Abstract
mikromiljøet avstiving spiller en avgjørende rolle i tumorigenesis. Mens filopodia er generelt antatt å være en av de cellulære mechanosensors for sondering miljø stivhet, effekter av miljø stivhet på filopodial aktiviteter kreftceller forblir uklart. I dette arbeidet har vi undersøkt filopodial aktiviteter for menneskelig lunge adenokarcinomceller CL1-5 dyrket på substrater av fleksibel stivhet ved hjelp av en roman plattform. Plattformen består av et optisk system som kalles strukturert belysning nano-profilometri, noe som gir tid-bortfalt visualisering av filopodial aktiviteter uten fluorescens-merking. Dyrkingen substrater var sammensatt av polyvinylklorid blandet med en miljøvennlig mykningsmiddel for å gi E-modul i området fra 20 til 60 kPa. Celleviabilitet studier viste at levedyktigheten av celler dyrket på substratene var lik de som ble dyrket på vanlig anvendte elastomerer slik som polydimetylsiloksan. Tidsbortfalt levende celle bildene ble anskaffet og filopodial aktiviteter i respons til substrater med varierende grad av stivhet ble analysert. Statistiske analyser avslørte at lungekreftceller dyrket på mykere underlag så ut til å ha lengre filopodia, høyere filopodial tettheter i forhold til den cellulære omkrets, og langsommere filopodial tilbaketreknings priser. Likevel, den time analyse av filopodial aktiviteter avdekket at om en filopodium bestemmer seg for å forlenge eller forkorte er rent en stokastisk prosess uten avhengighet av underlaget stivhet. Avviket av filopodial aktiviteter mellom lungekreftceller dyrkes på substrater med ulike grader av stivhet forsvant når myosin II-aktiviteter ble hemmet ved å behandle cellene med Blebbistatin, noe som antyder at filopodial virksomhet er tett moduleres av adhesjonsstyrken av cellene. Våre data kvantitativt forholde filopodial aktiviteter lungekreftceller med miljø stivhet og skal belyse forståelse og behandling av kreft progresjon og metastase
Citation. Leo YR, Torng W, Kao YC, Sung KB, Lee CH , Kuo PL (2014) Substrat Stivhet regulerer Filopodial Aktiviteter i lungekreft celler. PLoS ONE 9 (2): e89767. doi: 10,1371 /journal.pone.0089767
Redaktør: Chih-Hsin Tang, Kina Medical University, Taiwan
mottatt: 13. juni 2013, Godkjent: 26 januar 2014; Publisert: 27 februar 2014
Copyright: © 2014 Leo et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne er takknemlige for den økonomiske støtte under stipend tall NSC 100-2112-M-001-022-My3 og NSC101-2220-E-002-011 levert av National Science Council of Taiwan (https://web1.nsc.gov. tw /) og gi nummer 101-EC-17-A-19-S1-174 gitt av Ministry of Economic Affairs of Taiwan (https://www.moea.gov.tw/). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
mikromiljøet stivhet spiller en avgjørende rolle i kreftutvikling og progresjon. Avstivning av ekstracellulær matriks som resulterer fra øket kollagen tverrbinding oppstår under tumorigenesis [1], [2]. Matrisen avstivningen påvirker celle motilitet, styrer overføringen av kreftceller, og kan videre være relatert til organspesifikk metastase [3]. Stiv matrise fremmer stabiliteten av celle fokal adhesjon, noe som øker intracellulær signalisering vekstfaktor og i sin tur øker tumorcelletransformasjon og vekst [2], [4]. For eksempel ble det nylig vist at flere lungecancer-cellelinjer vokste bedre på stivere underlag [5], og at reduksjon av matriks stifferening ved å hemme lysyl-oksidase-mediert av kollagen tverrbinding hemmet tumorprogresjon [6]. Forstå hvordan kreftceller oppfatte og svare på miljø stivhet bør gi verdifull innsikt i vanskelighetene med kreft progresjon og bistå i forbedring av behandlingsstrategier.
