Abstract
Bakgrunn
Osteosarkom er den vanligste primære svulst i bein. Solide svulster er laget av heterogene cellepopulasjoner, som viser ulike mål og roller i tumor økonomi. En ganske liten celle undergruppe kan holde eller skaffe stamceller potensialer, få aggressivitet og økende levealder for tilbakefall. Den CD133-antigenet er et pentaspan membran glykoprotein, som er blitt foreslått som en kreftstamcelle markør, ettersom det tidligere er blitt vist å være i stand til å identifisere en kreft initiere subpopulasjon i hjerne, tykktarm, melanoma og andre faste tumorer. Derfor vårt mål var å observere mulige tilstedeværelsen av celler som uttrykker CD133 antigen i solide tumorcellelinjer osteosarkom og da forstå deres biologiske egenskaper og ytelser.
Metodikk og hovedfunnene
i denne studien bruker SAOS2, MG63 og U2OS, tre menneskelige sarkom cellelinjer isolert fra unge kaukasiske fag, var vi i stand til å identifisere og karakterisere, blant dem, CD133
+ celler som viser følgende funksjoner: høy spredning rate, cellesyklus deteksjon i en G2 \\ M fase, positivitet for Ki-67, og uttrykk for ABCG2 transportører. I tillegg til FACS, kunne vi observere CD133
+ cellefraksjon viser side befolkning profil og forming sfære-klynger i serumfritt medium med høy klonogene effektivitet.
Konklusjoner
til sammen våre funn fører til tanken på at vi kan anta at vi har identifisert, for første gang, CD133
+ celler i osteosarkom cellelinjer, viser mange funksjoner kreft stamceller. Dette kan være av ganske interesse for å designe nye behandlingsformer mot bein kreft
Citation. Tirino V, Desiderio V, d’Aquino R, De Francesco F, Pirozzi G, Galderisi U, et al. (2008) Påvisning og karakterisering av CD133
+ kreftstamceller i menneske Solid Svulster. PLoS ONE 3 (10): e3469. doi: 10,1371 /journal.pone.0003469
Redaktør: Thomas Zwaka, Baylor College of Medicine, USA
mottatt: 12. mai 2008; Godkjent: 29 september 2008; Publisert: 21 oktober 2008
Copyright: © 2008 Tirino et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. MURST ( Italia), andre University of Naples. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Osteosarkom er den vanligste primære svulst i bein. Det forekommer i bein og ekstra ossøs nettsteder, og viser en bimodal aldersfordeling, med en første topp i det andre tiåret av livet, knyttet til den unge vekstspurten (400 nye pediatriske tilfeller per år i USA USA USA) og en annen topp i eldre voksne [1]. Forekomsten er noe høyere i afrikansk-amerikanere enn i kaukasiere og død er vanligvis et resultat av progressive lungemetastaser med respirasjonssvikt på grunn av utbredt sykdom [2]. Sarkom genetiske endringer omfatte både oncosuppressor og onkogene reaksjonsveier, hvis produkter regulere cellesyklusprogresjon [3]. Egentlig er det vel kjent at solide svulster er befolket av heterogene cellepopulasjoner som omfatter celler med stilk-lignende egenskaper, for eksempel høy spredning rate, rask ekspansjon og invasiv vekst [4], [5].
En svulst kan tenkes som en helhet organ, dannet av forskjellige celler som viser distinkte roller i økonomien av tumoren. Det er velkjent at funksjonen av stamceller er å vedlikeholde og reparere vev. Stem potensialet kan også kjøpt opp av kreftceller, og denne hendelsen er svært viktig for tumorprogresjon.
Gjeldende mening er at svulster kan stamme fra et lite antall celler med stilk-lignende egenskaper. Nye behandlingsformer rettet mot disse cellene, som er grunnleggende for tumorprogresjon, kunne gi en betydelig bedre klinisk behandling av kreft. Derfor er det av avgjørende betydning å identifisere, innen svulster, subpopulasjoner av celler som utviser signifikante forskjeller når det gjelder spredning, stem markør uttrykk og atferd.
