Abstract
metastasering av tykktarmskreftceller øker risikoen for tykktarmskreft dødelighet. Vi har nylig vist at American ginseng hindrer tykktarmskreft, og en heksan ekstrakt av amerikanske Ginseng (HAG) har spesielt potente anti-inflammatorisk og anti-kreft egenskaper. Feilregulert mikroRNA (MIR) uttrykk har blitt observert i flere sykdomstilstander, inkludert tykktarmskreft. Ved hjelp av global MIR uttrykk profilering, observerte vi økt Mir-29b i kolon kreftceller etter eksponering for HÅG. Siden MIR-29b spiller en rolle i å regulere migrasjon av kreftceller, hypotese vi at HAG induserer MIR-29b uttrykk for å målrette matriksmetalloproteinase-2 (MMP-2) for derved å undertrykke migreringen av tykktarmskreftceller. Resultatene er i samsvar med denne hypotesen. Vår studie støtter den forståelse at målretting MMP-2 av MIR-29b er en mekanisme som HAG undertrykker migrering av tykktarmskreftceller
Citation. Poudyal D, Cui X, Le PM, Hofseth AB, Windust A , Nagarkatti M, et al. (2013) en nøkkelrolle for mikroRNA-29b for bekjempelse av tykktarmskreft cellemigrasjon fra American ginseng. PLoS ONE 8 (10): e75034. doi: 10,1371 /journal.pone.0075034
Redaktør: A. R. M. Ruhul Amin, Winship Cancer Institute of Emory University, USA
mottatt: 15 april 2013; Godkjent: 07.08.2013; Publisert: 09.10.2013
Dette er en åpen-tilgang artikkelen, fri for all opphavsrett, og kan bli fritt reproduseres, distribueres, overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål. Arbeidet er gjort tilgjengelig under Creative Commons CC0 public domain engasjement
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Senter for CAM forskning på autoimmune og inflammatoriske sykdommer, NIH stipend 1P01AT003961-01A1 (PN, LJH, MN) og Cobre finansiert University of South Carolina Senter for Colon Cancer Research, NIH stipend P20RR17698-01 (Franklin Berger, direktør). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarmskreft (CRC) er den tredje vanligste diagnosen kreft i både menn og kvinner, og den tredje største årsaken til kreftdød. I USA, American Cancer Society estimert 141,210 nye tilfeller av tykktarmskreft og 49,380 dødsfall i 2011. metastaser fører til 90% av kreftrelatert dødelighet [1], [2]. I prinsippet under metastasering av CRC, noen kreftceller fra primærtumormasse invadere omkringliggende vev, intravasate inn i blodkar til å reise gjennom blod og lymfekar, arrest i fjerne kapillærer, ekstravasere inn parenchyma av fjerne vev (primært lever og lunger) hvor de frø nye kolonier for å danne de makroskopiske sekundære tumorer [3]. Disse metastatiske kreftceller mister sin evne til å forholde seg til nabotumorceller og utvikle trekkende og invasive egenskapene til å spre til fjerne metastatiske organer. Mens du gjør det, de metastatiske celler gjennomgå endringer i genuttrykk og funksjon, og dermed få mer mesenchymal- lignende funksjoner og denne prosessen er betegnet som epithelial å Mesenchymale Transition (EMT), en viktig hendelse i malignitet. MicroRNAs (Mirs) er små ikke-kodende RNA på ca 22 nukleotider (NTS) lang at post-transcriptionally regulerer genuttrykk i planter og dyr. Hos dyr Mirs mål transkripsjoner gjennom ufullkommen baseparing av 2-7 nts av 5′-enden av MIR (såkalt «grunnlaget» sekvens) til flere nettsteder 3′-uoversatt regioner (UTR) av målet mRNA, og dette ufullkomne MIR-mRNA hybrider med sentrale buler (nt 9-12) rekrutterer miRNP (mikroRNA ribonucleoprotein kompleks) som gjør det mulig translasjonsforskning hemming eller eksonukleo-lytisk mRNA forfall [Anmeldt i [4]]. Mange housekeeping gener har utviklet seg med kortere lengde av 3′-UTR å unngå Mir regulering [5]. Om lag 50% av annotert menneskelige MIR gener er lokalisert i kreft forbundet genomiske regioner eller skjøre områder som er utsatt for forsterkning, sletting og trans i forskjellige tumorer inkludert tykktarmskreft [6]. På grunn av dette enkelte Mirs kan fungere enten som tumor-suppressor eller onkogener [7], [8], [9], [10], [11]. Expression profilering analyse har avdekket karakteristiske Mir signaturer som kan forutsi de kliniske resultatene av CRC [12], [13].
