Abstract
Bakgrunn
kreft i bukspyttkjertelen celler generere metastaser fordi de kan overleve stress pålagt av det nye miljøet av verten vev. For å etterligne denne prosessen, er kreft i bukspyttkjertelen celler som ikke er understreket i standard kulturbetingelser injisert inn i nakne mus. Fordi de utvikler xenografter, bør de ha utviklet tilstrekkelig stressrespons. Karakteriserer dette svaret kan gi nye strategier for å forstyrre bukspyttkjertelkreft metastaser.
metodikk /hovedfunnene
I de menneskelige kreft i bukspyttkjertelen cellelinjer Panc-1, Mia-PaCa2, CAPAN-en, CAPAN -2 og BxPC3, brukte vi Affymetrix DNA-mikromatriser å sammenligne uttrykk for 22.000 gener in vitro og i tilsvarende xenografter. Vi identifiserte gener 228 overuttrykt i xenografter og karakterisert innblanding av en av dem, WSB1, ved regulering av apoptose og celleproliferasjon. WSB1 genererer 3 alternativt skjøtes transkripsjoner koder forskjellige protein isoformer. I transplantater og i humane pankreatiske tumorer, er global ekspresjon av mRNA WSB1 beskjedent øket, mens isoform 3 er sterkt overuttrykt og isoformene 1 og 2 er nedregulert. Behandling Mia-PaCa2 celler med stress-induserende midler induserte lignende endringer. Mens retrovirus-tvunget ekspresjon av WSB1 isoformer 1 og 2 fremmet cellevekst og sensibiliserte celler til gemcitabine- og doksorubicin-indusert apoptose, WSB1 isoform 3 ekspresjon redusert celleproliferasjon og forbedret resistens mot apoptose, som viser at stress-induserte modulering av WSB1 alternativ spleising øker motstanden mot apoptose av kreft i bukspyttkjertelen celler.
Konklusjon /betydning
data~~POS=TRUNC på WSB1 regulering støtter hypotesen om at aktivering av stressresponsmekanismer bidrar til kreftceller etablere metastaser og foreslå relevans til kreftutvikling av andre gener overexpressed i xenografter
Citation. Archange C, Nowak J, Garcia S, Moutardier V, Calvo EL, DAGORN JC, et al. (2008) WSB1 Gene er involvert i kreft i bukspyttkjertelen Progresjon. PLoS ONE 3 (6): e2475. doi: 10,1371 /journal.pone.0002475
Redaktør: Juan Valcarcel, Centre de Regulació Genòmica, Spania
mottatt: 04.03.2008; Godkjent: 18 mai 2008; Publisert: 25 juni 2008
Copyright: © 2008 Archange et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. INSERM, La Ligue, Canceropole PACA, INCA
konkurrerende interesser: forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
kreft i bukspyttkjertelen er en svært dødelig sykdom med en dårlig lenge. -term overlevelse for pasienter med lokalavansert eller metastatisk stadier [1] – [3]. De viktigste grunnene for dette dårlige resultat er vår manglende evne til å diagnostisere kreft i bukspyttkjertelen på et tidlig stadium på grunn av mangelen på spesifikke symptomer, plassering av bukspyttkjertelen dypt inn i bukhulen og tidlige opptreden av metastaser. Derfor, i de fleste pasienter, ved tidspunktet for diagnose, har regional lymfeknute og levermetastaser av kreft i bukspyttkjertelen inntraff, noe som begrenser effektiviteten av den eneste kjente kurative alternativer og de må inneholde kirurgisk reseksjon [4] – [6]. Hittil har strålebehandling eller cellegift ikke resultert i betydelige forbedringer i langtidsoverlevelse [7]. Årsakene til kreft i bukspyttkjertelen er ennå ikke nøyaktig forstått. Mange genprodukter vise deregulerte funksjoner. Tallrike vekstfaktorer og deres reseptorer er overuttrykt i løpet av progresjon av kreft i bukspyttkjertelen [7] -. [9], men disse funnene har neppe medført noen forbedring i bukspyttkjertelkreft terapi