CD133 antigen er et pentaspan membran glykoprotein, preget av to uavhengige studier [6], [7], og som opprinnelig ble identifisert i neuroepithelial stamceller [8]. Dens interesse som en kreft stilk markør har vokst dramatisk siden det viste seg at det var i stand til å identifisere en kreft initiere undergruppe i hjernen [9] og tykktarm [10]. Videre CD133
+ celler er også blitt funnet i hepatokarsinom [11] og melanom [12], men opp til nå, ikke ennå i osteosarkomer, i hvilken nærvær av antatte stilk-lignende celler som danner kulene er blitt rapportert [13 ].
Derfor ønsket vi å bruke CD133 som en markør for å påvise mulig forekomst av kreft stamceller innenfor SAOS2, MG63 og U2OS menneskelig sarkom cellelinjer isolert fra osteosarcomer av unge kaukasiske fag. Disse cellelinjer tidligere er blitt brukt som modeller av osteosarkom [14], [15] og osteoblast-lignende celler [16], [17]. I denne studien, for å spesifikt identifisere CD133
+ kreft stamceller, har vi undersøkt sammenhengen mellom stilk funksjoner og kinetikken av CD133 markør uttrykk.
Våre resultater, først av alt demonstrere, for første gang, at CD133-antigenet kan observeres i celler i forskjellige osteosarkom stabiliserte cellelinjer. Videre har vi vist at disse cellene viser høy formeringshastigheten, og at de er i stand til å danne klase kuler. I tillegg har vi funnet at disse celler er svært tumorgene og klonogene. Til sammen våre data føre til tanken på at kreftstamceller (cscs), som er kreft initiere celler, kan bli funnet i osteosarcomer og dette kan være av avgjørende betydning ved utformingen av nye anti-kreft terapier for bein.
Resultatene
SAOS2, U2OS og MG-63 osteosarcom-cellelinjer ble testet for å detektere, i seg, tilstedeværelsen av en CD133
+-cellepopulasjonen. CD133 er en stamcelle markør som er beskrevet for første gang i neuro-endotel-progenitorceller, og nylig har blitt antatt å være en selektiv markør for Cancer Stem Cells (CSC) i enkelte krefttyper. Våre resultater viser klart at i alle de tre cellelinjer, to subpopulasjoner: en CD133
+ (som varierer fra 3% til 5%) og en CD133
-, kan identifiseres (Fig. 1). Bruke FACsorting, fikk vi en CD133
+ beriket befolkningen (98,8%) og en CD133
– cellepopulasjon. Ekspresjonen av CD133 antigen ble analysert ved anvendelse av to forskjellige antistoffer. Resultatene bekreftet at CD133-negative celler ikke uttrykker antigenet på celleoverflaten, og at CD133-positive celler ble uttrykt på samme prosentvise nivå ved hjelp av begge antistoffer.
A CD133
+-cellepopulasjonen kan påvises i alle tre cellelinjene.
i tillegg, alle tre cellelinjene var negativ for CD34 antigenet, men de dokumentert like sterk positivitet for CD29, CD44 og CD90, mesenchymale og kreft stamceller markører. Begge fraksjonene av CD133
+ og CD133
– celler var positive for CD29, CD44 og CD90 antigenene i alle tre cellelinjer (Fig. 2)
Alle tre cellelinjer er negativ for CD34. antigen men de bevis like sterk positivitet for CD29, CD44 og CD90
de to celle populasjoner (CD133
+ og CD133
-). ble så brukt til å utføre cellesyklus analyse, vekst analyse, sfære cluster-analysen, myk agar assay og siden befolkningen deteksjon.
Cell syklus, proliferasjonsanalyser og Vekst analyserer
propidium jodid (PI) assay viste en markant forskjell i cellesyklusen CD133 sortert celler. CD133
+ -celler var hovedsakelig i G2 \\ M fase, mens CD133
– celler var overveiende i G0 \\ G1 (figur 3A.), Noe som indikerer at CD133
+ undergruppe er den aktive prolifererende cellefraksjon. Dessuten, alle de CD133
+ celler viste seg å være Ki-67
+ (Fig 3B.) Mens flertallet av CD133
– celler var negative for denne markøren. Ki-67 er et protein som uttrykkes bare i prolifererende celler, og dermed våre resultater bekrefter at CD133
+ fraksjonen er kilden til nylig genererte celler.