En av de klassiske kjennetegnene til kreft er muligheten for kreftceller å invadere og metastaserer [14] . Mirs er både positive og negative regulatorer av kreft metastase [15], [16], [17]. En negativ regulator av kreftmetastaser er MIR-29b [for eksempel [18], [19], [20], [21], [22]]. MIR-29b tilhører MIR-29 familien. Mir-29 familien består av tre paraloger: Mir-29A, -29b og -29c. MIR-29a og MIR-29b1 er plassert på kromosom 7q32; MIR-29b2 og MIR-29c er plassert på kromosom 1q23 [23]. MIR-29b1 og MIR-29b2 sekvenser er identiske, men skiller b1 og b2 på grunn av forskjellen i locus. MMP-2, en ekstracellulær matriks (ECM) nedbrytende enzym som har en større innblanding i metastase og angiogenese har vist seg å være den direkte mål for MIR-29b [20]
American ginseng (AG;.
Panax quinquefolius
) er en obligat skygge flerårig opprinnelig fra Nord-Amerika. Fra Bioassay guidet fraksjonering av AG, har vi nylig vist at en Heksan brøkdel av AG (HAG) er en potent antioksidant og anti-cancer agent [24], [25]. Til dags dato har kun begrenset anti-kreft-studier av lipofile ekstrakter av AG blitt utført, og disse studier er for det meste rettet mot anti-proliferative og cytotoksiske effekter [26], [27], [28], [29]. For ytterligere å forstå anti-kreft mekanisme HAG (et lipofilt ekstrakt), studerte vi rollen som MIR i kreft celle migrasjon.
Materialer og metoder
Heksan Andel av AG:
P. quinquefolius
ekstrakt er blitt beskrevet tidligere i detalj av vårt laboratorium [30]. I tillegg har vi nylig beskrev generering av HAG brukt i denne studien [24].
cellekulturer
HCT 116 villtype (WT), Løvø og DLD-en kolon kreft celler ble kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). HCT 116-celler ble dyrket i McCoys medium (ATCC, Manassas, VA); LoVo-celler ble kultur i F-12K medium (ATCC, Manassas, VA); og DLD-1-celler ble kultur i RPMI-1640 medium. Alt medium ble supplementert med 10% serum fra nyfødt kalv (NBCS; GIBCO /Life Technologies, Grand Island, NY), 2 mM glutamin (Biofluids, Rockville, MD), penicillin (10 U /ml, Biofluids) og streptomycin (10 ug /ml, Biofluids).
Globalt mir Expression
HCT 116 WT celler ble sådd på 1 × 10
6 celler /plate i 6 brønners plater i fire gjentak. Etter dyrking i 24 timer ble 260 ug /ml HAG tilsatt til hver brønn. Cellene ble høstet ved 0, 12, og 24 timer hver for seg i RNase fri EP-rør. Total RNA ble ekstrahert ved bruk av TRIzol reagens (Ambion, Austin, TX). RNA-konsentrasjonen ble bestemt ved Nanodrop 2000 (Nanodrop, Wilmington, DE). 100 ng av RNA fra HCT 116 WT celler ble brukt for NCounter miRNA Expression analysen v1.2 (Nanostring Technologies, Seattle, WA) inneholder 800 miRNA følger etter produsentens anvisninger.
Mir-29b Expression
Celler ble sådd, utsatt for kjøretøy (kun media) eller 260 mikrogram /ml HAG, og høstet på 24 timer. For MIR-29b deteksjon, ble 10 ng av total RNA brukes til å reversere-transkribere til cDNA ved hjelp av TaqMan Mir Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA) i henhold til produsentens instruksjoner og Mir primere som er spesifikke for HSA-Mir-29b for deteksjon og den lille kjernefysiske protein RNU6B (U6) for normalisering (Applied Biosystems). qPCR måling av MIR-29b og U6 uttrykk ble utført ved bruk av TaqMan Mir Analyser (Applied Biosystems) med 7300 PCR analysesystem (Applied Bioystems). Den komparative terskel syklus (Ct) metoden ble brukt til å evaluere den relative overflod av Mir-29b sammenlignet med U6 uttrykk (fold endringer i forhold til U6). Alle eksperimentelle behandlinger ble utført på tre separate anledninger; hver gang med tre gjentak.
