Abstract
Det er velkjent at mange pasienter fortsetter å røyke sigaretter etter å ha blitt diagnostisert med kreft. Selv om røykeslutt har typisk vært antatt å ha litt terapeutisk verdi for kreft, en økende mengde bevis tyder på at fortsatt røyking er assosiert med redusert effekt av behandling og en høyere forekomst av tilbakefall. Vi undersøkte derfor effekten av sigarettrøyk kondensat (CSC) på legemiddelresistens i lungecancer og hode- og halskreft cellelinjer A549 og UMSCC-10B, respektivt. Våre resultater viste at CSC betydelig økt cellulær effluks av doksorubicin og mitoksantron. Dette ble fulgt av membran lokalisering og økt ekspresjon av multimedikament transportør ABCG2. Den induserte effluks av doksorubicin ble reversert ved tilsetning av det spesifikke ABCG2 inhibitor Fumitremorgin C, noe som bekrefter rollen til ABCG2. Behandling med CSC økte konsentrasjonen av fosforylert Akt, mens tilsetning av PI3K-inhibitor LY294002 blokkert doxorubicin ekstrudering, noe som tyder på at Akt aktivering er nødvendig for CSC-indusert medikament effluks. I tillegg ble CSC funnet å fremme resistens mot doksorubicin som bestemt ved MTS-analyser. Dette CSC-indusert doxurbicin resistens ble dempet av mekamylamin, et nikotin-acetylcholin reseptor inhibitor, noe som tyder på at nikotin er i det minste delvis ansvarlig for effekten av CSC. Til slutt, økte CSC størrelsen på side populasjonen (SP), som har vært knyttet til en kreft stamcelle-lignende fenotype. I sammendrag, fremmer CSC chemoresistance via Akt-medierte regulering av ABCG2 aktivitet, og kan også øke andelen av kreft stilk-lignende celler, bidrar til tumor elastisitet. Disse funnene understreker viktigheten av røykeslutt etter en diagnose av kreft, og belyse mekanismene for fortsatte å røyke som kan være skadelig for behandling
Citation:. En Y, Kiang A, Lopez JP, Kuo SZ, Yu MA , Abhold EL, et al. (2012) sigarettrøyk Fremmer Drug Resistance og Utvidelse av Cancer Stem Cell-Like Side Befolkning. PLoS ONE 7 (11): e47919. doi: 10,1371 /journal.pone.0047919
Redaktør: Alfons Navarro, Universitetet i Barcelona, Spania
mottatt: 17 april 2011; Godkjent: 24 september 2012; Publisert: 05.11.2012
Copyright: © 2012 An et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av det amerikanske forsvarsdepartementet (CDMRP) WO og NCI /NIH fem U01 CA114810-03 til JWR. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Sigarettrøyking er den største risikofaktoren for hode og hals plateepitelkarsinom (HNSCC) og ikke-småcellet lungekreft (NSCLC), vanlige kreftformer som sammen påvirker mer enn 150 000 nye pasienter i USA hvert år [1 ]. Kjemisk analyse viser at blant de ~4800 forbindelser som finnes i sigarettrøyk kondensat (CSC), ca 100 oppviser mutagen aktivitet [2]. Rikelig innenfor CSC er N-nitrosaminer, som for eksempel 4- (methylnitrosamino) -1- (3-pyridyl) -1-butanon (NKK), og polyaromatiske hydrokarboner, som benzo [α] pyren (B [α] P), noe som fører til dannelse av DNA-addukter. Alle er antatt å være viktige faktorer i røyking-indusert karsinom [3]. CSC-induserte mutasjoner i kritiske tumor-suppressor gener
p53 og p16
resultat i tumorigenesis [4]. Biokjemiske studier har også vist at CSC kan aktivere pro-inflammatoriske proteiner NF-kB, sammen med proto-onkogener så som ERK1 /2, EGFR og Akt [5], [6], [7], [8].