(A) Figur av cellesyklus-analyser utført på SAOS2, MG63 og U2OS cellelinjer. En CD133
+ celle befolkningen er hovedsakelig observerbare i G2 \\ M fase, mens CD133
– celler var overveiende i G0 \\ G1; (B) Figur viser Ki-67 reaktivitet. CD133
+ celler viste seg å være Ki-67
+, mens CD133
– var hovedsakelig negative for denne markøren; (C) Figur som viser vekstkurver av CD133
+ celler med respekt CD133
– celler i SAOS2, MG63 og U2OS cellelinjer. CD133
+ -celler har en høy proliferativ potensial i alle tre cellelinjer.
I tillegg, for å vise om CD133
+ celler var i stand til å extensivelly proliferere når sammenlignet med CD133
– celler, observerte vi deres vekst. Våre data viser at tumor kulturer avledet fra CD133
+ celler viser høyere proliferativ potensial med hensyn til CD133
– celler i alle tre cellelinjer. Faktisk (Fig 3C) CD133
+ celler viste en gjennomsnittlig dobling på ca 40 timer, 33 timer og 38 timer i SAOS2, MG63 og U2OS cellelinjer henholdsvis, mens CD133
– celler viste en gjennomsnittlig dobling tid 48 timer, 44 timer og 42 timer i henholdsvis SAOS2, MG63 og U2OS cellelinjer. Når cellene var tilhenger, etter sortering, andelen av CD133 uttrykker cellene betydelig redusert (p 0,001) med tidspunktet for kultur (data ikke vist)
Sphere Cluster Formation
Evnen til å vokse. i suspensjon i serumfritt medium, ble beskrevet for første gang for å velge neurale stamcelle gjennom neurosfære formasjon, har i stor grad blitt undersøkt som en tumorcelle initiere utvelgelsesmetode. Glioblastom, tykktarmskreft og melanom-celler fremfor alt, er valgt for deres evne til å danne kule klynger, ble funnet å være svært tumorgene og i stand til å forplante seg og rekonstituere opprinnelig tumor arkitektur når de injiseres inn i ettergivende verter. Våre resultater på osteosarcom-cellelinjer indikerte at kule klaser ble klart observert allerede etter 24 timer i CD133
+ kulturer, mens CD133
(figur 4A, C, D.) – Ikke danner kuler (figur 4B.). Etter 7 dagers kultur, sfærer erholdt i CD133
+ celler ble sådd på standard plater med 10% FBS. Celler migrerte fra kulene i løpet av få timer, og klebet til bunnen av kolbene, forutsatt en polygonal form. Disse cellene viste seg å være mindre i størrelse, sammenlignet med CD133
– celler. Etter en uke, utførte vi en ytterligere test for CD133 antigen på adherente celler. Interessant, igjen en CD133
– befolkningen ble observert, og gir bevis for at CD133
– celler, på denne tiden, stammer fra CD133
+ celle. Deretter utførte vi en ny sortering av disse cellene og observerte at CD133
+ brøkdel fortsatt beholdt evnen til å danne kuler, mens CD133
-. Gjorde ikke
(A) Sphere klynger dannet av CD133
+ celler i halvfast medium etter 24 timer (Original Forstørrelse x 100); (B) CD133
– celler i halvfast medium etter 7 dager, ikke danner kuler. (Original Forstørrelse x 100); (C) Sphere klynger dannet av CD133
+ celler etter 48 timer (Original Forstørrelse × 200); (D) Sphere klynger dannet av CD133
+ celler etter en ny sortering (Original Forstørrelse x 400).
I tillegg har vi testet OCT3 /4 og CD133 uttrykk på 6
th celle passasje og ved 4
th og 6
th passasje, henholdsvis på sarcospheres avledet fra CD133
+ celler etter sortering. Resultatene viste at kulene ble beriket både i OCT3 /4 og CD133 med tidspunktet for kultur (Fig. 5).
Den blå linjen viser isotype kontroller, røde og grønne linjer angir uttrykket av CD133 på 4
th og 6
th celle passasje, henholdsvis. I histogrammene blir OCT3 /4 ekspresjon analysert ved 6
te celle passasje; den grønne linjen viser isotype kontroller. Sarcospheres både i CD133 og OCT3 /4 er sterkt positiv.