siRNA og Mir Transfeksjon
For MMP-2 siRNA, 1,5 × 10
5 celler ble dyrket i medium i 6 brønners plater 1 dag før transfeksjon. Ved hjelp av INTERFERin siRNA Transfection Reagent (Plyplus, iLllkirch, Frankrike) ble cellene transfektert med 5 nM MMP-2 Trilencer-27 human siRNA (Origene, Rockville, MD). Etter 48 timer med transfeksjon ble cellene behandlet for western blot-analyse for å evaluere effekten av knock down (figur S3). For Mirvana-MIR-29b-inhibitor og Mirvana-Negativ kontroll inhibitor (Ambion, Austin, TX) transfeksjon, 1,5 x 10
5-celler ble dyrket i medium i 6 brønners plater 1 dag før transfeksjon. Ved hjelp av INTERFERin siRNA Transfection Reagent (Polyplus transfeksjoner, Illkirch, Frankrike) ble cellene transfektert med 10 nmol /L av Mirvana-MIR-29b-inhibitor eller Mirvana-Negativ kontroll inhibitor. Etter 48 timer med transfeksjon, ble cellene høstet i RNase fri EP-rør. Total RNA ble ekstrahert ved hjelp TRIzol regent. RNA-konsentrasjonen ble bestemt ved Nanodrop 2000. 10 ng av total RNA ble revers-transkribert til cDNA ved anvendelse av TaqMan mikroRNA Reverse Transcription sett med mikroRNA primere som var spesifikke for HSA-MIR-29b og de små kjerneprotein RNU6B (U6) for normalisering. qPCR måling av miRNA-29b og U6 uttrykk ble utført ved bruk av TaqMan mikroRNA Analyser med 7300 PCR analysesystem. Den relative ganger endring i Mir-29b nivået ble brukt til å representere den relative overflod av miRNA-29b sammenlignet med U6 uttrykk. Per leverandør av Mirvana-MIR-29b Inhibitor (Ambion av Life Technologies, Austin, TX), effekten som de pattedyrceller blir transfektert med Mirvana-Mir inhibitor er avhengig av celletype og transfeksjon middel som brukes. Det anbefales at en optimalisering eksperiment (konsentrasjoner fra 1 nM til 100 nM MIR-inhibitor) bli utført for å oppnå den maksimale aktivitet med et minimum av cytotoksisitet. Transfeksjon effekt og opprinnelsen av tre cellelinjer HCT116, LoVo og DLD-1 er forskjellig og fra optimaliseringen eksperimentet (data ikke vist), Mirvana MIR-29b Inhibitor viste maksimal aktivitet ved 10 nM etter 48 timer med transfeksjon for HCT116-celler og 50 nM for LoVo og DLD-1 celler. Etter 48 timer av transfeksjon med Mirvana-MIR-29b inhibitor, ble HAG (260 ug /ml) tilsatt i 24 timer og cellene ble høstet for målgenet (MMP-2) ekspresjon og for migrering assay. Alle eksperimentelle kontrollprøver ble behandlet med en lik konsentrasjon av et ikke-målretting inhibitor negative kontrollsekvens, for bruk som kontroller for ikke-sekvensspesifikke effekter i mir eksperimenter. Mock-transfektert kontroller ga ikke noen vesentlig effekt på noen av de analyserte parametrene.
mRNA Analyse
Total RNA ble ekstrahert ved hjelp Trizol reagens (Invitrogen, CA). Ett pg av total RNA tjente som templat for enkelt tråd cDNA-syntese på en reaksjon ved anvendelse av oligo (dT) primere og AMV revers transkriptase (Promega Corp., WI) under betingelser som er angitt av produsenten. PCR fra cDNA-prøvene ble utført med prøver forsterkede for 30 sykluser med denaturering ved 94 ° C i 30 sekunder, annealing ved 50 ° C i 30 s, og forlengelse ved 72 ° C i 30 s med endelig forlengelse ved 72 ° C i 10 min . Sekvensene for Real Time PCR primere som ble brukt var: MMP-1 Forward 5′-AGG TCT CTG AGG GTC AAG CA-3 «; MMP-en Reverse 5»-CTG GTT GAA AAG CAT GAG CA-3 «; MMP-2 Forover 5»-ACA TCA AGG GCA TTC AGG AG-3 «; MMP-2 Reverse 5»-GCC TCG TAT ACC GCA TCA AT-3 «; MMP-7 Forward 5»-GAG TGC CAG ATG TTG CAG AA-3 «; MMP-7 Omvendt 5»-AAA TGC AGG GGG ATC TCT TT-3 «; MMP-9 forover 5»-TTG ACA GCG ACA AGA AGT GG-3 «; MMP-9 revers 5»-GCC ATT CAC GTC GTC CTT AT-3 «og GAPDH Forover 5′-GAG TCA ACG GAT TTG GTC GT-3′, GAPDH revers 5»-TTG ATT TTG GAG GGA TCT CG-3 «( integrerte DNA Technologies, Inc). Real-time PCR (qPCR) ble utført ved hjelp av 7300 Real-Time PCR-analyse System (Applied Biosystems, CA) med Power SYBR grønt PCR Master Mix (Applied Biosystems, CA) og primere for MMP-1, -2, -7, -9 og GAPDH henhold til leverandørens protokoll. MMP genuttrykk ble normalisert ved GAPDH genuttrykk. Den ganger endring i genekspresjon er i forhold til vektoren behandlede [1 x fosfatbufret saltvann (PBS)] cellene høstet ved 24 timer.