til tross for slike effekter av sigarettrøyk, er det en mangel på vekt på røykeslutt under kreftbehandling, på grunn av den overveiende syn at behandling av tobakksavhengighet har liten eller ingen effekt på behandlingsresultat. Imidlertid tyder pågående forskning som fortsatt røyking etter en diagnose kan begrense effekten av behandlingen og øke risikoen for dødelighet i enkelte kreftformer. Det ble nylig vist at røyking under strålebehandling ble assosiert med ugunstige utfall i hode- og halskreft [9]. I tillegg fortsatte å røyke under behandling av lungekreft fører til en høyere forekomst av tilbakefall, og er forbundet med en betydelig større risiko for total mortalitet [10], [11], [12]. Røykeslutt etter en vellykket behandling av lungekreft var også assosiert med lavere forekomst av andre primære kreft [12].
Vi spekulert i at sigarettrøyk har en direkte rolle i å fremme chemoresistance, noe som resulterer i forverrede behandlingsresultatene. I tillegg kan høyere forekomst av anfall forbundet med fortsatt røyking være en indikasjon på cancer stamcelle-aktivitet. Vi slått derfor vår oppmerksomhet til ATP-bindende kassett transportør ABCG2 /BCRP1, som spiller en viktig rolle i legemiddelresistens og har vært brukt i noen vev som en stamcelle markør. ABCG2 gir resistens mot flere cytotoksiske legemidler, inkludert topetcan, Bisantren, mitoxantrone, og doxorubicin, den siste som er vanligvis brukes til å behandle både HNSCC og NSCLC [13], [14]. ABCG2 uttrykk er konservert blant stamceller fra et bredt utvalg av opprinnelse, og er også den molekylære determinant av side befolkningen, celler som viser økt utstrømning av Hoechst 33342 DNA-bindende fargestoff [15]. Det er blitt vist at ekspresjonen av ABCG2 i kombinasjon med CD133 forut tilbakefall i trinn 1 NSCLC [16]. I esophageal plateepitelkarsinom, ble ABCG2 uttrykk alene forbundet med ugunstige prognoser [17].
Koblingen mellom fortsatt røyking og chemoresistance er uklart. Nikotin-indusert oppregulering av survivin og XIAP kan beskytte cellene mot kjemoterapi-indusert død [18], men det er ukjent om sigarettrøyk kan fremme chemoresistance ved å modulere narkotika transportøraktivitet. Derfor, søkte vi å bestemme hvorvidt behandling med CSC aktiverte celler
in vitro
for å øke ABCG2 ekspresjon og aktivitet, og hvorvidt denne endringen fører til økt cellelevedyktighet i nærvær av doksorubicin. Vi undersøkte også om CSC kunne ekspandere side befolkningen, som har vist seg å ha kreft stamcellelignende kvaliteter [19]. Resultatene av denne studien vil bidra til belyse rollen som tobakksbruk i kreft progresjon, noe som fører til mer effektiv behandling og håndtering av røykerelaterte karsinomer.
Materialer og metoder
Antistoffer og kjemikalier
monoklonalt antistoff fra mus mot ABCG2 ble kjøpt fra Chemicon International (Temecula, California). ß-Actin monoklonalt antistoff fra mus ble erholdt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Rabbit p-Akt og mus Akt antistoffer var fra Cell Signaling (Beverly, MA). PI3K inhibitor LY294002 ble kjøpt fra Calbiochem (San Diego, California). Doksorubicin er innhentet fra Ortho Biotech (Bridgewater, NJ) og sigarettrøyk kondensat ble hentet fra Murty Pharmaceuticals (Lexington, KY).