Soft Agar Analyse
Myke agar ble utført for å observere forskjeller i celle tumorigenicity ved hjelp av evnen til CD133
+ celler til å danne kolonier med respekt CD133
– celler. Som vist i tabell 1, ble kolonier dannet mer effektivt ved CD133
+ -celler, noe som ga opphav til et 5,5 ± 1,8 ganger større antall kolonier enn de som detekteres i CD133
– populasjonen (
p
0,005) i SAOS2; 7,7 ± 1,5 ganger større antall kolonier enn de som ble observert i CD133
– populasjon (
p
0,001) i MG63, og 6,8 ± 1,7 ganger større antall kolonier enn de som ble observert i CD133
– befolkningen i U2OS (P 0,005)
Side befolkning og ABCG2
i CD133
+ brøkdel en svært liten del (0,97%) uttrykte det karakteristiske. profilen til en side befolkning. Det er kjent at side populasjonen fenotype er den mest betydningsfulle egenskap av kreft stamceller. I denne studien viser vi for første gang at det i osteosarcom-cellelinjer en side populasjon kan detekteres. Videre fant vi at alle tre cellelinjene uttrykte ABCG2 transporter (Fig. 6) som vanligvis er forbundet med side befolkning fenotype og stoffet motstand.
(A) cytometri analyser av side befolkningen. Den CD133
+ brøkdel omfatter en liten del (0,97%), uttrykker den karakteristiske profilen av en side befolkningen FACS. (B) ABCG2 ekspresjon i SAOS2 cellelinje og viser en tydelig positivitet; den grå linjen angir isotypekontrollantistoff.
Immunohistochemistry og immunfluorescens
Både immunhistokjemiske og immunfluorescens analyser følges celler og flytende kuler ble utført i denne studien. Våre resultater, følgelig med FACS-analyser bekreftet tilstedeværelsen av den CD133 antigen på cellemembranen av CD133
+ sorterte cellene. Videre flytende kuler viste en mye diffus farging for CD133, bekreftende på at kulene er dannet av CD133
+ celler. Interessant, CD133
– ble sortert fraksjon farget for CD133, som var lokalisert innenfor intra-cytoplasmatiske vesikler som vist ved confoal mikroskopi (figur 7A, B, C, D, E, F.). For å dypt forstå dette aspektet, vi utført, ved FACS, en intracellulær farging for CD133. Vi fant at i alle de tre cellelinjene en intracellulær positivitet ble observert (fig. 8A), mens kontroll-isotypene var negative.
(A) Immunhistokjemisk analyse av adherente celler og (b) flytende kuler som viser nærvær av CD133 antigen (piler). (Original Forstørrelse × 100.); (C) Immunofluorescensanalyse på SAOS-2 for CD133 PE, er cytoskjelettet farget med phalloidin-FITC, kjerne med DAPI (Original Forstørrelse × 400.); (D) Immunoflurescence analyse på Saos-2 kuler for CD133 PE etter 24 timer i vedheft. (Original Forstørrelse x 200); (E) Confocal analyser av adherente celler og (F) med flytende kuler som bekrefter nærværet av CD133 antigen. (Original Forstørrelse. × 400).
(A) Figur utført ved FACS viser intracellulær uttrykk for CD133 antigen i Saos-2, MG-63 og U2OS. (B) Figur viser på Real time PCR mRNA transkripsjon uttrykk i CD133
+ og CD133
– celler. Nivåene er nesten identisk som registreres av både CD133 positive og negative celler.
Real Time PCR-analyse
uttrykk for CD133 mRNA nivåer i CD133
+ og CD133
– heftende celler var nesten identisk som oppdages av real Time PCR (fig 8B.). Dette bekrefter både FACS og immunfluorescens resultater, som vist ovenfor.