Western Blot analyse og antistoff
Western blots ble utført som tidligere beskrevet [31]. Antistoffer som brukes er: MMP-2 (Rabbit polyklonale, fortynnet 1 i 500, katt # 4022s, Cell Signaling Technology, Danvers, MA), og GAPDH (kanin polyklonale, fortynnet 1 i 1000, katt # 5174; Cell Signaling Technology, Danvers, MA). For alle blotter, en standard protein (referansenivå Prestained Protein Stige, Invitrogen, Carlsbad, CA) ble kjørt for å sikre den riktige molekylvekten for hvert bånd ble observert. Pepperrot-peroksidase-konjugert anti-kanin sekundære antistoffer ble innkjøpt fra Amersham Biosciences (Piscataway, NJ). Sekundære antistoffer ble fortynnet til 1:2000. Alle antistoffer ble fortynnet i 5% melk /PBST (0,1% Tween 20 i 1 x PBS). Western blot signal ble oppdaget av Pierce ECL Western blotting substrat (Thermo Scientific, Rockford, IL) og utviklet på Hyper.
In Vitro
analyse for Migration
24 godt Costar Transwell gjennomtrengelig bærer med en 8-um porestørrelse polykarbonatmembran (Corning Incorporated, New York), og med en 6,5 mm innskuddet ble brukt til å analysere den migrering av tumorceller. For denne migreringen analysen ble transwell membranen fuktet med 15 ug /ml av Collagen Type I (BD Biosciences) i 30 minutter ved 37 ° C i serumfritt medium. Kollagen ble fjernet ved pipettering og kollagenbelagt membran var sted på en 24 brønners plate. Celler ble serum sultet i 12 timer og 50.000 celler ble resuspendert i 200 ul serumfritt medium (SFM) og overføres på den øverste kammer i transwell. Den nederste kammeret ble fylt med 750 ul av SFM eller Komplett vekstmedium (10% NCS supplert, som en kjemoattraktant for celler) eller HAG (260 ug /ml i komplett medium). Transwell Platen ble inkubert ved 37 ° C i 12 timer. Etter inkubasjonen ble mediet fjernet fra kammeret, transwell membranen ble vasket i 1 x PBS, og cellene ble fiksert med formaldehyd (3,7% i PBS) og permeabilisert med 100% metanol og farget med 0,4% krystallfiolett flekken. Membranen ble vasket med 1 x PBS og ikke-migrerte på toppen av transwell membranen ble skrapt av med en steril bomullspinne. Transwell Membranen ble kuttet ut fra transwell kammeret og festet på mikroskopisk lysbilde med Permount og sett under mikroskop (100x forstørrelse). 7 tilfeldige seksjoner ble fotografert fra hvert lysbilde og de migrerte celler på bunnen av transwellmembranen ble automatisk telles ved hjelp av Image J programvare (https://rsbweb.nih.gov/ij/).
Statistisk analyse
for global MIR analyse, alle data ble importert til NSolver Analysis Software v1.0 (Nanostring Technologies) og normalisert til geometrisk gjennomsnitt av de 100 Mirs med de høyeste uttrykk verdier. Normalisert data ble importert til BRB-ArrayTools v4.1.0 for analyse. Før analyse av data ble filtrert, hvor en hvilken som helst verdi som er mindre enn 10 ble utelatt og noen MIR mangler i 50% av prøvene ble ekskludert forlater 248 mir s for analyse. Filtreringskriteriene ble satt slik at enhver normalisert datapunkt 10 eller log2 transformerte data verdi 3,321928 ble kalt mangler og ble ekskludert fordi det er på nivå med bakgrunnen. Bare de datapunkter 10 eller log2 transformerte data value 3.321928 ble tatt hensyn til og bestått filtrering kriterier forlater 248 Mirs for analyse. Klasse sammenligningstest benyttet Student t-tester for å sammenligne MIR er av behandlede vs. ubehandlede celler. Trend tester brukt lineær regresjon modellering av bestilte kategoriske variabler av 0 h, 12 h og 24 h. Den Benjamini-Hochberg prosedyren ble brukt til å beregne falske funnrate. Når mer enn to grupper ble sammenlignet, bestemt vi statistisk signifikante forskjeller ved hjelp av en en-veis analyse av varians, etterfulgt av en Scheffe multiple sammenligningstest. Dersom to grupper ble sammenlignet, benyttet vi en Student T-test. P verdi valgt for betydning i denne studien var 0,05.