Filopodia, fingerlignende fremspring på cellekantene, er vanligvis observert i svært metastatiske kreftceller, slik som CL1-5, en meget invasiv humane lunge adenokarsinomceller [7], [8]. Den unike morfologi og svært dynamiske aktiviteter filopodia gjøre dem egentlig egnede organeller for sondering miljø stivhet. Filopodia typisk beveges ut og inn i en tidsskala på titalls sekunder, mens deres lange lengde og høy overflate-til-volum-forholdet til at en intim interaksjon med mikromiljøet. Filopodial tilbaketrekking omfatter den retrograde strømmen av F-aktin primært drevet av myosin II sammentrekning [9], mens myosin aktiviteter er positivt korrelert med substratet stivhet [4], [10]. Således er det antatt at filopodia kan opptre som cellulære mechanosensors ved sentret miljø stivhet ved tilbaketrekning. Nylig ble underlaget stivhetsfølsomme dynamikk filopodia demonstrert i nevrale vekst kjegler og forklart av en stokastisk modell basert på «motor-clutch» hypotesen [11], [12]. Modellen forutsier at den myosin-drevet retrograd strømningshastighet på F-aktin øker og filopodial trekkraften avtar med økende substrat stivhet. De eksperimentelle resultater bekreftet at filopodia løsrevet fra substratet oftere med høyere substrat stivhet. Hvis disse spådommer og observasjoner kan generaliseres til kreftceller, kan man forvente at de overordnede filopodial aktivitetene til en kreftcelle som distribusjon av filopodial lengde og tetthet vil også være regulert av underlaget stivhet. Dette er viktig fordi nærvær og aktiviteter filopodia i kreftceller er antatt å være korrelert med kreftcellen evne til hjem til blodkar og invadere vev [7], [13] -. [15]
Men , effekten av substratet stivhet på filopodial aktivitetene til kreftceller fortsatt uklare på grunn av flere teknikk begrensninger. Diametrene for filopodia vanligvis varierer fra en til tre hundre nanometer, som er på grensen til oppløsningsgrensen for konvensjonell optisk mikroskopi. Derfor ble de fleste levende celle bilder om filopodial aktiviteter hentet fra fluorescerende protein-aktin-transfektert embryonale nevroner, som har stor filopodia på vekst kjegler. Imidlertid kan den forbedrede ekspresjon av det transfekterte fluorescerende protein-actin-komplekset forandre filopodial aktiviteter, mens den fototoksisitet brakt av eksitasjonslyset kan påvirke celleaktiviteter og endre dynamikken i filopodia [16], [17].
i dette arbeidet undersøkte vi effekten av underlaget stivhet på filopodial aktivitetene til lungekreft celler CL1-5 ved hjelp av en nyutviklet avbildningsteknikk som kalles strukturerte-belysning nano-profilometri (SINAP), som benytter topografiske følsomhet for å forbedre kontrasten i bildet av en filopodium på flate underlag og gir etiketten fritt, tidsbortfalt visualisering av filopodial aktiviteter på en bildefrekvens opp til 0,2 Hz [18], [19]. For å forbedre bildekontrasten mellom filopodia og det omgivende medium, polyvinylklorid (PVC) baserte materialer med høye brytningsindekser og avstembar stivhet var tilpasset for cellekultur. Den biokompatibilitet av de PVC-baserte substrater ble evaluert ved anvendelse av MTT-analyse [20]. Vi kvantifisert filopodial aktivitetene til individuelle celler ved å måle filopodial tetthet (dvs. antall filopodia per lengdeenhet av mobiltelefon periferier), gjennomsnittlig filopodial lengde, de filopodial utskyt priser, og utvidelsen /tilbaketrekkings sannsynligheten for individuell filopodia , som er definert som den brøkdel av tid som en filopodium brukt for forlengelse /tilbaketrekning. For å avgjøre om effekten av underlaget stivhet på filopodial aktivitetene er avhengig av myosin II aktiviteter, målte vi også endring av filopodial aktiviteter når celler dyrket på substrater med forskjellig grad av stivhet ble behandlet med Blebbistatin, en myosin II inhibitor.