Diskusjoner
Osteosarkom er en svært aggressiv svulst, som overveiende rammer unge mennesker. Følgende nyere studier [10] – [13], [18] som støtter nærvær av en sterkt tumorigen celleundersett – ofte kalt Cancer Stem Cells (cscs) – innen tumoren bulk, vi forsøkt å isolere og karakterisere denne subpopulasjon i osteosarcom-cellelinjer . Tumor lesjoner omfatte heterogene cellepopulasjoner, blant annet tilstedeværelse av stamceller antigener kan bekreftes ved hjelp av fenotypiske analyser. Tilstedeværelsen av en CD133
+ undergruppe innenfor humane faste tumorer er blitt dokumentert av flere rapporter [10] – [13], [18] – [21], og celler som uttrykker denne markøren synes å være forskjellig fra de andre kreftcellene . Spesielt CD133
+ celler besitter stamceller har, slik som differensiering evne, høy formeringshastigheten, sfære klyngedannelse og evnen til å forplante tumor i givende verter. Kreft terapi feil kan skyldes ineffektiv effekter av nåværende behandling ved potensielt hvil cscs, som forblir vital og beholde evnen til å regenerere tumor [22], [23]. Utvikling av nye CSC-målrettede strategier er i dag hindret av mangel på pålitelige markører for identifikasjon av cscs og dårlig forståelse av deres oppførsel og skjebne. Cellelinjer, avledet fra svulster, beholde hierarkiske stamcelle mønstre, påvise med ulike klonogene evner, knyttet til mobilnettet egenskaper, som størrelse, klebrighet, fargestoff utstøting og genuttrykksmønster [24].
I denne studien, vi brukte CD133 antigen som en kreftstamcelle markør for å identifisere, innenfor stabilisert osteosarcom cellelinjer, celler som viser forskjellige egenskaper når det gjelder spredning rate, klonogene effektivitet, sfære-cluster dannelse og dye eksklusjon. Screening tre osteosarcom-cellelinjer, ble CD133
+ -undergrupper funnet å være 3% til 5% av totale celler, i samsvar med den forutsetning at cscs skulle være bare en meget liten celleundersett. Det er ingen forskjeller i CD29, CD44 og CD90 uttrykk både i CD133
+ og CD133
– celler. Egentlig er kreft stamceller anses å være sovende
in vivo Hotell og de sjelden dele asymmetrisk, føder sterkt voksende avkom [5]. Likevel, hvis en stilk hierarki eksisterer i cellelinjer, celler med stilk egenskaper kan ikke være stillestående; ellers, bør de være borte i noen passasjer. Ifølge med dette hensynet, fant vi at CD133
+ celler var svært proliferativ, sammenlignet med CD133
– celler, som bekreftet av PI analyse, Ki-67 merking og vekst analyser
CD133
+ -celler viste mange forskjeller med hensyn til deres negative motstykker, ha evnen til å vokse som kuler i en halvfast medium og til effektivt å danne kolonier i bløt agar. Disse analysene er ofte regnet som henholdsvis indekser av selvfornyelse, tumorigenitet og clonogenicity. Videre sarcospheres, som stammer fra CD133
+ celler, uttrykte høye nivåer av OCT3 /4, som er transkripsjonsfaktorer kritisk involvert i selvfornyelse og i vedlikehold av pluripotency av udifferensierte embryonale stamceller [25]. I våre hender det CD133
+ celler viste alle disse egenskaper og uttrykt ABCG2, som er en membrantransportøren, vanligvis forbundet med side befolkning fenotype og narkotika motstand [26]. Derfor kan dette betraktes å være en ekstra markør for cscs. I tillegg, i denne studien, vi effektivt viste for første gang at en side populasjon kan bli detektert også i osteosarcom-cellelinjer. Den siden populasjonen er definert av Hoechst utelukkelse i flowcytometri [27], [28]. Den utgjør bare en liten brøkdel av hele cellepopulasjon og uttrykker høye nivåer av forskjellige medlemmer av ABC-transportør familien, for eksempel ABCG2 og MDR1, som er ansvarlig for legemiddelresistens [29], [30]. Som forventet fant vi at siden befolkningen ble gjort av en meget liten del (0,97%) av den totale celler, og interessant, det var helt inkludert i CD133
+ undergruppe.
Våre data , tatt sammen, kan føre til at den første tankene som CD133
+ cellene er kreft stamceller. Egentlig, selv om dette bør støttes av en
in vivo
svulst xenograft, som vist i andre solide tumorer [10] – [13], [18] – [21], dessverre, vi var ikke i stand til å utføre
in vivo
eksperimenter fordi osteosarkom cellelinjer ikke pode med noen vert. Vi effektivt prøvde å utføre
in vivo
transplantasjon av våre CD133 stamceller, men uten å lykkes, i likhet med alle de andre forskere.