Cellelinjer og cellekultur
Den menneskelige hode og hals plateepitelkarsinom karsinom cellelinje, UMSCC10B ble vennlig levert av Dr. Thomas E. Carey (University of Michigan). Også ble anvendt var den ikke-småcellet lungekreft cellelinje A549, initiert av Giard et al [20]. Disse cellelinjene ble dyrket og opprettholdt i DMEM supplert med 10% føtalt bovint serum og 1% penicillin streptomycin.
Doxorubicin Behandling
En endelig doxorubicin konsentrasjon på 2,5 ug /ml ble anvendt i denne studien . Celler ble inkubert med doksorubicin i 1 time ved 37 C med rysting hver 15-20 minutter. Deretter ekstruderte prøver ble plassert i DMEM supplert med 2% BSA i 3 timer ved 37degrees, igjen ristet hvert 15-20 minutter. Ingen utpressings prøvene ble plassert i Hanks buffer og plassert på is i løpet av varigheten av ekstrudering.
flowcytometrisystemer Analyse av doxorubicin effluks.
Flowcytometrisk analyse av doxorubicin utstrømming ble utført som i en tidligere studie [21]. Celler ble inkubert med doksorubicin i Dulbeccos modifiserte Eagles medium inneholdende 2% kalvefosterserum (FCS). Deretter ble cellene vasket med Hanks balanserte saltoppløsning og resuspendert i doksorubicin fritt kulturmedium. Cellene ble deretter tillatt å ekstrudere medikamentet i 2,5 timer ved 37 C, bortsett fra for noen press kontroller som ble holdt på is før analyse ved strømningscytometri. Døde celler ble ekskludert ved samtidig farging med PI. Både Hoechst farging og doksorubicin-utstrømning ble analysert ved anvendelse av en fluorescens-aktivert cellesorterer (FACSvantage SE, BD Biosciences, San Jose, CA) med Cellquest (Largo, FL) programvare. Den prosentvise forskjellen i doxorubicin utstrømming ble calcualted med følgende formel:% endring = [(CSC
nei extrusion- CSC
ekstrudering) – (kontroll
ingen extrusion- kontroll
ekstrudering)] /(kontroll
nei extrusion- kontroll
ekstrudering) * 100. doxorubicin utstrømming er definert til å være omvendt relatert til cellullar fluorescens målt ved FACS.
Western blot analyse
15 mikrogram /ml eller 30 pg /ml CSC ble tilsatt til cellene 24 timer før lysering. Celler ble lysert på is i 10 minutter med buffer (0,1 M Tris, 2% SDS, 20% glycerol, og protease-inhibitor tabletter fra Roche Diagnostics, Indianapolis, IN). Elektroforese ved anvendelse av 10% NuPage Bis-Tris gel separerte proteiner (20 ng per brønn), som deretter ble overført til PVDF-membran. Membranen ble blokkert i en time og inkubert over natten i primært antistoff fortynnet 1:100 i blokkeringsløsning. Etter tilsetning av geit sekundært antistoff mot mus antistoff (1:1000 fortynning i blokkering løsning), ble spesifikke proteiner visualisert ved hjelp SuperSignal West Pico Luminol (Pierce, Rockford, IL). Band intensiteter ble kvantifisert ved densitometri hjelp av open-source programvare ImageJ (http: //rsbweb.nih.govi/ij/) ved hjelp av en metode skissert https://lukemiller.org/index.php/2010/11/analyzing- gels-og-vestlige-blotter-med-image-j /.
MTS celleviabilitet analysen
MTS analysen ble utført ved hjelp av CellTiter 96 vandig ikke-radioaktive celleproliferasjon analysen (Promega, Madison , WI) etter produsentens anvisninger. I korthet ble cellene trypsinisert og utplatet i 100 ul normal medium eller CSC (15 ug /ml) medium i en 96-brønners format. Etter 24 timers inkubering i 37 ° C og 5% CO
2, ble doksorubicin tilsatt til brønnene, etterfulgt av ytterligere 48 timers inkubering. Deretter ble 20 ul av MTS-reagens tilsatt til hver brønn, etterfulgt av en 4-timers inkubasjonsperiode. En plateavleser ble deretter brukt til å registrere absorbansen ved 490 nm.