Resultatene
Karakterisering av PVC-baserte underlag
kultur~~POS=TRUNC underlag ble laget av en blanding av PVC og en miljøvennlig, karboksylat typen mykner, di (isononyl) sykloheksan-1, 2-dicardoxylate (DINCH). Stivheten av blandingen ble innstilt ved å justere forholdet av PVC til mykneren, mens større forholdstall ført stivere kompositter. Den Youngs-moduler PVC-kompositter, som målt ved anvendelse av sekvenskomprimering til bulkmaterialer, var 20,2 ± 2.5 MPa (
n
= 6), 35,7 ± 0 kPa (
n
= 1 ), og 61,1 ± 12,9 kPa (
n
= 6) for PVC 01:01, PVC 02:01, og henholdsvis PVC 03:01. Her PVC 01:01, 02:01 og 03:01 henviser til PVC-kompositter med prosenter av PVC til mykner er 01:01, 02:01 og 03:01 hhv. Disse data indikerer at stivheten i PVC-kompositter er innenfor området av de fleste vev i ondartete tilstander [21].
virkemåte av SINAP krever at kulturen substratet har en annen brytningsindeks enn for celler til forbedre signal-til-støy-forholdet av bildene. Brytningsindeksene av PVC-kompositter ble bestemt ved hjelp av den nye digitale holografiske microtomography som nylig beskrevet [22]. De målte brytningsindekser for PVC og mykneren var 1,53 til 1,57 og 1,47, respektivt. Således kan de resulterende brytningsindeksene til PVC-kompositt varierte 1,47 til 1,53, noe som er svært nær den for glass (~1.5) og høyere enn den til celler (~1.36) [23].
Celleviabilitet test ble anvendt for å bestemme hvorvidt den biokompatibilitet av PVC-kompositter er kompatibel med andre kompatible substrater som vanligvis anvendes for cellekultur. Vi har utført MTT-analyser for human lunge-adenokarsinomceller CL1-5 dyrket på glass, PVC-kompositter, polyakrylamid (PA) geler og poly (dimetyl) siloksan (PDMS). Figur 1 viser typiske bilder av celler dyrket på forskjellige underlag. MTT-assayet kvantifiserer metabolsk aktive celler som optisk tetthet (OD) ved 570 nm. Som vist på fig. 2, celler dyrket på glass og PA-gel hadde den største levedyktighet når sammenlignet med andre elastomere substrater. De gjennomsnittlige viabilities celler dyrkes på PVC-kompositter og at av PDMS substratene var like. Det var ingen signifikant forskjell i celle levedyktighet mellom PVC 03:01, 02:01 og 01:01. Dette indikerer at biokompatibilitet av PVC-kompositter er lik den til andre vanlig brukte elastomere substrater og ikke påvirkes ved å variere forholdet av PVC til den mykner.
PVC 01:01, 02:01, og tre :1 henviser til PVC-kompositter med prosenter av PVC til mykner er 01:01, 02:01 og 03:01 på henholdsvis; PA og PDMS er forkortet for polyakrylamid og poly- (dimetyl) siloksan respektivt. Scale bar = 100 mikrometer.
Fargestoffet har en lilla farge og ble kvantifisert ved den optiske absorbans ved 570 (
n
= 8, 5, 4, 4, 3, og 3 for glass, PVC 03:01, PVC 02:01, PVC 01:01, PA gel, og PDMS underlaget henholdsvis).