I tillegg kan vi også hypotese at CD133
+ undergruppe omfatter en mindre CD133
+ \\ ABCG2
+ \\ SP
+ befolkningen, noe som kan være motstandsdyktig mot medisiner, besitter stem funksjoner og kan effektivt driver kreft progresjon.
Det er interessant og uventet, i våre hender, noen celler som ikke uttrykker CD133 markør på membranen ført til å produsere en detekterbar mengde av CD133 mRNA-transkripter, og uttrykte CD133 antigenet i cytoplasmatiske vesikler som vist ved konfokal mikroskopi. Likevel CD133
+ og CD133
– sortert populasjoner tydelig vise forskjellige atferd. Dette leder oss til å spekulere på den funksjonelle rollen CD133 i organiseringen av membranen og i valg av cscs, som følger: i) er CD133 svært involvert i sfæren klynge formasjon, er det nødvendig for ikke-klebende cellevekst samt for celle-til -celle krysstale, noe som gjør at cellene til å kommunisere og motta stimuli som normalt leveres av adhesjonsmolekyler; ii) CD133
+ og CD133
– bestandene er i kontinuerlig og gjensidig utveksling og bare sanne cscs uttrykke CD133 stadig på membranen
I konklusjonen, våre funn tyder på at CD133 markør kan være nyttig for. indikerer differensiert /udifferensiert tilstand av osteosarkom svulster og dette kan føre til nye tilnærminger for å utforme en mer spesifikk terapi og lindre prognose.
Materialer og metoder
Cell kultur
SAOS2, MG63 og U2OS ble kjøpt fra ATCC CELL BANK; Cellene ble plassert i α-MEM-kulturmedium, supplert med 15% FCS, 100 uM 2P-askorbinsyre, 2 mM L-glutamin, 100 U /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin (alle anskaffet fra Invitrogen, San Giuliano Milanese, Milano, Italia) og plassert i 75 ml kolber med filtrert ventiler. Kolbene ble inkubert ved 37 ° C i en 5% CO
2 og mediet forandret to ganger i uken. Etter konfluens, ble cellene delt inn nye kolber til slutten av forsøket.
Flow Cytometry and Cell Sorting
Cellene ble løsnet ved bruk av 0,02% EDTA i fosfatbufret saltoppløsning (PBS), telles og vasket i 0,1% BSA i PBS. Minst 500.000 celler (i 100 ul PBS /0,5% BSA) ble inkubert med fluorescensmerkede monoklonale antistoffer eller respektive isotype kontroller (1/10 fortynnet 4 ° C i 30 minutter i mørket). Etter vasketrinn ble de merkede cellene analysert ved flowcytometri ved hjelp av en FACS Vantage cellesorterer (Becton Dickinson, Mountain View, CA, USA). Antistoffene som ble brukt var mus anti-human CD133 /2 PE konjugert (Miltenyi Biotec Srl Calderara di Reno, Bologna, Italia), mus anti-human CD133 PE konjugert (eBioscience), mus anti-human CD29 CY konjugert (BD Pharmingen, Buccinasco, Milano, Italia), muse-anti-human CD34 PE-konjugert (Miltenyi Biotec), muse-anti-human CD44 FITC-konjugert (Miltenyi Biotec), muse-anti-human CD90 FITC-konjugert (BD Pharmingen), muse-anti-human OCT3 /4 ikke-konjugert (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, California, USA), muse-anti-humant Ki67 FITC-konjugert (Miltenyi Biotec) og muse anti-humant ABCG2 ikke-konjugert (Santa Cruz). CD133
+ celler ble sortert for eksperimenter. CD133
– cellene ble høstet som kontroll. Renheten av sorterte populasjonene ble rutinemessig 90%. Isotyper ble brukt som kontroller
Syv dager etter sortering, CD133
-. Celler ble frittliggende og testet to ganger for CD133 uttrykk. OCT3 /4 uttrykk ble analysert ved 6
th celle passasje (en «passasje» indikerer at cellene er frittliggende når ved samløpet), mens CD133 uttrykk ble analysert ved 4
th og 6
th celle passasje på sarcopheres avledet fra CD133
+ celler i de tre cellelinjer
for intracellulær farging av Ki67, CD133 og OCT3 /4, celler ble behandlet med Caltag Fix Perm Kit (Invitrogen, Milano, Italia) etter produsentens retningslinjer. Alle data ble analysert ved hjelp av en Cellquest programvare.