Vår strategi for å identifisere nye potensielle mål for pankreatisk kreftterapi er basert på ideen om at tumorprogresjon er alltid ledsaget av endringer i mikromiljøet, og at dens suksess er avhengig av evnen av kreftceller til å tilpasse seg denne nye mikromiljøet. Faktisk er det kjent at kreft progresjon involverer flere suksessive trinn. Innenfor den primære tumor, blir cellene først selektert på grunnlag av rask vekst, lav respons til apoptotiske signaler og en kapasitet til å unnslippe vertens immunsystem. Disse cellene forlater primærtumor og vandrer gjennom organismen. Men ikke alle av dem vil generere metastaser i alle vev. Denne prosessen er selektiv og avhenger både av kapasiteten av tumorceller ved å etablere interaksjoner med vertsvevet og på deres evne til å håndtere de miljømessige faktorer til hvilke de er eksponert i den nye plassering. Fenotypen til tumorcellen er innrettet til sitt opprinnelige miljø, miljø av organ der primærtumor utviklet. Siden miljøet levert av målorganet er forskjellig fra den opprinnelige, vil det sette den invaderende tumorcelle etter microenvironmental stresset press. Som en konsekvens, kan evnen til tumorcellen for å motstå den spenning være bestemmende faktor for suksess for metastaseutvikling. Cellen vil aktivere sin forsvarsprogram for å overleve, og hvis vellykket, sprer. Vårt mål var å identifisere gener som er involvert i dette programmet fordi hemming av deres uttrykk kan være en ny måte å målrette kreft i bukspyttkjertelen. I denne artikkelen beskriver vi et panel av potensielle kreft i bukspyttkjertelen gener valgt å bruke en xenograft strategi og analysere struktur og funksjon av en av dem, den WSB1 genet, i forhold til bukspyttkjerteltumorprogresjon.
Resultater
panelet av bukspyttkjertelkreft stressgener
modellen vi valgte å etablere panel av potensielle pankreas progresjonsrelaterte gener er følgende: Vi brukte 5 humane bukspyttkjertelen kreft cellelinjer med ulike genetiske bakgrunn, Panc-1 , Mia-PaCa2, CAPAN-en, CAPAN-2 og BxPC3. Vi har gjort en hypotese om at, i standard kultur forhold, er disse cellene ikke stresset av deres mikromiljø. Ved injeksjon i nakne mus, vil de bli utsatt for stress av et annet miljø xenograft ligne metastasering. Selv om xenograft modell reflekterer bare delvis hva som egentlig skjer med spredning, er det en god måte å sette cellene i et miljø helt forskjellig fra deres vante miljø. Som en konsekvens en viktig spenning vil bli generert, til hvilken cellene blir nødt til å motstå. I hver cellelinje, sammenlignet vi uttrykk 22.000 gener in vitro og i xenografter, ved hjelp av Affymetrix mikromatrisemetoden. For å sikre at utvalgte gener er representative for en stor andel av humane pankreatiske tumorer, ble bare gener hvis ekspresjon endres i det minste todelt i alle 5 tumorer ble vurdert. Under disse betingelser kunne vi velger 228 gener overuttrykt i tumorer og 13 som ble nedregulert. Den fullstendige data er tilgjengelig online på https://www.inserm-u624.univ-mrs.fr/affymetrix/. Flere av de mest overuttrykt genene er dårlig beskrevet om ikke helt uutforsket. Som et første skritt, valgte vi å fokusere på WSB1 (WD-repeat og SOCS Box inneholder-1) fordi, som beskrevet i det følgende, det viste den opprinnelige funksjon av å generere, ved alternativ spleising, 3 variant transkripsjoner koder distinkte protein isoformer, som har regulering i xenografter og ved eksponering for flere påkjenninger ikke er samordnet.
WSB1 uttrykk i bukspyttkjertelen tumorxenotransplantater
komplett protein som genereres av transkripsjon variant 1, isoform 1, består av 3 domener (en N -terminale domene, et protein-protein interaksjon domene som omfatter 8 WD-gjentakelser, og en SOCS boks) (figur 1). Isoform 2 mangler nesten hele N-terminal domene og den første WD-repeat. Til slutt, et for tidlig stoppkodon i isoform 3 genererer et avkortet protein som mangler den C-terminale del av proteinet, tilsvarende 6 WD-gjentakelser og SOCS boksen.
A. Skjematisk fremstilling av WSB1 isoformer 1, ble 2 og 3. B. WSB1 isoformer uttrykt som EGFP eller V5 tag fusjonsproteiner og subcellulære lokalisering ble analysert ved direkte fluorescens av etter immunocytochemistry hjelp EGFP eller V5 antistoffer hhv.