Effekter av underlaget stivhet på filopodial lengde og tetthet
For å avgjøre om de filopodial aktiviteter er påvirket av underlaget stivhet ble CL1-5 cellene sådd ut på PVC 01:01, PVC 03:01, og glass underlag. Substratene ble belagt med fibronektin før såing celle for å lette cellefesting. Farging mot belagt fibronektin bekreftet at det absorberte fibronectin hatt lignende overflatekonsentrasjoner over de tre typer underlag; blir forholdet mellom den midlere fluorescensintensitet av farget fibronektin til substratet bakgrunnen var 1,64, 1,59, og 1,41 for PVC 01:01, 03:01 PVC, og glass-substrater henholdsvis. Youngs moduler av PVC-kompositter var ca 60 kPa og 20 kPa for PVC 03:01 og 01:01 respektivt, mens elastisitetsmodul av glass er av størrelsesorden GPa. Live-celle bildene ble anskaffet ved hjelp av en SINAP system. Typiske SINAP bilder for kreftceller dyrket på PVC 01:01, 03:01 PVC, og glass-substrat er vist i fig. 3, hvor filopodia er karakterisert som tynne, lyse fremspring med ulike lengder på de cellulære periferier.
Scale bar = 5 mikrometer.
Vi har observert at antall filopodia per celle varierte fra 50 til 70. for enkeltceller, identifiserte vi alle synlige filopodia og beregnet tetthet og gjennomsnittlige lengden på filopodia, referert til som
f
d og
f
L hhv. Den filopodial Tettheten ble definert som forholdet mellom den filopodia nummeret til omkretsen av cellen. Figur 4A viser variasjonen av
f
d samplet fra celler dyrket på PVC 01:01, PVC 03:01, og glass underlag, henholdsvis. Cellene dyrket på PVC 01:01 hadde størst
f
d (gjennomsnitt = 0,55 mikrometer
-1, celle nummer = 33), etterfulgt av cellene dyrket på PVC 3: 1 (gjennomsnitt = 0,31 mikrometer
-1, celle nummer = 18), og at dyrket på glasset (gjennomsnitt = 0,31 mikrometer
-1, celle nummer = 43). Statistisk analyse avdekket at det er betydelig forskjell mellom resultatene fra PVC 01:01 og 03:01 (
p
= 4,4 × 10
-9), og PVC 01:01 og glass (
p
= 1,1 × 10
-9), mens det er ingen signifikant forskjell mellom resultatene av PVC 03:01 og glass (
p
= 0,75). Konsekvent, som vist i figur 4B,
f
L av celler dyrket på PVC 01:01 var signifikant lenger enn for celler dyrket på PVC 03:01 (
p
= 8,8 × 10
-4) og glass (
p
= 2,2 × 10
-4), mens det er ingen signifikant forskjell mellom det av PVC 03:01 og glass (
p
= 0,67). Det betyr av
f
L var henholdsvis 3,77, 3,08 og 3,03 mikrometer for PVC 01:01, PVC 03:01, og glass. Disse data indikerer at når kreftceller er dyrket på elastiske underlag, cellene som vokste på mykere underlag har flere og lengre filopodia.