Resultater
HAG Induserer Mir-29b i tykktarm kreft celler
American Ginseng og HÅG har begge utøves forebyggende effekt på den kjemisk induserte kolonkreft modell [24], [32]. For å starte vår studie, siden Mirs har vist seg å ha både pro-tumor og anti-tumor egenskaper, har vi sett på effekten av HAG på global Mir uttrykk i tykktarm kreft celler. Det var en signifikant positiv korrelasjon i 2 Mirs, og betydelig negativ korrelasjon i 6 Mirs etter eksponering av HCT 116 celler til HAG (260 mikrogram /ml) for 0 h, 12 timer og 24 timer (tabell 1). Basert på den forståelse at MIR-29-familien har blitt nedregulert i flere maligniteter [21], [23], [33], [34], at flere studier har vist at opp regulering av MIR-29 å ha anti-tumor effekter [22], [35], og at økt uttrykk av Mir-29b ble vist med to ulike statistiske metoder (tabell 1 og 2), vi fokusert på dette MIR. For å bekrefte MIR-29b oppregulering av HAG, vi gjentok eksperimentet og undersøkt Mir-29b oppregulering av QRT-PCR. I samsvar med de globale miRNA analyseresultatene viser figur 1 at det ble økt Mir-29b uttrykk (7,3 ganger) med eksponering av HCT 116 celler til HÅG. Det var også en økning i Mir-29b uttrykk med eksponering av to andre tykktarmskreft cellelinjer (DLD-1, 3,1 ganger, og Løvø, 1,5 ganger). (Figur 1)
HCT 116, DLD -1, og LoVo-celler ble eksponert for 260 ug /ml HAG i 24 timer (n = 3 per tidspunkt). Relative endogene MIR-29B uttrykk nivåer ble oppdaget av QRT-PCR bruker TaqMan primere og prober for å påvise moden Mir-29b og den lille kjernefysiske RNA RNU6B (U6), en intern kontroll. Relative MIR-29B-ekspresjonsnivåer ble normalisert til gjennomsnittsverdien av de ikke-behandlede prøver (0-t). * Indikerer signifikant forskjell (p-verdi 0,005). Fra 0 h kontroll
HAG Undertrykker MMP-2 Expression i tykktarm kreft celler
potensielt mål gener fra Mir-29b ble først beregnet med elektroniske databaser, herunder miRTarBase, TargetScan, PicTar, og Miranda. MMP-2 ble spådd til å bli den potensielle mål for Mir-29b ved alle disse databasene (Figur 2A). Fordi MMP-2 er overuttrykt i tumorvev [36], [37], [38], og har en direkte innblanding i metastase og angiogenese av kreftceller [39], [40], må vi først undersøkt effekten av HAG på MMP -2 uttrykk. Behandling av HCT-116 celler med HAG i 24 timer resulterte i reduksjon av MMP-2-genekspresjon ved omtrent halvparten folde [(1 ± 0,14 til 0,57 ± 0,05), p-verdi = 0,078] (figur 2B). HAG behandling i 24 timer, betydelig redusert ekspresjon av MMP-2-genet i DLD-1 celler [(1 ± 0,03 0,03 ± 0,01), p-verdi 0,005] (figur 2D). Tilsvarende behandling av LoVo-celler med HAG i 24 timer resulterte i reduksjon av MMP-2-ekspresjon [(1 ± 0,06 til 0,74 ± 0,017), p-verdi 0,05] (figur 2F). For å kontrollere om HAG reduserer MMP-2 aktivitet, ble HCT-116 celler behandlet med HAG for 24 timer og MMP-2 protein ble analysert. Figur S4, HAG redusert pro- og aktiv-MMP-2 protein uttrykk; bekrefter at HAG redusert MMP-2 aktivitet og genuttrykk. I tillegg andre ECM nedbrytende MMP’er slik som MMP-1, MMP-7 og MMP-9-gen-ekspresjon ble ikke regulert av HAG behandling (tabell S2). Interessant, disse MMP (MMP-1, -7 og -9) er ikke direkte mål for Mir-29b.