Hvis global ekspresjon av genet, detektert av 213406_at Affymetrix probe svarende til transkripsjon av alle tre isoformer, er bare økes 1,17 til 2,38 ganger hos mus xenografter, avhengig av cellelinjen, ekspresjonen av isoformen 3, detektert av 201295_s_at Affymetrix sonde, økes 4,63 til 20,32 ganger (tabell 1). Disse resultatene ble kontrollert ved kvantitativ RT-PCR-analyse. Vi utviklet
Homo sapiens
-spesifikke primere for å analysere uavhengig uttrykk for WSB1 isoform 3, isoformene 1 + 2 og isoformer 1 + 2 + 3 (global uttrykk) (figur S1). Vi fant at den globale ekspresjon av WSB1 ble øket med 1,75 til 3,93 ganger i tumorer (data ikke vist). Interessant, ekspresjon av isoformen 3 ble økt med 3,7 til 9 ganger mens det av isoformer 2 + 3 ble redusert med 5 til 20% (figur 2), i overensstemmelse med DNA-chip-data. Derfor, i stedet for en økning i den globale WSB1 ekspresjon i xenoimplantater tumorer, sammenlignet med celler opprettholdt in vitro, ble det observert en betydelig endring i alternativ spleising i favør av isoform 3 som blir stort sett dominerende i tumorer.
Ekspresjon av WSB1 isoformene 1 + 2 og 3 mRNA ble bestemt ved QRT-PCR i bukspyttkjertelcancercellelinjer og i mus xenopodet tumorer (A), i humane kreft i bukspyttkjertelen prøver (B), og i Mia-PaCa2 celler etter behandling med stress-induserende midler ( C). Verdier er uttrykt som gjennomsnitt ± S.D. av kombinerte resultater fra to uavhengige eksperimenter utført i tre eksemplarer. (*, P 0,05).
For å sjekke den kliniske relevansen av disse funnene, målte vi uttrykk for WSB1 isoformer av kvantitativ RT-PCR i 8 menneskelige bukspyttkjertelen adenokarsinom prøver. Vi har observert i disse tumorene en meget sterk overvekt av isoform 3 ekspresjon med et lavt nivå av isoformer 1 + 2 (figur 2). Dette tyder på at uttrykket profilen til WSB1 observert hos mus xenografter er representativt for hva som skjer i menneskelig kreft i bukspyttkjertelen.
Cellular stresset modulerer WSB1 alternativ spleising i favør av isoform 3
Vår hypotese er at noen av genene over-uttrykt i tumorer er aktivert som reaksjon på stress forårsaket av det nye vev mikromiljøet. I vår eksperimentell modell, miljø av kreft i bukspyttkjertelen celler er faktisk ganske annerledes når de er dyrket
in vitro
eller vokser i
naken
mus, i form av næringsstoffer, vekst matrise, hormoner, etc. Likevel, noen av disse endringene kan være viktig nok til å påvirke genekspresjon, men ikke til poenget med å indusere stress. For å sjekke om de observerte endringene i WSB1 genuttrykk er faktisk en konsekvens av stress, overvåket vi expressoin av WSB1 mRNA isoformer i Mia-Paca2 celler, som svar på stress generert av ulike behandlinger. Disse behandlingene påvirker ulike veier bør også gi informasjon om funksjonen til WSB1. De inkluderte induksjon av apoptose med staurosporin, eller adriamycin og gemcitabin som blokkerer DNA syntese, DNA-skade ved γ-bestråling, metabolsk stress ved serum sult og hypoksi eller anoksi. Som vist i figur 2, er alle behandlinger resulterte i en meget beskjeden endring i ekspresjonen av WSB1 isoformer 1 + 2, og i en sterk økning i isoformen tre uttrykk. Derfor synes WSB1 isoform tre uttrykk for å bli styrket som følge av stress, uansett stress pathway involvert. Selv om vi ikke kan utelukke at dette er delvis påvirket av tilstedeværelsen av stroma i tumorer, tyder disse resultatene på at endringene i alternativ spleising observert for WSB1 i vårt xenograft modell blir faktisk modulert ved celle stress. Lignende resultater ble oppnådd med Panc1 celler (data ikke vist).