filopodial Tettheten ble definert som antall filopodia per lengdeenhet av den cellulære omkretsen. Den filopodial lengde ble i gjennomsnitt fra alle synlige filopodia av cellen. Stolpene representerer hjelp av de variable, og feilene betegner standardavvik beregnet ut fra 33, 18, og 43 celler for PVC 01:01, 03:01, PVC og glass underlag hhv. Signifikante forskjeller ble funnet mellom data for PVC 01:01 og 03:01, og PVC 01:01 og glass med at ** indikerer
p
. 0,01
Effekter substrat stivhet på dynamikken i filopodial forlengelse og tilbaketrekking
Vi spurte om filopodia har ulike priser og sannsynligheter for å forlenge eller forkorte når kreftceller dyrket på substrater av ulike grader av stivhet. Spesielt begrunnet vi at filopodia av kreftceller dyrket på stivere substrater kan ha en større tilbøyelighet til å trekke seg tilbake, noe som fører til en mindre
f
D og en kortere
f
L, som vist i fig. 4. For å analysere og lagt sammen går dynamikken i enkelte filopodia, ble tidsbortfalt SINAP bilder av levende celler tatt ett bilde hvert 10. sekund i fem minutter. Bare filopodia varte lenger enn ett minutt (dvs. vises på 6 sammenhengende rammer) ble sporet og de øyeblikke filopodial lengder ble målt fra enkeltbilder. En representativ lengde tidsmessige profil av et belte filopodium er vist i fig. 5. filopodium hadde en initiell lengde på 0,92 um ved starten av sporing, kontinuerlig forlenget i 100 sekunder, og trukket til 1,02 um ved slutten av bildeopptak. Vi beregnet satsene for endringen i lengde mellom etterfølgende rammer og henvist positive endringer som forlengelse og negative som retraksjonslinjer priser. Dette ga et sett med forlengelse /inntrekk priser assosiert med ulike filopodial lengder. For eksempel, forlengelses satser for filopodium vist i fig. 5 er 0,004, 0,04 og 0,001 μm⋅s
-1 på filopodial lengde på 0,92, 1,14 og henholdsvis 1,79 mikrometer. Vi sporet 51, 59, og 34 filopodia for celler dyrket på PVC 01:01, 03:01, PVC og glass underlag hhv. Vi antok at celler dyrket på samme type underlag har lignende filopodial dynamikk og samlet frekvensen data i henhold til type dyrknings underlag. For å lette sammenligningen av prisdata på tvers av ulike filopodial lengder, assortert vi dataene med et sett av lengde områder atskilt med samme avstand. Vi først valgte to mikrometer som gapet; nemlig området 1 referert til filopodial lengde ≥0 og mindre enn 2 mikrometer, området 2 betegnet filopodial lengde ≥2 um og mindre enn 4 mikrometer, og så videre. Figur 6 oppsummert variasjonen av pris data på tvers av de definerte lengdeklasser for celler dyrket på de tre typer underlag. Stolpene representerer hjelp av data for assortert i lengden rekkevidde og feilene betegne standardavvikene. Generelt forlengelses prisene oppviste en tendens til å avta etter hvert som den filopodial lengde økes, mens de tilbaketreknings priser ut til å øke etter hvert som lengden øker, med et lokalt maksimum på lengden av 11, 7, og 7 um for celler dyrket på PVC henholdsvis 01:01, PVC 03:01, og glass underlag. Vi observerte lignende trender når assorting data ved hjelp av ulike hull som 1 eller 0,5 mikrometer for lengden områder. Legg merke til at i fig. 6 er de hastighetsdata fra cellene på mykere underlag spredte større lengde varierer, noe som er i overensstemmelse med resultatene som er vist i fig. 4B.
Celle var dyrket på glass underlag. Den filopodial lengde var 0,92 mikrometer ved starten av bildet oppkjøpet, kontinuerlig utvidet til 1,81 mikrometer, og tilbaketrukket til 1,02 mikrometer på slutten av bildet oppkjøpet. De SINAP bildene tilsvarer lengden data markert med sirkler er vist i høyre og merket med opptakstiden. Den spores filopodium ble markert med pil i en
st bilde.
(A), (B) og (C) viser forholdet mellom skjøte priser og filopodial lengder til celler dyrket på PVC 01:01, 03:01 PVC, og glass-substrat henholdsvis; (D), (E), og (F) viser variasjon inntrekkjedenes prisene med hensyn til ulike filopodial lengder for celler dyrket på PVC 01:01, PVC 03:01, og glass underlaget hhv. Stolpene representerer hjelp av data for assortert i lengdeklasser og feilene betegne standardavvikene. Dataene ble ymse i et sett av lengdeområder atskilt av 2 um. Antallet filopodia spores for måling er 51, 59 og 34 for PVC 01:01, PVC 03:01, og glass underlag hhv.