(A) MIR-29 familien (MIR-29a /b /c) og dets antatte bindende sekvens i den 3′-UTR av MMP-2-genet. Frøet sekvens av MIR-29 familien er vist i boksen. (B) HCT116 WT celler ble eksponert for 260 ug /ml HAG i 24 timer. (C) HCT116-celler transfektert med 10 nM av Mirvana MIR-29b, 48 timer og eksponert for 260 ug /ml HAG i 24 timer. (D) DLD-1 celler ble eksponert for 260 ug /ml HAG i 24 timer. (E) DLD-1-celler transfektert med 50 nM av Mirvana MIR-29b, 48 timer og eksponert for 260 ug /ml HAG i 24 timer. (F) LoVo-celler ble eksponert for 260 ug /ml HAG i 24 timer. (G) LoVo-celler transfektert med 50 nM av Mirvana MIR-29b, 48 timer og eksponert for 260 ug /ml HAG i 24 timer. Relativ MMP-2 ekspresjonsnivået ble påvist ved QRT-PCR. MMP-2 mRNA for hver prøve ble normalisert ved GAPDH-ekspresjon. Brett endring i MMP-2-mRNA-nivået var relativ av ikke-behandlede celler høstet ved 0 h (n = 3 per tidspunkt). Resultatene indikerer heksanfraksjon av AG hemmer MMP-2-mRNA-nivå i forhold til de ikke-behandlede celler. *, Indikerer signifikant forskjell, P-verdi. 0,05 fra 0 h kontroll
Videre, for å kontrollere om HAG mediert undertrykkelse av MMP-2-genet er avhengig av MIR-29b, forstummet vi speil 29b (figur S1) med en MIR-29b-hemmer (se metoder 4.2.5). HAG undertrykker ikke MMP-2 genuttrykk når Mir-29b er forstummet (Tall 2C, 2E og 2G). Faktisk er det en 2,4 ganger økning i uttrykk av MMP-2 i MIR-29B forstummet HCT116 cellene når de utsettes for HAG, 24 timer (figur 2C). Det var ingen reduksjon i MMP-2 genuttrykk i Mir-29b forstummet DLD-en og Løvø tykktarm kreft celler når de utsettes for HAG, 24 timer (figur 2E og 2G). Alle sammen, disse resultatene er i samsvar med hypotesen om at undertrykkelsen av MMP-2 av HAG er avhengig av Mir-29b.
HAG undertrykker Migrasjon av Colon kreft celler
MiR-29B mål nøkkel spillerne til å undertrykke invasjon og metastasering [19], [20], [21], [22]. MMP-2 er involvert i migrasjon av tykktarmskreftceller (Tabell S1, figur S2). Omtrent 3,5-fold reduksjon i antall celler migrert /mikroskopisk felt i HCT116-celler MMP-2 knock /ned-celler sammenlignet med de HCT116 WT-celler i nærvær av 10% serum som kjemotiltrekkende er angitt (tabell S1, figur S2). Dette er en klar indikasjon på at MMP-2 er en nøkkelfaktor i regulering av cellevandring, men det skal ikke utelukkes at andre ECM nedverdigende MMP som MMP-1, MMP-7, MMP-9 og MMP-13 har blitt vist være forbundet med Kolorektalkreft progresjon [37], [41], [42], [43], [44]. Siden HAG up-regulerer Mir-29b uttrykk og nedregulerer ECM nedverdigende enzymet MMP-2 genuttrykk, vi undersøkte den funksjonelle effekten av HAG på kreft celle migrasjon videre. I HCT116 cellene, HAG trykt migrering av kreftceller med nesten syv ganger (figur 3A og 3C). I MIR-29b forstummet HCT-116 celler, HAG ikke undertrykke migrasjon. I samsvar med MMP-2-resultater (figur 2C), i fravær av MIR-29b-aktivitet, HAG forhøyet antall celler som migrerer til det nedre kammer av transwell membran med nesten 2,5 ganger sammenlignet med positiv kontroll (figurene 3B og 3D). På samme måte undertrykket HAG migrering av DLD-1-celler bare i nærvær av MIR-29b, hvor det reduserte antall migrerende celler med nesten 5 ganger sammenlignet med den positive kontroll (figurene 4A og 4C). HAG ikke utøve anti-trekkfugl aktivitet når Mir-29b ble stille i DLD-1 celler (figur 4B og 4D). Samlet sett resultatene her viser Mir-29b er ved et veiskille i evnen til HAG å utøve anti-trekkende aktiviteter.