Immunofluorescence
CSC ble tilsatt til cellene 24 før fiksering. Cellene ble vasket ønske PBS og deretter fiksert i 4% paraformaldehyd. 10% normalt geiteserum ble anvendt som blokkeringsmiddel. Primært antistoff (fortynnet 1:100) ble deretter applisert over natten i et fuktet kammer. Sekundære antistoffer (fortynnet 1:1000) Alexa Fluor 488 fra Molecular Probes (Carlsbad, CA) eller geite-anti-muse-IgG fra Chemicon International (Temecula, CA) ble deretter tilsatt for å farge cellene. Prøvene ble vasket i rekkefølge med PBS, H
2o, og etanol. Fargede celler ble montert og visualisert ved hjelp konfokalmikroskopi.
flowcytometrisystemer Analysis for Hoechst utstrømning (Side Befolkning analyse)
Celler ble farget med 5 mikrogram /ml Hoechst 33342 (Sigma) i 4 ml av Dulbeccos modifiserte Eagles medium inneholdende 2% bovint serumalbumin (BSA) ved 37 ° C i 90 min. Etter inkubering ble cellene vasket med Hanks «balanserte saltløsning og ytterligere inkubert i 15 ug /ml eller 30 pg /ml CSC i 24 timer. I tillegg ble 2 ug /ml propidiumjodid (PI) tilsatt for død celle diskriminering. Hoechst efflux ble analysert ved anvendelse av en fluorescens-aktivert cellesorterer (FACSvantage SE, BD Biosciences, San Jose, CA) med Cellquest (Largo, FL) programvare. Arealet av side populasjonen ble bestemt ved anvendelse av en separat prøve (ikke vist) hvor Hoecsht utstrømning i ikke CSC-behandlede celler ble blokkert av medikamentet verapamil. Området i hvilket cellene ble tapt ved behandling med verapamil ble definert som det område som inneholdt den antatte side befolkning, og ble holdt konstant for alle de tre prøver (kontroll, 15 ug /ml, 30 pg /ml).
Resultater
CSC behandling øker doxorubicin utstrømming via ABCG2
for å avgjøre om CSC behandling kan regulere narkotika transportøraktivitet, må vi først målte endringene i doxorubicin ekstrudering observert ved tilsetning av CSC. Dosene av CSC (15 ug /ml, 30 pg /ml) ble valgt på grunnlag av doser som er brukt i tidligere studier [22], [23], [24]. Intracellulære doksorubicin-nivåer ble bestemt ved hjelp av strømningscytometri å måle stoffets fluorescens i individuelle celler. En optimal ekstrudering tidsrom (2,5 timer) ble valgt for å balansere effekten av cytotoksisitet mot detekterbare endringer i doksorubicin effluks. For å ta hensyn til bakgrunnsfluorescens forårsaket av CSC, forskjeller i median fluorescens mellom et pressprøve (holdt ved 37 ° C) og ikke noe ekstrudering prøve (holdes på is), ble sammenlignet i stedet for absolutte fluorescens nivåer. Resultatene indikerte at CSC øket doksorubicin utstrømning på en doseavhengig måte (figur 1a, b). En spesifikk inhibitor for ABCG2 transportaktivitet, Fumitremorgin C (FTC), ble introdusert til celler som skal undersøkes av doxorubicin utstrømming analysen. Tilsetting av FTC reverseres effekten av CSC, noe som tyder på at ABCG2 er transportøren ansvarlig for CSC-indusert doxorubicin utstrømming. Dataene presentert i denne figur er representative for minst to uavhengige forsøk.