subcellulære lokalisering av WSB1 isoformer 1, 2 og 3
For å analysere subcellulære lokalisering av WSB1 isoformer 1, 2 og 3 vi subklonet 3 cDNA inn i pEGFP-N1 vektor for å få WSB1 isoformer som EGFP-WSB1 fusjonsproteiner. Disse plasmidene ble transfektert inn i HeLa-celler, og etter 24 timer, isoformer 1, 2 og 3 viste seg som cytoplasmatiske prikker. Ingen forskjeller i dot størrelse og antall ble funnet mellom de tre isoformer. EGFP-WSB1 fusjonsproteiner kan erverve unormale romlige conformations hindre dem å nå normal plasseringen av protein og muligens indusere aggregatdannelse som kan redegjøre for våre observasjoner. Som en kontroll ble subklonet vi WSB1 isoformene til pcDNA4 for å fremstille tre WSB1-V5 merkede proteiner. Plasmider ble transfektert inn i HeLa-celler og anti-V5-antistoffer brukes til å gjenkjenne 24 timer senere isoformene av immunocytokjemi. Interessant, den subcellulære fordeling av V5-merket isoformer var svært lik den som ble observert for EGFP-WSB1 isoformer (figur 1).
WSB1 forbedrer celleproliferasjon
Lite er kjent om WSB1 funksjon. WSB1, også kjent som SWIP1, ble først identifisert ved Vasiliauskas et al. [10] ved å søke humane sekvenser tilsvarende til den av kylling-genet swip1. WSB1 aksjer 88% aminosyre identitet med kylling swip1. Forfatterne viste at swip1 ble regulert av Sonic pinnsvin i somites og lem knopper i utviklings kylling. I den senere tid Dentice et al. [11] presenteres bevis for at WSB1 er en del av en E3 ubiquitin ligase for thyroid hormon-aktivering iodothyronine deiodinase-2. Det er viktig å merke seg at alle tidligere forsøk har blitt utført på kylling hvor bare to isoformer, tilsvarende humane isoformer 1 og 2 har blitt identifisert. Derfor er funksjonen av dette genet i human kreft, spesielt av dets isoform 3, er fullstendig ukjent. Vi først undersøkt hvilken rolle WSB1 på celleproliferasjon. For å oppnå dette, hemmet vi WSB1 uttrykk ved trans Mia-Paca2 med en siRNA som er rettet mot de 3 isoformer. Som vist i figur 3, 48 timer etter transfeksjon, dette siRNA effektivt redusert WSB1 global ekspresjon ved 85% (80% for isoformer 1 + 2 og 89% for isoform 3). Cellevekst ble målt hver 24. time, med start 48 timer etter transfeksjon siRNA, ved direkte celle-telling, og ved MTT-analyse. I begge tilfeller er resultatene indikerer at celler transfektert med WSB1 siRNA vokste saktere enn celler transfektert med kontroll siRNA (figur 3). Lignende resultater ble oppnådd med Panc1-celler (data ikke vist). BrdU-inkorporering eksperimenter bekreftet disse resultatene. Imidlertid kan denne forskjellen være på grunn av en økning i celledød i stedet for til en redusert spredning av WSB1 siRNA-transfekterte celler. For å teste denne hypotesen, vurdert vi apoptose ved å måle caspase-3-aktivitet i celler transfektert med disse siRNA. Caspase-3 aktivitet var den samme i celler transfektert med WSB1 siRNA eller med kontroll siRNA. Dessuten, når apoptose ble indusert ved behandling med staurosporin eller doksorubicin, celler transfektert med WSB1 siRNA viste en lavere caspase-3 aktivitet enn kontrollceller (figur 3). Samlet utgjør disse resultatene sterkeste at WSB1 uttrykk forbedrer cellevekst ved å øke cellevekst snarere enn ved å redusere celledød.
A. Mia-PaCa2 celler ble transfektert med siRNA rettet mot WSB1 mRNA og uttrykk for WSB1 isoformer 1 + 2 + 3, 1 + 2 og 3 mRNA ble analysert ved QRT-PCR. B. Mia-PaCa2-celler ble transfektert med WSB1 siRNA og vekst ble analysert ved direkte celle-telling (B), MTT analyse (C) eller ved BrdU-inkorporering (D) som beskrevet i Materialer og Metoder seksjon. E. Mia-PaCa2-celler ble transfektert med WSB1 siRNA og kaspase 3 aktivitet ble målt i ubehandlet og etter behandling med staurosporin eller doksorubicin. Verdier er uttrykt som gjennomsnitt ± S.D. av kombinerte resultater fra to uavhengige eksperimenter utført i tre eksemplarer. (*, P 0,05).
