 9,3 i LK0827).
Dot tomt analyse av LK0923, LK0827 og LK0863 celler ko-farget med en APC-konjugert anti-CD44-antistoff og et PE-konjugert anti-epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) antistoff. De røde fargede områder representerer de CD44
høy-celler, og de tre boksene vise gating av de forskjellige underpopulasjoner fra hvilke celler ble isolert for ytterligere eksperimenter. B: Lys mikroskop bilder av CD44
lav, CD44
høy /EGFR
høy og CD44
høy /EGFR
lave populasjoner (3 dager etter sortering) og usortert LK0923, LK0827 og LK0863 celle kulturer.
i mangel av EGFR-celleoverflate-ekspresjon har vært assosiert med stemness [19], ble cellene ko-farget med anti-CD44 og anti-EGFR-antistoffer, hvoretter CD44
og høy CD44
lave populasjoner ble analysert med hensyn til deres EGFR uttrykk. Interessant, en del av LK0923 og LK0827 CD44
høy befolknings viste en lavere EGFR uttrykk i forhold til celler i CD44
lav befolkning (figur 1A). Dermed blir CD44
høy undergruppe ble videre delt inn i to grupper basert på deres EGFR-ekspresjon, noe som resulterer i tre subpopulasjoner; CD44
lav, CD44
høy /EGFR
høy og CD44
høy /EGFR
lav. Disse subpopulasjoner, definert av portstyrings i figur 1A, ble oppsamlet ved hjelp av FACS for videre analyse. Andelen av hver sortert populasjon i hver cellelinje er beskrevet i Tabell S1. I de LK0923 og LK0827 cellelinjer, de tre populasjonene skilte seg fra hverandre med hensyn til cellemorfologi (figur 1B). Mens cellene i CD44
høy /EGFR
lav befolkning viste en spindel-formet EMT-lignende morfologi, ble CD44
lav befolkningen dominert av brosteinsformede celler. Følgelig inneholdt CD44
høy /EGFR
høy befolknings både cobblestone- og spindel-formet celler. I LK0863 cellelinje, der ingen distinkte populasjoner ble observert basert på CD44 overflate uttrykk, celler av CD44
lav, CD44
høy /EGFR
høy og CD44
høy /EGFR
lave bestander ikke skiller seg fra hverandre morfologisk (figur 1B).
Karakterisering av CD44
lav, CD44
høy /EGFR
høy og CD44
høy /EGFR
lave subpopulasjoner
For ytterligere å karakter sorterte populasjoner LK0923 cellelinjen, som vises mest tydelig CD44
høy befolkning, ble brukt. Den totale EGFR og CD44 ekspresjon av de tre undergrupper ble analysert ved hjelp av western blot. CD44
høy /EGFR
lave cellene hadde en svært lav uttrykk for total EGFR i forhold til de to andre undergruppene og i CD44
lav befolkning ingen CD44 uttrykk er registrert (Figur 2A).
A: Ekspresjon av CD44 og epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) i sorterte subpopulasjoner (β-aktin ble benyttet som en lasting kontroll). B: Spredning rate av subpopulasjoner. Data representerer gjennomsnitt ± SD fra tre eksperimenter i tre eksemplarer, * p≤0.05. C: Cellesyklus fordeling sammenligning mellom CD44
lav og CD44
høye /EGFR
lave celler. Data fra en representant eksperiment av to vises. D: Plating effektivitet, som vurdert av kolonidannelse i sorterte subpopulasjoner. Data representerer gjennomsnitt ± SD fra tre eksperimenter i to eksemplarer, * p≤0.05.
For å studere epithelial fenotype av de sorterte populasjonene en immunfluorescens farging av pan-cytokeratin ble utført. Denne analysen viste en sterkere farging i de CD44
lave celler sammenlignet med de to CD44
høye populasjoner seks dager etter isolasjon, men etter ytterligere 30 dager i kultur forskjellen ikke var så fremtredende, noe som indikerer at de to mest EMT-lignende populasjoner skiftet inn i celler med en fenotype mer epitelial med tiden (fig S1).