(A) 15 og 30 ug /mL sigarettrøyk kondensat (CSC) øker doxorubicin utstrømning i begge cellelinjene 10B og A549 i en dose avhengig mønster. Den spesifikke ABCG2 inhibitor fumitremorgin C (FTC) er i stand til å reversere CSC-mediert økning i doksorubicin effluks. Prosentvis endring ble avledet fra flowcytometrisk analyse av median intracellulære doxorubicin nivåer og beregnes med formelen beskrevet i metodedelen. (B) CSC øker doxorubicin utstrømming doseavhengig. Relativ utstrømming måles ved å sammenligne forskjeller i median doxorubicin fluorescens kanaler av ekstrudering og ingen pressprøver. Numerisk etikett reflektere median kanal av doksorubicin fluorescens som måles i en prøve av strømningscytometrisk analyse av intracellulære doxorubicin-nivåer i 10B. Selv absolutte fluorescens nivåer i de behandlede prøvene er høyere på grunn av fluorescens av CSC, nedgangen fra ingen ekstrudering til ekstrudering er større for disse prøvene sammenlignet med kontroll.
CSC induserer membran lokalisering og uttrykk for ABCG2
Bare ABCG2 lokalisert i plasmamembranen er i stand til utstrømming doxorubicin. For å kontrollere at CSC fremmer legemiddelresistens ved å regulere ABCG2 aktivitet, ble en immunfluorescens eksperiment utført for å bestemme effekten av CSC på ABCG2 lokalisering. Fotografier som sammenligner kontrollceller til CSC-behandlede celler viste at CSC økte plasmamembran konsentrasjoner av ABCG2 (figur 2a). Interessant, cytoplasmatiske protein nivåer av ABCG2 var ikke synlig lavere følgende trans, noe som tyder på at CSC kanskje også oppregulerer totale nivåer av ABCG2. Faktisk, western blotting av hel-celle-lysat viste at CSC også øket den totale ekspresjon av ABCG2 på en doseavhengig måte (figur 2b). ABCG2 ekspresjon var lavere i den høyeste dose, mest sannsynlig som et resultat av CSC cytotoksisitet. Immunfluorescens analyser ble også gjentatt med ikke-permeabiliserte celler for ytterligere å visualisere translokasjon av ABCG2, siden bare proteiner på celleoverflaten vil bli farget i dette tilfellet. I samsvar med vår hypotese, ABCG2 farging var knapt synlig i ikke-permeabiliserte kontrollceller, men var tydelig til stede på overflaten av CSC-behandlede celler (figur 3). Bildene som vises er representative for minst to uavhengige forsøk.
(A) immunfluorescens mikros identifiserer cellulær lokalisering av ABCG2 med og uten CSC. Resultatene indikerer at CSC eksponering induserer translokasjon av ABCG2 til plasmamembranen i 10B og A549. (B) Western blot-analyse viser en doseavhengig økning i ABCG2 ekspresjon som reaksjon på behandling CSC.
Immunofluorescens ble gjentatt på ikke-permeabiliserte celler for å vise økningen i membran konsentrasjoner av ABCG2. Resultatene indikerer svak farging av ABCG2 på overflaten av ikke-behandlede celler, mens mye sterkere farging ble observert på overflaten av CSC behandlede celler.
CSC-indusert doxorubicin effluks og ABCG2 trans blir mediert av PI3K /Akt signaliserer
Vi har tidligere vist at Akt regulerer funksjonen av ABCG2 i HSNCC [25]. Vi har derfor en hypotese om at CSC var fremme doxorubicin utstrømning gjennom aktivering av Akt. For å teste denne hypotese, vi re-analyserte frekvensen av doksorubicin dyseutstrømningen i nærvær av PI3K inhibitor LY294002. Tilsetningen av LY reversert CSC-induserte økning i doksorubicin utstrømning (figur 4a). Western blot analyse viste at CSC økte nivåene av fosfo-Akt doseavhengig (figur 4b). Som forventet, tilsetning av PI3K-inhibitor LY294002 blokkert CSC-indusert aktivering av Akt (figur 4c). Interessant, behandling med LY alene var ikke signifikant redusere nivåene av ABCG2 i forhold til kontroll (figur 4c). Sammen utgjør disse resultatene viser at PI3K /Akt er en av de viktigste mekanismene som er involvert i reguleringen av ABCG2 funksjon, men kan ikke være kritisk involvert i moduler ABCG2 uttrykk.