En spesiell rolle for isoform 3
Uttrykk for WSB1 isoform 3 blir indusert i menneskelige kreft i bukspyttkjertelen celler både in vitro etter eksponering for et stress og in vivo når slike celler vokser som xenotransplantater i mus. Det er også i stor grad fremherskende i humane pankreatiske tumorer, noe som tyder på at de 3-isoformer har forskjellige funksjoner. For å karakterisere disse funksjonene vi generert stabile cellelinjer som uttrykker hver isoform av WSB1 separat som WSB1-EGFP fusjonsproteiner, ved transducing Mia-PaCa2 celler med retrovirus koding WSB1 isoformer 1, ble 2 eller 3. Uttrykk for fusjonsproteiner dokumentert av western blot (Figur S2). Vi målte cellevekst ved direkte telling av hver 24 timer i løpet av 4 dager, og fant at celler som uttrykker isoformen 1 eller 2 vokste hurtigere enn kontrollceller som uttrykker EGFP alene. Men til vår overraskelse, celler som uttrykker isoformen tre vokste saktere enn celler som uttrykker isoformer 1 eller 2, eller kontrollceller (figur 3). Som tidligere, vi utelukkes at dette skyldes økt celledød fordi caspase-3-aktivitet var den samme i de 3 cellelinjer (data ikke vist). I tillegg cellesyklus analyse bekreftet disse observasjonene. Faktisk fant vi S /G1 faseforhold høyere i celler som uttrykker isoformer 1 eller 2 enn i kontrollcellene, og langsommere i celler som uttrykker isoform 3 (figur 4). Derfor WSB1 isoformer 1 eller 2 og isoformen 3 har motsatt virkning på celleformering, isoformen 3 inhibere bukspyttkjertelcellevekst, mens isoformene 1 og 2 stimulerer deres proliferasjon.
A. Mia-PaCa2-celler ble transdusert med retrovirus som uttrykker WSB1 isoformer 1, 2 eller 3 som EGFP-fusjonsprotein eller EGFP alene som en kontroll og er valgt med puromycin. Cellevekst ble målt ved direkte telling etter plating 10
5 celler i 48-brønners retter hver dag i løpet av 4 dager. B. Når synkroniseringen med 24 timers serum sult, cellene ble inkubert i seruminneholdende medium i 24 timer, farget med propidiumjodid og cellesyklus ble analysert med et strømningscytometer. C. S /G1-forhold. Verdier er uttrykt som gjennomsnitt ± S.D. av kombinerte resultater fra to uavhengige eksperimenter utført i triplikat (A) eller trice i triplikat (B og C) (*, p 0,05).
WSB1 isoform 3 reduserer følsomheten for stress-indusert celledød
Siden uttrykk for isoform 3 er indusert av stress, undersøkte vi om det kunne påvirke mottakelighet av cellene til stress-indusert celledød. Vi har lagt Mia-Paca2 celler som uttrykker isoformer 1, 2 eller 3 for behandling med 100 eller 150 uM doksorubicin kjent for å indusere apoptose, og målte cellelevedyktigheten etter 6 timer. Vi har observert med begge medikamentkonsentrasjoner økte celledød i celler som uttrykker isoformer 1 eller 2, sammenlignet med kontrollceller. Tvert imot, celler som uttrykker isoformen 3 var signifikant mer motstandsdyktig enn kontrollene (figur 5). For å sjekke disse funnene, cellene ble behandlet i 48 timer med 150 og 350 mikrometer gemcitabin og celleviabilitet ble vurdert. En profil lik den for doxorubicin-behandlede celler ble oppnådd, celler som uttrykker isoformer 1 og 2 er mer følsom for medikamentet enn kontrollceller, i motsetning til celler som uttrykker isoform 3 (figur 5). Disse stoffene drepe skille men ikke stansede celler, men forskjellene etter 6 timers behandling er også viktig å være helt forklares ved det faktum at langsommere voksende celler dør mer langsomt. Disse resultater viser at over-ekspresjon av WSB1 isoform 3 og nedregulering av isoformer 1 og 2 som reaksjon på cellulært stress resulterer i øket motstand mot apoptose.