Underlags stivhet betydelig påvirket inntrekkjedenes priser når filopodial lengde overskredet en viss skala. Vi fant at betydningen dukket opp når skalaen ble satt til å være 4 pm, som er rundt de hjelp av
f
L vist i fig. 4B. For hver spores filopodium, samlet vi de hastighetsdata målt til filopodial lengde ≥4 mikrometer og beregnede midler. Vi henvist til hjelp av inn- og utkjøring priser som
V
henholdsvis E og
V
R. Vi samlet sammen
V
E og
V
R beregnet ut fra celler dyrket på samme type underlag og diverse data i et sett av frekvensområdene som var like adskilt med 0,02 μm⋅s
1. Den fore Sannsynligheten for et bestemt frekvensområde ble dermed beregnet ved å beregne brøkdel av data assortert inn interesserte rekkevidde. Figur 7 illustrerer sannsynlighetsfordelingen av utskyt priser estimerte for cellene dyrket på de tre typer underlag. De faste, stiplede, og stiplede linjer representerer normalfordeling passer til dataene i glass, PVC 03:01, og PVC 01:01 hhv. Statistisk analyse viste at det var ingen signifikant forskjell mellom
V
E for celler dyrket på de tre underlag (
p
= 0,17). Det betyr av
V
E var 0,052, 0,064 og 0,054 μm⋅s
-1 for celler dyrket på PVC 01:01, PVC 03:01, og glasset underlaget henholdsvis . Men
V
R for celler dyrket på PVC 01:01 var betydelig tregere enn den glass (
p
= 0,02), mens forskjellene i
V
R mellom cellene dyrket på PVC 01:01 og PVC 03:01 (
p
= 0,31) og at av PVC 03:01 og glass (
p
= 0,05) var ikke signifikant. Det betyr av
V
R var 0,059, 0,063 og 0,069 μm⋅s
-1 for celler dyrket på PVC 01:01, PVC 03:01, og glasset underlaget henholdsvis . Disse resultatene tyder på at filopodia av celler dyrket på mykere underlag ser ut til å trekke langsommere når filopodial lengden overstiger den gjennomsnittlige lengden.
Dataene ble assortert i en serie av frekvensområdene som ble like adskilt med 0,02 μm⋅s
1. De faste, stiplede, og stiplede linjer representerer normalfordeling passer til dataene i glass, PVC 03:01, og PVC 01:01 hhv. Koeffisientene til bestemmelse (dvs.
R-
firkant) for de tre beslag er . 0.9
For å kvantifisere tendens filopodial tilbaketrekking når cellene ble dyrket på substrater av spesiell stivhet, definerte vi sannsynligheten for at en filopodium foretrekker å trekke as (1) der
t
E og
t
R betegner fraksjoner av tid at filopodium brukt for henholdsvis forlengelse og dementi. Siden vi var mest interessert i de filopodial dynamikk påvirker hjelp av
f
L, bare de timelige data etter filopodial lengde på over 4 mikrometer ble vurdert og perioder at filopodial lengde forble stasjonær ble ekskludert . Legg merke til at den strekker seg ut og trekke sannsynligheten for filopodium er de samme om
P
R er lik 0,5. Figur 8 viser sannsynlighetsfordelingen av
P
R beregnet fra celler dyrket på de tre typer underlag. Igjen, de solide, stiplede, og stiplede linjer representerer normalfordeling passer til dataene i glass, henholdsvis PVC 03:01, og PVC 01:01. Statistisk analyse viste at det var ingen signifikant forskjell mellom
P
R av celler dyrket på de tre typer underlag (
p
= 0,54). Det betyr av
P
R var 0,48, 0,48, og 0,47 for PVC 01:01, PVC 03:01, og glass hhv. Disse resultatene antyder at hvorvidt en filopodium bestemmer seg for å forlenge eller forkorte er et rent stokastisk prosess uten avhengighet av substratet stivhet. Dermed variant av
f
L mellom substrater av ulike grader av stivhet i hovedsak et resultat av de ulike satsene for filopodial tilbaketrekking, som var hovedsakelig drevet av myosin II sammentrekning og avhengig av underlaget stivhet.
tilbaketrekking tendensen ble definert som brøkdel av tiden som filopodium brukt for tilbaketrekking. De faste, stiplede, og stiplede linjer representerer normalfordeling passer til dataene i glass, PVC 03:01, og PVC 01:01 hhv. Koeffisientene til bestemmelse (dvs.