Videre er sortert populasjoner ble dyrket i 30 dager og deretter analysert med hensyn til heterogeniteten av kulturen. Kulturer som stammer fra CD44
høy /EGFR
høy befolknings besto av 51% CD44
lav og 42% CD44
høye celler mens CD44
høy /EGFR
lav befolkning besto av 10% CD44
lav og 82% CD44
høye celler. I kontrast, inneholdt CD44
lav befolkning bare CD44
lave celler 30 dager etter sortering. Til sammen både CD44
høy /EGFR
høy og CD44
høy /EGFR
lave bestander hatt kapasitet til å rekapitulere heterogenitet av kulturen, men i varierende grad.
Deretter formeringshastigheten og cellesyklusfordelingen av de tre subpopulasjoner ble undersøkt. Celler av CD44
høy populasjon ble funnet å ha en lavere formeringshastigheten sammenlignet med CD44
lave celler (figur 2B). Videre var det et høyere antall celler i G0 /G1 fasen i CD44
høy /EGFR
lav befolkning i forhold til CD44
lav befolkning (60% og 40%, henholdsvis figur 2C ).
å evaluere pletteringseffektiviteten av de tre undersøkte subpopulasjoner av cellene ble sådd ut ved lav tetthet, og etter 10 dager antall kolonier dannet ble bestemt. Den CD44
lav befolkning viste en signifikant lavere plating effektivitet sammenlignet med de to andre subpopulasjoner (figur 2D).
Tatt sammen, CD44
høy /EGFR
lav befolkning består av mer celler i G0 /G1, noe som resulterer i en lavere spredning rente, men har en høyere plating effektivitet og sannsynligvis en høyere klonogene potensial.
Den CD44
høy /EGFR
lav befolkning viser oppregulering av EMT- tilknyttede gener
for å screene for forskjeller mellom sorterte subpopulasjoner innenfor LK0923 cellelinje uttrykk for et utvalg av gener involvert i stemness ble EMT og apoptose undersøkt ved hjelp av en real-time PCR array. For å analysere forskjeller mellom undergruppene en hierarkisk klyngeanalyse ble utført (TIGR Multiexperiment seer 4) som viste forskjeller i 28 gener (Figur S2). Den største forskjellen i genekspresjon ble funnet mellom CD44
høy /EGFR
lav og CD44
lave subpopulasjoner, mens CD44
høy /EGFR
høye celler, i samsvar med den morfologiske analyse viste likheter med begge de andre to undergrupper. Når man sammenligner CD44
høy /EGFR
lav befolkning til CD44
lav befolkning, kan forskjeller i mRNA nivå observeres i 27 gener, hvorav 20 ble oppregulert og 7 nedregulert (tabell 1). Av disse 27 differensielt uttrykte gener 14 kan være relatert til en EMT fenotype (VIM, MMP2, MMP7, TIMP1, TWIST1, COL3A1, CDH1, CDH2, ITGA5, FN1, FOXC2, WNT5A, WNT5B og SPARC). Interessant, CD44
høy /EGFR
lave celler viste også en oppregulering av to stamcelle gener, Nanog og SOX1.
The real-time PCR array-data ble bekreftet ved å analysere mRNA uttrykk for CDH1 (E-cadherin), CDH2 (N-cadherin), VIM (vimentin), FN1 (fibronektin 1), TWIST1, FOXC2 og MMP7 ved qPCR (figur 3A). MRNA uttrykk nivået av de ovennevnte faktorene ble også bestemt i LK0827 og LK0863 populasjoner. I likhet med det som ble funnet i LK0923, den CD44
høy /EGFR
høy og CD44
høy /EGFR
lave bestander av LK0827 cellelinjen viste et tydelig EMT fenotype (figur 3B). På den annen side, i den LK0863 cellelinjen ble det ikke observert noen forskjeller i mRNA-ekspresjon mellom sortert populasjoner (figur 3C). Dessuten ble den forskjell i ekspresjonen av N-cadherin, vimentin og fibronektin en verifisert på proteinnivået i LK0923 ved western blot analyse (figur 3D)
A-C.: Relative mRNA-ekspresjonsnivåene av epitelial-mesenkymale overgangsassosierte gener; E-cadherin, N-cadherin, vimentin, fibronectin1, Twist1, FOXC2 og matriksmetalloproteinase 7 (MMP7) i (A) LK0923, (B) LK0827 og (C) LK0863 subpopulasjoner. Uttrykket nivåer i CD44
høy /EGFR
høy og CD44
høy /EGFR
lave bestander vises her som ganger forskjell i forhold til CD44
lav befolkning (GAPDH ble brukt som en intern standard). D: Western blot analyse av N-cadherin, vimentin og fibronectin1 i LK0923 populasjoner (β-actin ble brukt som lasting kontroll)
oppregulering av CSC markører Nanog (LK0923) og SOX1 (LK0923. og LK0827) i CD44
høy /EGFR
lave celler ble bekreftet på mRNA-nivå (figur 4), men kunne ikke bekreftes på proteinnivå (data ikke vist).