Mia-PaCa2-celler ble transdusert med retrovirus som uttrykker WSB1 isoformer 1 , 2 eller 3 som EGFP-fusjonsprotein eller EGFP som kontroll og er valgt med puromycin. Celler ble behandlet med gemcitabin (100 og 150 uM) i 48 timer eller med doksorubicin (150 og 350 uM) i 6 timer. Cellelevedyktigheten ble målt ved MTT. Verdier er uttrykt som gjennomsnitt ± S.D. av kombinerte resultater fra to uavhengige eksperimenter utført i tre eksemplarer. (*, P 0,05).
Diskusjoner
Hypotesen støtte dette arbeidet er at bukspyttkjertelen tumorprogresjon og metastasering oppstår bare når sirkulerende kreftceller kan lykkes motstå de påkjenninger som genereres av nye mikromiljøet levert av verten vev. Hvis rømte kreftcellene ikke ble sendt til stress i nye miljøer, vil metastase utvikle seg i alle vev. Faktisk er klinisk observasjon at primær kreft utvikler seg i et gitt organ alltid utvikle metastaser i den samme andre organer, sannsynligvis de der disse kreftceller er i stand til å motstå de stress forårsaket av miljøforholdene. Derfor kan terapeutiske strategier som forstyrrer mekanismer som beskytter kreftceller fra stress forsinke eller forhindre metastatisk prosess. Det første skrittet mot å etablere slike strategier er å identifisere gener som gir resistens mot den nye mikromiljøet i tumor utvikling. Dette kan oppnås ved å sammenligne med DNA rekke genuttrykk i celler som vokser i ulike microenvironmental forhold, og velg genene overuttrykt i forhold til tumorvekst. For å etterligne den spenning som oppstår under metastase dannelse i pasienter som har vi brukt et eksperimentelt oppsett basert på et xenotransplantat bukspyttkjerteltumormodell. Vi sammenlignet genuttrykk profiler på menneskebukspyttkjertelkreft cellelinjer voksende in vitro i oppdrett standard (mikro A) og i løpet av svulst utvikling etter injeksjon i nakne mus (mikromiljøet B). Faktisk er mange gener viste overekspresjon i den nye mikromiljøet, og hvis noen av dem kan være overuttrykt i respons på signalene som celle-til-celle eller celle-ekstracellulær matriks kontakt, mens andre kan være innblandet i resistens mot stress. Vi valgt som beste kandidatene genene sterkt overuttrykt i xenografter generert av alle 5 cellelinjer. Blant kandidat gener, valgte vi å karakterisere i detalj WSB1 fordi den presenterte ytterligere interesse for generering av alternativ spleising tre forskjellige isoformer som regel når det utsettes for stress er ikke koordinert. Selv om over-uttrykk for isoformer 1 + 2 + 3 er moderat, 1,75 til 3,93 ganger avhengig av celletype, er isoformen tre sterkt over-uttrykt (3,7 til 9 ganger). Tvert imot, blir ekspresjon av isoformer 1 + 2 ble redusert til 5 til 20% i xenotransplantater. Interessant, isoformen tre er også i stor grad dominerer i menneskelige pankreastumorer, som støtter vår hypotese.
Selv om U133A Genechip har blitt designet for å målrette menneskelige sekvenser, kan vi ikke utelukke en potensiell cross-hybridisering av noen sonder med muse sekvenser. Det er derfor designet
Homo sapiens
-spesifikke primere for qPCR. qPCR ble utført på mus embryonale fibroblaster cDNA under de samme betingelser som for human pankreas-cDNA, og det var ingen DNA-amplifisering etter 45 sykluser, selv om vi var i stand til å amplifisere hele isoformen 3 fra den samme mus embryonale fibroblaster cDNA med en PCR med primere målrettet helt seter som er felles for begge arter (Forward 5′-CCATGAGCCAGCTTTCCC-3 «, 5′-Omvendt TCACACCAATATTGCTGCCAC-3»). Derfor konkluderte vi med at våre qPCR primere er menneskelig spesifikke og at økt uttrykk for isoform tre forekommer i humane epitelceller og ikke i mus stroma.