Hoechst 33342 Utelukkelse analysen
SAOS2, MG63 og U2OS cellene ble resuspendert til 2,0 × 10
6 celler /ml i forvarmet α- MEM-kulturmedium og oppdelt i to porsjoner. En porsjon ble behandlet med 50 uM verapamil og den andre var ubehandlet. Begge porsjoner ble inkubert i α-MEM-kulturmedium med 5 ug /ml Hoechst 33342 (Sigma, Milano, Italia) i 90 minutter ved 37 ° C. Etter inkubasjon ble cellene vasket i PBS og holdt på is i 5 minutter, og analysert for Hoechst 33342-utstrømning ved FACS Vantage (Becton Dickinson, Milano, Italia) [31]. Den Hoechst 33342 fargestoff var spent på 350 nm ultrafiolett og resulterende fluorescens ble målt ved to bølgelengder ved hjelp av en 424/44 BP og 675 LP filtre for påvisning av Hoechst blå og røde, henholdsvis.
cellesyklus og formering Analyser
Cellesyklus syklus~~POS=HEADCOMP ble analysert ved flowcytometri. Celler ble høstet i PBS inneholdende 2 mM EDTA, vasket en gang med PBS, fiksert i avkjølt etanol 70 ° og inkubert med 50 ug /ml PI (Sigma) pluss Rnasi 1 mg /ml i 60 minutter ved 4 ° C i mørket. Stained kjerner ble analysert med en FACS Vantage cellesorterer (Becton Dickinson, Mountain View, CA, USA)., Og dataene analysert ved hjelp av en Mod-Fit 2,0 cellesyklusanalyseprogram (Becton Dickinson)
vekstanalyse
etter sortering av CD133, SAOS2, MG-63 og U2OS celler ble sådd ut med en tetthet på 8,0 x 10
4 celler /brønn i 6-brønns plater. Hver tolv timer ble cellene høstet og resuspendert i PBS. En alikvot av cellesuspensjonen ble fortynnet med 0,4% trypanblått (Sigma-Aldrich), pipettert på et hemocytometer og tellet under et mikroskop ved 200 x forstørrelse. Levende celler ekskludert fargestoff, mens døde celler innrømmet fargestoff og dermed farget intenst med trypanblått. Antallet levedyktige celler for hver eksperimentell tilstand ble tellet og representeres på en lineær graf. Fordoblingstiden (DT) ble bestemt ut fra vekstkurver, eller ved hjelp av formelen: hvor t og t
0 var de tider ved hvilke cellene ble tellet, og N og N
0 var cellenumrene til tider t og t
0, henholdsvis [32].
Soft Agar analysen
for å analysere de ulike karsinogent potensial til to cellefraksjoner, CD133
+ og CD133
– celler ble platet i bløt agar med en tetthet på 100, 500 eller 1000 celler /brønn i 24 brønn plater i triplikat. Colo 38 melanomcellelinje ble anvendt som positiv kontroll.
For basislaget, ble 2,4% agar stamoppløsning smeltet i en mikrobølgeovn, avkjølt til 40 C i et vannbad og deretter blandet med kulturmedium for å oppnå en oppløsning av 0,8% Agar i α-MEM. 0,5 ml /brønn av denne oppløsning ble tilsatt til 24-brønners plater. For det øverste laget, ble agaren stamløsning fortynnet med kulturmedium for å oppnå en oppløsning på 0,3% agar i α-MEM. 0,5 ml /brønn av oppløsningen ble forsiktig blandet og porsjonert ut i 24-brønners plater. CD133
+, CD133
– og Wilde typen SAOS-2, MG63 og U2OS celler ble suksessivt sådd ut og inkubert i 21 dager ved 37 ° C i en fuktet atmosfære av 5% CO2 i luft og 50 ul α-MEM . Ved slutten av inkubasjonsperioden, ble kolonier farget med 150 ul /brønn av NBT (nitrobluetetraziolium) ved en konsentrasjon på 1 mg /2 ml i PBS, og tellet ved bruk av et invertert mikroskop (Nikon TS 100, Nikon, Milano, Italia) .