kollagen type-I (15 mikrogram /ml) belagt transwell kammer ble påført med 5 × 10
4 HCT116-celler (A /B) i 12 timer. Det nedre kammer inneholder SFM /serum (10%) eller HAG (260 ug /ml i komplett medium). (A) 5 x 10
4 HCT116 WT-celler ble anvendt på det øvre kammer av transwell membranen. (B) 5 x 10
4 HCT116 (transfektert med Mirvana MIR-29b, 10 nM, 48 h) celler ble anvendt på det øvre kammer av transwell membran. Etter 12 timers inkubering ved 37 ° C, cellene flyttet til innsiden (den nedre membran) av transwell membranen ble telt ved bruk av ImageJ programvare (7 tilfeldige mikroskopiske felt (100X) ble evaluert for celletelling). (C) viser representativt bilde av HCT116 WT celle migrasjon fra hver behandling. (D) viser representativt bilde av HCT116 (transfektert med Mirvana Mir-29b, 10 nM, 48 h) cellemigrasjon fra hver behandling. Bakgrunnen i bildet viser 8 mikrometer pore i transwell membran. * Angir signifikante forskjeller (p-verdi 0,005) sammenlignet med SFM. # Indikerer signifikant forskjell (p-verdi 0,005). Sammenlignet med 10% serum
kollagen type-I (15 mg /ml) belagt transwell kammer ble påført med 5 x 10
4 DLD-1 celler (A /B) i 12 timer. Det nedre kammer inneholder SFM /serum (10%) eller HAG (260 ug /ml i komplett medium). (A) 5 x 10
4 DLD-1 WT-celler ble anvendt på det øvre kammer av transwell membranen. (B) 5 x 10
4 DLD-1 (transfektert med Mirvana MIR-29b, 10 nM, 48 h) celler ble anvendt på det øvre kammer av transwell membran. Etter 12 timers inkubering ved 37 ° C, cellene flyttet til innsiden (den nedre membran) av transwell membranen ble telt ved bruk av ImageJ programvare (7 tilfeldige mikroskopiske felt (100X) ble evaluert for celletelling). (C) viser representativt bilde av DLD-en WT cellemigrasjon fra hver behandling. (D) viser representativt bilde av DLD-en (transfektert med Mirvana Mir-29b, 10 nM, 48h) cellemigrasjon fra hver behandling. Bakgrunnen i bildet viser 8 mikrometer pore i transwell membran. * Indikerer signifikant forskjell (p-verdi 0,005) sammenlignet med SFM
Diskusjoner
Her har vi vist at HAG undertrykker migrasjon av tykktarmskreftcelle.. Denne anti-metastatisk eiendom HAG er mediert av oppregulering av mikroRNA-29b, som direkte retter seg mot og nedregulerer en nøkkelmolekyl involvert i metastase, MMP-2
Globalt MIR analyse av HAG -. Behandlet HCT116 cellene resulterte i forhøyet uttrykk av Mir-29b som matchet både trend og fold-endre statistisk analyse (tabell 1 og 2). Det var 8 mirnas (HSA-MIR-938, HSA-MIR-203, HSA-MIR-1975, HSA-MIR-29B, HSA-MIR-600, HSA-MIR-1244, HSA-MIR-548o og HSA-MIR -590-5p) som var statistisk (p 0,05) opp eller ned-regulert. En positiv korrelasjonskoeffisient indikert økte nivåer av Mir med økt eksponering for HAG (0 h til 12 h til 24 h) med bare 2 Mirs (HSA-Mir-29B og HSA-MIR-590-5p) faller i denne kategorien. Av disse 2 Mirs, Mir-29b hadde høyest korrelasjonskoeffisient verdi av 0,621. I tillegg, siden Mir-29b var også statistisk signifikant oppregulert ved HAG i folden endringsanalyse (tabell 2), og at dette Mir har blitt vist av andre til å spille en tumor suppressor rolle [23], [33], [ ,,,0],45], [46], [47], fokuserte vi på Mir-29b for denne studien. Rollen MIR-29b som en tumor suppressor har blitt godt belyst i flere maligniteter inkludert, AML [23], [45], lunge [33], CLL [46], [47] og kolangiokarsinom [48]. Nedregulering av Mir-29-familien har blitt rapportert i flere humane kreftformer inkludert lunge [49], prostata [50], invasiv brystkreft [51]. Nylig, Kuo et’al har rapportert et lavere uttrykk nivå av MIR-29a /c i en kolorektal kreft tidlig tilbakefall sammenlignet med gruppen som av en ikke-tidlig tilbakefall gruppe som indikerer lavt nivå uttrykk for MIR-29a /c som en potensiell biomarkør for tidlig tilbakefall av CRC [52]. Våre resultater er bedre belyst mulige mekanismer for dette funnet