For å bekrefte at WSB1 er faktisk en stress-indusert gen, vi legges bukspyttkjertelen celler til flere påkjenninger og observerte at uttrykket av WSB1 isoform 3 ble alltid sterkt aktivert mens uttrykk for isoformer 1 + 2 var uendret eller redusert. Det cellulært stress regulerer WSB1 uttrykk ved å modulere sin spleising er faktisk interessant, men ikke opprinnelige siden slik regulering var allerede beskrevet for andre gener. For eksempel, modulasjoner av alternativ spleising oppstå av Arabidopsis SR protein homologer, atSR30 og atSR45a, som svar på miljøstress [12]. Også, UV og γ-stråling samt cisplatinbehandling indusere alternativ spleising av hdm2 [13] og eksponering av primære lymfocytter til en spenning induserer utseendet TSG101 spleisevarianter [14]. Til slutt, i nerveceller, acetylkolinesterase turnus fra isoform AChE-S til normalt sjeldne isoform AChE-R som svar på flere påkjenninger [15]. Det viktige poenget er at stress-indusert modulering av alternativ spleising av uttrykket av WSB1 isoformer er svært likt det vi observerte under xenograft tumor progresjon.
Det er bemerkelsesverdig at menneskelig WSB1 isoform 3 sekvensen er permanent undertrykt fra databaser for å være en tull-mediert mRNA nedbrytning (NMD) kandidat. NMD er et mRNA overvåking bane som sikrer hurtig nedbrytning av mRNA som inneholder prematur translasjonsterminering kodoner, for derved å forhindre opphopning av avkortede og potensielt skadelige proteiner [16]. I denne studien viser vi en opphopning av isoform 3 mRNA etter stress induksjon, i xenograft og i menneskelige pankreastumorer i motsetning til hva som forventes i en NMD sammenheng. Derfor, selv om dens sekvens kan være relatert til NMD, er det åpenbart at WSB1 isoform 3 mRNA ikke blir raskt degradert, og ser ikke ut til å være et reelt mål for NMD. Vi har også utelukkes ved hjelp av RT-PCR-amplifikasjon og sekvensering av hele isoformen 3 mRNA det faktum at en pre-mRNA blir detektert i stedet for isoform 3 mRNA (data ikke vist).
De fysiologiske konsekvensene for kreft i bukspyttkjertelen celler av stress-induserte endringer i andelen WSB1 isoformer, i form av vekst og motstand mot apoptose, er viktig. Ekspresjon av WSB1 isoformer 1 eller 2 ble vist å akselerere cellesyklus, mens ekspresjon av isoform 3, tvert imot, det bremset ned. Når alle isoformene ble samtidig målrettet av en siRNA i Mia-PaCa2 eller Panc1 celler vekst ble betydelig redusert, noe som var forventet fordi isoformene 1 og 2 er rikelig i ikke-stresset celler som viser normal vekst. Derfor, i spenningsforholdene vekst er begrenset både av redusert ekspresjon av isoformer 1 og 2 og ved overekspresjon av isoformen 3. På den annen side, ekspresjon av isoformen 1 eller 2 øker følsomheten av celler til pro-apototic stimuli, mens ekspresjon av isoform 3 øker sin motstand. Igjen, stress-indusert hemming av isoformer 1 og 2 uttrykk og overekspresjon av isoform tre både hjelpe cellene coping med et annet miljø. De molekylære mekanismer som disse proteiner kan påvirke cellevekst og resistens mot apoptose i motsatte retninger gjenstår å bli bestemt, selv om tapet i isoformen 3 av den C-terminale del av isoform en burde utgjøre en del av den. Likevel, på tross av viktige strukturelle forskjeller, de 3 WSB1 isoformene er like fordelt i cytoplasma som vist i Figur 1.
I konklusjonen, rapporterer vi at skiftet i WSB1 isoform uttrykk observert i menneskelige kreft i bukspyttkjertelen celler innsendt til en belastning er lik den forskyvning observert når disse cellene er xenopodet i nakne mus, eller i humane pankreatiske tumorer. Ved at skift resulterer i redusert vekst av cellene, det øker også i betydelig grad deres resistens mot apoptose. Disse dataene støtter hypotesen om at aktivering av stressresponsmekanismer bidrar til kreftceller etablere metastaser, ettersom den samme WSB1 isoform ratio er observert i bukspyttkjertelen adenokarsinomer. Enten stress-induserte endringer i WSB1 isoform uttrykk er nødvendig for tumorutvikling, noe som ville gjøre det til en potensiell terapeutisk mål, gjenstår imidlertid å bli undersøkt.
Materialer og metoder
Cellelinjer og celle dyrkningsforhold
Den menneskelige kreft i bukspyttkjertelen-avledet Mia-PaCa2, BxPC3, Panc-1, CAPAN-en og CAPAN-2, og Phoenix amfotrofisk viral emballasje cellelinjer ble dyrket som anbefalt av American Type Culture Collection.