immunfluorescens Farging
CD133
+ og CD133
– celler dyrket i 24-brønners plater ble løst med en løsning av 4% paraformaldehyde /0,2% Triton i PBS i 30 min ved 4 ° C, vasket i PBS, ble behandlet med PBS /5% melk i 60 minutter ved romtemperatur og deretter farget med primære antistoffer ved 4 ° C over natten. De primære antistoffene som ble anvendt muse-anti-human CD133 /2 PE-konjugert (Miltenyi Biotec), muse-anti-humant Phalloidin FITC-konjugert (AlexaFluor-Invitrogen) inkubert i 60 min ved 4 ° C. Kjernene ble farget med DAPI. Cellene ble deretter vasket to ganger som beskrevet ovenfor og observert under fluorescens mikroskop (Nikon TE 2000-S, Milano, Italia). Isotyper og ikke-probet celler ble brukt som kontroller.
Sphere Analyser
Celler ble sådd ut i en tetthet på 60.000 celler /brønn på 6-brønners ultralave festeplater (Corning Inc., Corning , NY, USA) i DMEM /F12 celle-medium, supplementert med 1% metylcellulose, progesteron (10 nM), putrescin (50 uM), natriumselenitt (15 nM), transferrin (13 ug /ml), insulin (10 ug /ml; Sigma) og human EGF (10 ng /ml) og human bFGF (10 ng /ml; Sigma) [13]. Friske prøver av EGF og bFGF ble tilsatt annen hver dag. Etter dyrking i 48-72 timer, kuler var synlige ved omvendt fase-kontrast mikroskop (Nikon TS 100, Nikon).
Laser-scanning konfokalmikroskopi
Celler dyrket i 24 brønners plater ble fikset med 4% paraformaldehyd i 30 minutter ved 4 ° C, vasket i PBS, ble behandlet med PBS /5% melk i 60 minutter ved romtemperatur og deretter inkubert med primære antistoffer ved 4 ° C over natten. Det primære antistoff var et mus anti-human CD133 /1 Pure (Miltenyi Biotec); det sekundære antistoff (geite-anti-muse-FITC eller PE-konjugert Abcam) ble inkubert i 60 min ved 4 ° C, og den DAPI, brukes til å farge kjernen, ble inkubert i 7 minutter ved romtemperatur. Den samme prosedyre ble utført på sarcospheres. Alle merkede celler ble lagret ved 4 ° C før bildene oppkjøp, ved hjelp av et Zeiss laser-scanning konfokalmikroskop LSM 510 Meta (Zeiss- Oberkocken-Tyskland). Bilder ble tatt med en oppløsning på 512 × 512 piksler. Den riktige argon-laser fluorescens for visualisering av CD133 ble anvendt sammen med en eksitasjonsbølgelengde på 488 nm og emisjonsfilter BP 505-530.
immunhistokjemi
Immunoistochemistry for CD133 på SAOS2, MG63 og U2OS cellene ble utført. Celler ble sådd ut i en tetthet på 50.000 celler /brønn i 24 brønners plater, fiksert med 3,5% paraformaldehyd i 10 minutter ved 4 ° C, og vasket i PBS. Primære antistoff som ble benyttet var mus-anti-human CD133 /1 Pure (Miltenyi Biotec). For sekundære antistoff og farging, ble DAKO Cytomation En Vision + System-HRP kit (AEC) som brukes i henhold til produsentens instruksjoner. Kjernene ble farget med hematoksylin og cellene ble observert under en invertert lysmikroskop. Denne prosedyren ble også utført på sarcospheres.
RT-Real time PCR
Sekvenser for mRNA fra nucleotide databanken (National Center for Biotechnology Information, USA) ble brukt til å designe primerpar for RT -PCR reaksjoner (Primer Express, Applied Biosystems, CA, USA). Primer sekvenser er tilgjengelig på forespørsel. Egnede områder av HPRT (hypoxantin-guanin fosforibosyl) cDNA ble anvendt som kontroller.