(A) PI3K inhibitor LY294002 (LY) reduseres doxorubicin utstrømning i cellelinjene 10B og A549. Verdiene er hentet fra flowcytometrisk analyse av intraceulluar doxorubicin nivåer, og er beregnet i forhold til ikke-LY behandlet kontroller. (B) Western blot-analyse som viser endringen i nivået av fosfo-Akt og Akt med økende dosering av CSC. (C) Western blot analyse som viser reversering av Akt aktivering ved behandling med LY, og uttrykk for ABCG2 i nærvær av LY.
CSC behandling øker mitoxantrone utstrømming
Hvis CSC -mediert doxorubicin motstand definitivt involvert ABCG2, så CSC bør også være i stand til å beskytte mot andre ABCG2 underlag. Derfor ble det undersøkt hvorvidt CSC kan også øke den cellulære effluks av mitoxantron, et substrat av ABCG2 [26]. I samsvar med vår foreslåtte mekanismen, CSC økt betydelig den cellulære utstrømming av mitoxantrone, bekrefter involvering av ABCG2 (figur 5).
flowcytometrisk analyse av intracellulære mitoksantron nivåer avdekket betydelig høyere forekomst av ekstrudering i CSC-behandlede celler. Verdier som er oppgitt er de prosentvise forskjeller sammenlignet med ikke-behandlede prøver.
CSC behandling fremmer celle levedyktighet under doksorubicin eksponering
Selv om CSC klart induserer større legemiddelutstrømningen, vi spurte om dette oversettes til en påvisbar endring i legemiddelresistens. En MTS-assay som måler andelen av levedyktige celler, ble utført for å sammenligne overlevelseskurver mellom kontrollcellene og CSC-behandlede celler i nærvær av økende konsentrasjon doksorubicin (figur 6). For å ta hensyn til forskjeller i celleformering ble alle absorbanser verdier i en prøve dividert med absorbansen av de respektive 0 pM doxorubicin kontroller. Resultatene viste at en betydelig høyere andel av CSC-behandlede cellene forble levedyktig sammenlignet med ikke-behandlede celler, noe som tyder på at CSC slutt beskytter cellene mot doxorubicin-indusert død. Figur 6 viser representative eksperimenter utført in triplo.
MTS cellelevedyktighet analyser teste levedyktigheten til kontroll vs. CSC-behandlede 10B og A549-celler i nærvær av doksorubicin. Absorbans (Y-aksen) verdier ble normalisert ved å dividere over absorbansen av 0 pM doksorubicin prøver. Resultatene indikerer at CSC har en beskyttende effekt mot doxorubicin-indusert celledød. Feilfelt representerer SEM.
CSC behandling øker side befolkningen
Side befolkningen (SP) celler er definert som celler som viser høyere utstrømming av Hoechst 33342 fargestoff, et spesifikt substrat for ABCG2 , i forhold til hovedpopulasjonen. Vi testet om CSC kan øke størrelsen av SP i 10B-celler. Faktisk, en Hoechst-ekstrudering analyse viste at størrelsen på SP var større i CSC-behandlede celler sammenlignet med ikke-behandlede celler (figur 7). I nærvær av verapamil, ble økningen i SP delvis opphevet, noe som tyder på at ABCG2 er i det minste delvis ansvarlig for økningen i side populasjonen, selv om det fortsatt er mulig at andre legemiddel pumper kan spille en rolle i CSC-indusert side befolkning. Disse resultatene bekrefter involvering av ABCG2 i CSC-indusert medikamentresistens og foreslår muligheten for at CSC kunne regulere kreft stamcelleegenskaper, siden SP-celler har vist seg å være mye mer kjemoresistent og tumorigen enn ikke-SP-celler [15], [19 ], [27].