Subkutan svulst induksjon i nakne mus
utestengelse av bukspyttkjertelen cellelinjer, (10
7/200 mL PBS) ble injisert subkutant i flanken av mannlige atymiske 7-8 uker gamle nakne mus, og tumorene ble tillatt å utvikle seg i 30 dager. Alle studiene ble utført i henhold til EU-reglene for dyreforsøk.
Menneskelige bukspyttkjerteltumorprøver
Bukspyttkjertel vev ble innhentet fra pasienter som gjennomgikk pankreas reseksjon ved Kirurgisk avdeling, Hopital Nord, Marseille, Frankrike. Institutional Review Board godkjenning ble innhentet fra Comité d’Ethique de l’Institut Paoli Calmettes (Marseille, Frankrike). Skriftlig informert samtykke er innhentet fra pasienter i samsvar med Helsinkideklarasjonen.
RNA isolering
Total RNA ble isolert av Trizol (Gibco-BRL) prosedyre.
Mikromatrise
eksperimentet ble utført på U133 2.0 Plus Genechip (Affymetrix, Santa Clara, CA), som tidligere beskrevet [17], og analysert med microarray Suite 5.0-programvaren (Affymetrix).
behandlinger
i noen eksperimenter, Mia-Paca2-celler ble behandlet i løpet av 24 timer med 10 uM Doxorubicin (Sigma), 0,5 uM Staurosporin (Sigma) eller 350 pM Gemcitabin (Eli Lilly), eller sendes til 24 timer serum mangel, eller til y-bestråling (5Grays)
hypoksi /anoksi
Oksygenkonsentrasjoner konsentrasjoner~~POS=HEADCOMP ble modifisert ved hjelp av en hypoksi inkubator kammer (katalog # 27310; Stem Cell Technologies). og passende gassblandinger (Linde gass, Frankrike ), å følge instruksjonene fra produsenten. Celler ble sendt til 5 h anoksi (5% CO
2, 95% N
2) eller 6-18 h hypoksi (5% CO
2, 94,8% N
2 og 0,2% O
2).
Kvantitativ RT-PCR-analyse
Første tråd cDNA ble syntetisert ved hjelp Utvid revers transkriptase (Roche, Meylan, Frankrike). Kvantitativ PCR ble utført ved hjelp av Roche Lys sykler system og reagenser, etter produsentens anvisninger. Primere benyttet og betingelsene for gløding var 5′-AGTGTCAGACTGATCTGG-3 «og 5′-ACAGTAGACGGATTCTTCAA-3′, 58 ° C i 7 sekunder; 5»-GATCATACTGAAGTGGTCAG-3 «og 5′-GCCCAAATTCCATCAGAATG-3′, 56 ° C i 14 sekunder; og 5»-GATCGTGGTTAGTTTGGG-3 «og 5′-TGGGTCACCAACTTGAG-3», 57 ° C i 6 sekunder; for global uttrykk for wsb1, isoformer 1 + 2 og isoformen 3 hhv. (Se fig Supplementary S1) Hver prøve ble analysert i duplikat, og forsøket ble gjentatt to ganger. Resultatene ble analysert ved hjelp av RelQuant (Roche) og uttrykt som et forhold av TATA-boks bindende protein (TBP) eller av kontrollverdiene (ubehandlede celler).
trans
Celler ble transfektert ved bruk av Fugene HD ( Roche Diagnostics) etter produsentens anvisninger med pEGFP-N1 plasmid (Clontech) inneholder full-lengde human WSB1 cDNA, isoform 1, 2 eller 3 (henholdsvis NM_015626, NM_134265, NM_134264), eller ingen innsats. De 3 isoformer ble også subklonet i pcDNA4-V5-A plasmid (Invitrogen).
WSB1 fluorescens
mus anti-V5 antistoff (Invitrogen) ble brukt til å påvise V5-merkede WSB1 proteiner og avslørt av geit Chromeo 488-konjugert anti-mus sekundære antistoff (ActiveMotif). Celler som uttrykker EGFP-WSB1 fusjonsproteiner ble bare løst. Celler ble montert i forlenge Gold (Invitrogen) og analysert med et Nikon I90 mikroskop (40 × /APO plan /NA1.40).
Retroviral vektor og retroviral-mediert genoverføring
3