Relativ mRNA uttrykk nivåer av stemness gener Nanog og SOX1 i LK0923, LK0827 og LK0863 subpopulasjoner, her vist som ganger forskjell i forhold til CD44
lav befolkning (GAPDH ble brukt som intern standard).
sortert subpopulasjoner viser forskjeller i behandling følsomhet
for å vurdere om forskjellsbehandling følsomhet eksisterer mellom de tre subpopulasjoner, ble sortert celler eksponert for ioniserende γ-stråling (4 Gy), cisplatin (2 mikrogram /ml, 1 t) , cetuximab (30 nM), gefitinib (50 nM) eller dasatinib (10 nM).
LK0923 CD44
høy /EGFR
lave cellene viste seg å være svært motstandsdyktig mot cisplatin behandling i forhold til både CD44
lav og CD44
høy /EGFR
høye celler (figur 5A). Den CD44
høy /EGFR
lav bestand av LK0827 og LK0923 celler viste en signifikant høyere motstand mot strålebehandling i forhold til de to andre subpopulasjoner mens i LK0863 ingen forskjeller ble funnet (figur 5A, 5B og 5C). Videre, når cetuximab ble lagt til CD44
høye /EGFR
lave celler fra LK0827 og LK0923 de viste seg å være resistente. I LK0923 ble det ikke observert forskjeller mellom subpopulasjoner etter eksponering for gefitinib, men i LK0827 den CD44
lave celler var betydelig mer følsomme for gefitinib forhold til CD44
høye /EGFR
lave celler.
behandling følsomheten CD44
lav, CD44
høy /EGFR
høy og CD44
høy /EGFR
lave celler, isolert fra (A) LK0923, (B) LK0827 eller (C) LK0863 og eksponering av ioniserende stråling (4 Gy), cisplatin (2 ug /ml, 1 H), cetuximab (30 nM), gefitinib (50 nM) eller dasatinib (10 nM). Data representerer gjennomsnitt ± SD fra tre eksperimenter i tre eksemplarer, * p≤0.05.
Til sammen generelt LK0827 og LK0923 CD44
høy /EGFR
lave celler viste lav sensitivitet for stråling, cisplatin, cetuximab og gefitinib relativt til deres CD44
høy /EGFR
høy og CD44
lave kolleger (figur 5A og 5B). På den annen side, de ble funnet å være mer følsomme for behandling med multi-BCR /ABL og Src familien tyrosinkinasehemmer dasatinib.