FACS-baserte Hoechst ekstrudering analysen viser størrelsen av side populasjon (SP) i 10B celler inkubert med to doser av CSC. Størrelsen på SP øker med økende dosering av CSC. Celler ble inkubert i 5 ug /ml av Hoechst i 90 minutter og deretter i DMEM w /CSC eller normalt DMEM i 24 timer.
Nikotin behandling fremmer celle-levedyktighet i løpet av doksorubicin eksponering
fordi sigarettrøyk kondensat er en blanding av en myriade av forbindelser, ville det være nyttig å bestemme den spesifikke forbindelse innenfor CSC som kan være ansvarlig for å fremme medikamentresistens. Vi har derfor som mål å fastslå om nikotin, en spesifikk komponent av CSC, kan være ansvarlig for CSC-indusert medikamentresistens. En MTS-analyse ble utført for å sammenligne overlevelseskurver mellom kontrollceller og 10 uM nikotin-behandlede celler i nærvær av økende konsentrasjon doksorubicin (figur 8a). Resultatene av dette forsøket viste at nikotin gitt en betydelig fordel i cellenes levedyktighet i løpet av eksponering for doksorubicin. For å bekrefte at nikotin er viktig i CSC-indusert medikamentresistens, ble en MTS-analyse utføres for å bestemme hvorvidt mekamylamin, en ikke-selektiv nikotin acetylkolin reseptor inhibitor, kunne reversere stoff-beskyttende effekt av CSC. Resultatene viste en overlevelsesfordel i CSC-behandlede celler som ble dempet ved behandling med 1 uM mekamylamin (figur 8b).
(A) MTS proliferasjonsanalyse å teste levedyktigheten til kontroll vs. nikotin-behandlede celler i nærvær av doxorubicin. Absorbans (Y-aksen) verdier ble normalisert ved å dividere over absorbansen av 0 pM doksorubicin prøver. (B) MTS levedyktighet analyser som viser reversering av CSC-indusert doxorubicin motstand ved nAChR inhibitor mekamylamin. Tatt sammen indikerer disse resultater at nikotin er i det minste delvis ansvarlig for den beskyttende effekten av CSC mot doksorubicin-indusert celledød. Feilfelt representerer SEM.
Diskusjoner
Selv om tidligere studier har vist at CSC har potensial til å fremme chemoresistance [18], [28], [29], identifisere virkningsmekanismen handling er fortsatt et viktig funn. Våre data støtter en modell, karakterisert ved at CSC aktiverer Akt å indusere translokasjon av ABCG2 til plasmamembranen, for derved å øke medikament ekstrudering og chemoresistance. Vi har også observert at CSC er i stand til å indusere ekspresjon av ABCG2 i tillegg til å regulere translokasjon. Interessant, ved den høyeste dose på CSC (30 uM) ble ABCG2 uttrykk senket kanskje på grunn av cytotoksisitet, selv om doksorubicin efflux holdt seg høy. Dette tyder på at ABCG2 trans alene er mer enn nok å gjøre rede for CSC-indusert doxorubicin utstrømning.