R-
firkant) for de tre beslag er . 0.9
Blebbistatin behandling endrer filopodial aktiviteter
Siden underlaget stivhet regulerer styrken på celle adhesjon og myosin II aktiviteter [10], lurte vi på om den observerte avvik på filopodial lengde og tetthet mellom celler dyrket på substrater av ulike grader av stivhet forsvinner hvis de myosin aktiviteter ble hemmet. Vi først undersøkte viabilities og filopodial aktiviteter kreftceller behandlet med Blebbistatin av ulike konsentrasjoner. De CL1-5-celler ble dyrket på glass-substrater for 24 timer og utsatt for løsninger inneholdende 10-30 mM Blebbistatin i 1 time for å inhibere myosin aktiviteter, som refererer til en ny litteraturen [24]. Celleviabilitet studier ved anvendelse av MTT-analysen viste at behandlingen av 10-30 pM Blebbistatin ikke bringe den CL1-5 celler signifikant toksisitet (Fig. 9), mens den filopodial tettheten og midlere lengde økte med økende Blebbistatin konsentrasjoner (Fig. 10) . Statistisk analyse viste at filopodial tettheten av kreftceller behandlet med 30 mikrometer Blebbistatin var betydelig større enn det som behandles med 0 (
p
= 0,006) og 10 mikrometer Blebbistatin (
p
= 0,03), men det var ingen signifikant forskjell mellom som behandles med 0 og 10 mikrometer (
p
= 0,1). Likeledes filopodial lengden av kreftceller behandlet med 30 mikrometer Blebbistatin var betydelig lengre enn som behandles med 0 (
p
= 3,2 × 10
-5) og 10 mikrometer Blebbistatin (
p
= 0,02), og det var signifikant forskjell mellom det behandles med 0, og 10 uM (
p
= 0,01).
cellene ble dyrket på glass-substrater for 24μM av DMSO eller Blebbistatin for 1 time (
n
= 5 for hver konsentrasjon). De optiske tettheter av celler uten anvendelse av reagenser ble betegnet som kontroll (
n
= 8). Stolpene representerer hjelp av variablene og de feil som angir standardavvik.
stolpene representerer hjelp av de variable, og feilene betegner standardavvik beregnet ut fra 43, 24, og 31 celler behandlet med henholdsvis 0, 10, og 30 uM Blebbistatin. Merket * angir
p
. 0,05
For å oppnå betydelig blokkering av myosin aktiviteter, dyrket vi CL1-5 celler på PVC 01:01, PVC 03:01 og glass-substrater og behandles cellene med en oppløsning av 30 mM Blebbistatin i 1 time. Figur 11 viser den representative lyse feltet og immunfarging av bilder av celler som ble behandlet og ikke behandlet med Blebbistatin. Vi beregnet antall farget vinculin per celler. Det ser ut til at Blebbistatin behandling økt celle avrunding på alle tre typer underlag og forbedret filopodial forlengelse og forgrening, men redusert antall fokusvoksninger for celler dyrket på stivere underlag. Gjennomsnitt og standardavvik for vinculin nummer per celle var 53,2 ± 28,3, 93,6 ± 30,3 og 155,8 ± 35,5 for celler dyrket på PVC 01:01 (
n
= 5), PVC 03:01 (
n
= 5), og glass substrat (
n
= 8) uten bleddistain behandling. Etter bleddistain eksponering, tallene endret til 40,5 ± 13,6, 51,7 ± 19,5 og 101,6 ± 22,3 for celler dyrket på PVC 01:01 (
n
= 3), PVC 03:01 (
n
= 4), og glass substrat (
n
= 9).