Diskusjoner
I denne studien undersøkte vi muligheten ved bruk av overflate ekspresjon av EGFR og CD44 å finne populasjoner av celler i løpet av HNSCC cellelinjer som skiller seg fra hverandre med hensyn til fenotype og behandling følsomhet. Tre populasjoner, som består av CD44
lav, CD44
høy /EGFR
høye og CD44
høy /EGFR
lave celler, henholdsvis, ble analysert etter celle sortering av FACS. Den CD44
høy /EGFR
lav befolkning havner et større antall celler i G0 /G1, viser en lavere spredning frekvens og høyere plating effektivitet i forhold til CD44
høy /EGFR
høy og CD44
lave bestander. I tråd med disse resultatene, Le Roy et al viste en sammenheng mellom normal og kreft keratinocyte skjebne og asymmetrisk fordeling av EGFR under mitose. Videre identifiserte de tre populasjoner i normale og kreft keratinocytt kulturer: en liten, men konstant pool av Rh123
– (Rhodamine 123, en markør for side befolkningen) og EGFR
– hvilende celler, en liten, men variable i størrelse mellom normale og kreftcellekulturer pool av Rh123
– /EGFR
+ (kanskje aktiverte stamceller), og en tredje stor pool av Rh123
+ /EGFR
+ forbigående forsterker celler. Den Rh123
– /EGFR
-. Kultur bestod av flere celler i G0 /G1 og celler med høyere klonogene evne [19]
I to av tre undersøkte cellelinjer, CD44
høy /EGFR
lave celler vises en tydelig EMT-lignende fenotype med spindel-formet morfologi, samt oppregulering av EMT markører. Imidlertid kan ingen tydelig CSC fenotype bli observert i disse cellene. Disse resultatene tyder på at overflaten ekspresjon av CD44 (høy) og EGFR (lav) identifisere en populasjon av celler som med en EMT fenotype. Denne populasjonen er beriket med cscs; imidlertid flere markører som kreves for spesifikke utvalg av cscs.
Nylig, Biddle
et al
gitt bevis for at innen HNSCC svulster to forskjellige CSC fenotyper finnes, en CD44
høy /epitel spesifikk antigen (ESA)
høy og en CD44
høy /ESA
lav [28]. Den CD44
høy /ESA
lav befolkning viser en EMT-fenotype og ser ut til å ha egenskaper som ligner på CD44
høy /EGFR
lav befolkning er beskrevet i denne studien. Begge CSC populasjoner beskrevet av Biddle
et al
kunne bytte sine epitel eller mesenchymale egenskaper for å rekonstituere den cellulære heterogenitet men CD44
høy /ESA
lav befolkning til mindre utstrekning (inneholder 50% av bipotent celler sammenlignet med 100% bipotent celler i CD44
høy /ESA
høy befolknings). I tråd med sine resultater, 30 dager etter sortering CD44
høy /EGFR
høye cellene vise en større kapasitet til å rekonstituere den cellulære heterogenitet i forhold til CD44
høy /EGFR
lave celler.
forbindelsen mellom cscs og EMT har blitt mer tydelig i løpet av de siste par årene. I 2008, Mani et al beskrev at induksjon av EMT i mammary epitelceller resulterte i cellene stadig mer stamcelleegenskaper [29], et fenomen også sett på kreft i bukspyttkjertelen celler [30]. I HNSCC har det vist seg at celler oppnådd fra sfæroide kulturer, noe som demonstrerte stamcelleegenskaper, hadde også en EMT fenotype med forhøyet vimentin og a-glattmuskel aktin nivåer [31].
Viktigheten av EMT i behandlingen motstand har nylig blitt målrettet for etterforskning i ulike typer kreft [32]. I både kreft i bukspyttkjertelen og HNSCC har det vist seg at celler med en EMT fenotype er mer resistente overfor cisplatin behandling [7], [33], og det samme mønster ble observert når man studerer respons på strålingen [34], [35] og cetuximab [35]. De subpopulasjoner innenfor LK0923 og LK0827 cellelinjer skilte med hensyn til behandlingsrespons. De CD44
høy /EGFR
lave celler viste en betydelig lavere følsomhet for cisplatin (LK0923) og strålebehandling (LK0923 og LK0827) sammenlignet med den CD44
lav og CD44
høy /EGFR
høye celler. I et av de foregående studier, hvor radioresistant og radiosensitive HNSCC-cellelinjer ble sammenlignet med mikromatriseanalyse, er mange av de identifiserte viktige regulatoriske gener assosiert med EMT [36]. En av disse viktige regulatorer, FN1, var signifikant oppregulert i radioresistant tumorceller både på mRNA og protein nivå. I en tilsvarende studie som sammenligner cisplatin motstandsdyktig og cisplatin følsom HNSCC cellelinjer, ble MMP7 vist å være en biomarkør for cisplatin motstand [37]. I tråd med disse data, viste behandling motstandsdyktig CD44
høy /EGFR
lav befolkning innenfor LK0923 og LK0827 cellelinjer økte nivåer av både FN1 og MMP-7. En sammenheng mellom EMT og oppregulering av MMP-7 uttrykket har tidligere blitt beskrevet.