Mens involvering av Akt i ABCG2 trans er godt støttet av våre data og av andres arbeid [30], [31], er det uklart om CSC-indusert uttrykk for ABCG2 er også formidlet av Akt. Våre vestlige blot data (Figur 4C) synes å antyde at CSC kan regulere uttrykket av ABCG2 uavhengig av PI3K /Akt signalering. Dette stemmer overens med observasjoner av Bleau et al, som fant at Akt regulerer funksjonen (dvs. trans) av ABCG2, men ikke dets ekspresjon [32]. En fersk studie viste at aryl hydrokarbon reseptor (Ahr) er en direkte transkripsjonen aktivator av ABCG2 i brystkreft [33]. Benzo [α] pyren (B [a] P), en av de viktigste kreftfremkallende i sigarettrøyk, er en potent aktivator for Ahr [34]. Således er det sannsynlig at B [a] P binder til Ahr, som så aktiverer transkripsjonen av ABCG2 og står for den observerte økningen i ABCG2 protein. En annen mulighet er at CSC virker gjennom mikroRNA regulering for å øke ABCG2 protein nivåer. CSC har vist seg å modulere ekspresjon av en rekke microRNAs [35], [36]. Det er mulig at MIR-519c, som har vist seg å undertrykke oversettelsen av ABCG2 [37], er inkludert blant de microRNAs som blir nedregulert ved eksponering for CSC. Selv om disse teoriene har ennå ikke bekreftet av videre arbeid, hva som er klart er at ABCG2 er en viktig del av CSC-indusert chemoresistance, noe som gjør det en potensiell terapeutisk mål for røyking-indusert kreft. Behandlinger kombinere administreringen av ABCG2 inhibitorer og konvensjonell kjemoterapi kan vise seg å være effektiv i å utrydde både i bulk og kjemoresistent populasjoner av en tumor, for derved å redusere sannsynligheten for tilbakefall.
Vi observerte at CSC har evnen til å utvide den side populasjonen . Ved definisjon cellene i en populasjon som viser høyere utstrømning av DNA-bindende fargestoff Hoechst 33342 via ABCG2 utgjør SP. I flere kreftformer disse cellene har blitt observert å være mer kreft stamcelle-lignende av natur, dvs. at de er mer tumorigen enn ikke-SP-celler. I teorien, kreft stamceller er ansvarlige for tilbakevendende sykdom på grunn av deres evne til å overleve kjemoterapi og deretter repetere den opprinnelige tumor gjennom selvfornyelse og differensiering. Observasjonen om at SP-celler viser høyere utstrømning av DNA-bindende fargestoff og oppviser stamcelle-lignende oppførsel er i overensstemmelse med ideen om at kreften stamceller bør utgjøre den kjemoresistent populasjonen i løpet av en svulst. Det har også vært som tyder på at kreftstamceller er ansvarlige for invasjon og metastasering. Dermed kunne CSC-indusert utvidelse av SP tjene som bevis for en potensielt ny paradigme som sigarettrøyk induserer kreft ved å fremme en kreftstamcelle fenotype innenfor eksisterende kreftceller. Til å begynne med, disse cellene er godartede og sterkt differensiert, men oppnå en ondartet, udifferensiert «cancer stamcelle» fenotype ved vedvarende eksponering for sigarettrøyk. . Videre etterforskning i denne modellen vil gi kritisk forståelse av hvordan røyking initierer kreft
Selv om noen effekter av CSC garanterer videre etterforskning, implikasjonene av denne studien er fortsatt klar: kreftpasienter som fortsetter å røyke sigaretter under kjemoterapi kan stå å bære en mye dårligere prognose. Derfor røykeslutt under behandling kan spille en viktig rolle i å maksimere sannsynligheten for suksess. Videre har vi identifisert nikotin som en formidler av legemiddelresistens fremmende effekten av CSC. Dette funnet tyder på at nikotin kan en forbindelse som har vært innblandet i onkogenese også ha en rolle i legemiddelresistens, eventuelt gjennom sin regulering av ABCG2. Det er viktig å ytterligere undersøke de detaljerte mekanismene som regulerer CSC-mediert ABCG2 uttrykk, og for å vurdere effektiviteten av ABCG2 som et potensielt medikament mål. Det ville også være verdt å bestemme andre effekter av CSC som kan hjelpe kreft progresjon, spesielt de som målet kreftstamcelleegenskaper.