(A), (B) og (C) er lyse felt bilder av celler behandlet med vanlig dyrkingsmedium som kontroll; (D), (E) og (F) er de tilsvarende immunfluorescens bilder av kjernen (blå) og vinculin (grønn); (G) – (L) viser den lyse felt, og tilsvarende immunofluroresence bilder av celler behandlet med 30 uM Blebbistatin i én time for å hemme myosin II aktiviteter. Målestokk = 10 um.
Statistisk analyse viste at etter eksponert for 30 uM Blebbistatin i en time, vil forskjellen i
f
D mellom cellene dyrket på PVC 01:01 og PVC 03:01 ble ubetydelig (
p
= 0,11), og
p
verdi for betydningen av
f
D forskjellen mellom det på PVC 01:01 og glass redusert (
p
= 0,0069) sammenlignet med at uten Blebbistatin behandling (
p
= 1,1 × 10
-9). Videre Blebbistatin behandling betydelig økt
f
D, med en mer betydelig økning i celler dyrket på PVC 03:01 (
p
= 0,046 for PVC 01:01,
p
= 2,1 × 10
-6 for PVC3:1, og
p
= 0,006 for glass). Numrene på samplet celler var 10, 13 og 31 for PVC 01:01, 03:01 PVC, og glasset hhv. Figur 12A oppsummerer endring av
f
D for celler som er utsatt for Blebbistatin i en time. Legg merke til at resultatene er vist i fig. 4A ble plottet ved siden av disse barene for sammenligning
De hvite stripene representerer hjelp av data målt fra celler uten Blebbistatin behandling (dvs. data i figur 4.).; de grå barer betegne hjelp av data målt fra celler med Blebbistatin behandling; og feil angi standardavvikene til data. Antallet av celler behandlet med Blebbistatin er 10, 13 og 31 for PVC 01:01, 03:01 PVC, og glass-substrater henholdsvis. # Og ## betegner
p
0,05 og
p
0,01 henholdsvis for forskjellen mellom data innhentet fra samme type underlag med og uten Blebbistatin behandling; * Og ** er annotert for
p
0,05 og
p
0,01 henholdsvis for forskjellen mellom data innhentet fra ulike typer underlag med og uten Blebbistatin behandling. Merk at for cellene uten Blebbistatin behandling, ble det funnet signifikante forskjeller mellom data for PVC 01:01 og PVC 03:01, og mellom det av PVC 01:01 og glass; for cellene behandlet med Blebbistatin, var signifikant forskjell bare funnet mellom data av PVC 01:01 og glass.
f
L av celler dyrket på substrater av ulike grader av stivhet utstilt tilsvarende endring etter behandling av 30 mikrometer Blebbistatin (fig. 12B). Igjen viser resultatene er vist i fig. 4B ble plottet ved siden av dem etter den Blebbistatin behandling for sammenligning. Statistisk analyse viste at Blebbistatin behandling betydelig økt
f
L for celler på PVC 03:01 (
p
= 0,005) og glass (
p
= 3,2 × 10
-5); mens endringen av
f
L var ikke signifikant for celler på PVC 01:01 (
p
= 0,48). Gjennomsnitt av
f
L var 4,32 mikrometer, 3,95 mikrometer, og 4,98 mikrometer for PVC 01:01, PVC 03:01, og glasset hhv. Avviket fra
f
L mellom celler dyrket på substrater av ulike grader av stivhet ble ubetydelig etter Blebbistatin behandling (
p
= 0,12). Disse resultatene tyder på at den observerte substrat stivhets-sensitive aktiviteter filopodia var minst delvis modulert av myosin II aktivitet.
Diskusjoner
I dette arbeidet kvantifisert vi forholdet mellom de filopodial aktiviteter lungekreftceller og underlaget stivhet ved hjelp av en etikett fritt avbildningsteknikk. Vi fant ut at underlaget stivhet regulert filopodial lengde og tetthet i kreftceller sannsynligvis via påvirker filopodial tilbaketrekking rate, som først og fremst ble modulert av varierte myosin aktiviteter.