Mir-29-familien består av tre medlemmer:. MIR-29A, MIR-29B, og MIR-29C (miR29a /b /c) som viser høy sekvenslikhet og deler en felles frø sekvens for target gjenkjenning (Figur 2A). Andre har rapportert et omvendt forhold vedrørende uttrykk for MIR-29b og MMP-2 [20], [22], [53], [54]. I tillegg, fordi MIR databaser (miRTarBase, TargetScan, PicTar, og Miranda) indikerer MMP-2 som et potensielt mål av MIR-29b, undersøkte vi den funksjonelle betydningen av dette. MMP-2, også kjent som gelatinase A eller type IV kollagenase, er en ECM-nedbrytende enzym, og er mye uttrykkes i de fleste vev og celler [55]. I tillegg er MMP-2 overexpressed i tumorvev [36], [37], [38] og aktivering av MMP-2 resultater i ECM degradering, noe som forenkler invasjon og metastasering av tumorceller [56]. Våre sanntids RT-PCR data viste at HAG reduserer MMP-2 uttrykk ved to ganger i HCT116 cellene og til ca 30 ganger reduksjon i DLD-1 celler (figur 2C og 2E). HAG også redusert MMP-2 protein uttrykk (figur S4). Når MIR-29b aktivitet er brakt til taushet ved trans tykktarm kreft celler med en Mirvana Mir-29b inhibitor (figur S1), har HÅG ingen effekt på reduksjon av MMP-2 uttrykk (Tall 2C, 2E og 2G) og til en viss grad indusert MMP -2 uttrykk. Årsaken kan være på grunn av fravær av endogen MIR-29b, HAG var ikke i stand til å regulere Mir-29b som ytterligere forbedret MMP-2 sekresjon. Noen av komponentene i HAG, kan ha potensial for å forbedre MMP-2 uttrykk direkte i fravær av endogen MIR-29b, men dette trenger videre studier for å bli bekreftet. Derfor en kraftig isolasjon prosess med aktive komponenter i HÅG er i gang og fremtidige studier om dette er i tråd. Alle sammen, våre data tyder på at Mir-29b er avgjørende for HAG å undertrykke MMP-2 uttrykk i kreftceller.
Matrix metalloproteinaser har vært ansett som viktige molekyler bistå kreftceller i løpet av metastase [57], [58 ], [59], [60]. De MMP’er er en familie av sink-holdige endopeptidaser best kjent for sine roller i fysiologisk og patologisk ombygging av ECM under angiogenese, sårheling, embryogenese, tumormetastase, og forskjellige kardiovaskulære og inflammatoriske sykdommer [61], [62]. Det er blitt vist at MIR-29b er involvert i den negative regulering av metastaser i mange krefttyper [18], [20], [63]. Ved å kombinere disse funnene, hvor Mir-29b er en negativ regulator av metastaser og mål sentral aktør for metastase MMP-2, og HAG induserer Mir-29b og undertrykker MMP-2 uttrykk (tabell 1 og 2, figur 1, 2 og S4), vi stilte spørsmålet om HAG funksjonelt undertrykker metastasering av tykktarmskreftceller. Vi viste at HAG funksjonelt undertrykker
in vitro
metastaser av tykktarmskreftceller ved å utføre migrasjon analysen av tykktarmskreftceller (figur 3A, 3C, 4A, og 4C). I fravær av MIR-29b aktivitet, HAG var ikke effektiv i å undertrykke migrasjon av tykktarmskreftceller (Tall 3B, 3D, 4B og 4D). Selv om, men å bli vist
in vivo
, alle sammen, våre
in vitro
data indikerer at HAG utfører sin anti-metastatisk aktivitet ved å regulere Mir-29b.
Major komponenter som er tilstede i heksan ekstrakt (lipofilt ekstrakt) av AG er polyacetylener (Panaxydiol, panaxydol og panaxynol), som omfatter omtrent 50% av den totale ekstrakt, samt fettsyrer, med nesten ingen ginsenosider [24]. Vi har nylig vist at HAG besitter anti-inflammatorisk og anti-kreft egenskaper [24]. Flere andre studier på anti-inflammatorisk og anti-kreft egenskaper hos American ginseng har fokusert på ginsenoside eller saponin innhold av ginseng [64], [65], [66], [67], som er hentet fra en vandig etanolekstrakt (polart løsningsmiddel) av ginseng.
