Abstract
Formålet med denne studien er å evaluere cytokin uttrykk ved perifere mononukleære blodceller (PBMC) fra fase I lungekreftpasienter og for å bekrefte disse uttrykk mønstre ved å utsette PBMC til lungekreftceller
in vitro
. Fem endrede cytokiner i stadium I lungekreftpasienter (CCI3, IL8, IL1β, CXCL10, sIL2Rα) ble identifisert i plasma fra personer (n = 15) før og etter reseksjon ved hjelp av en 30-Plex panel proteinanalyse. Genuttrykkstudier ved hjelp av kvantitativ RT-qPCR ble utført på PBMC fra trinn I lungekreftpasienter (n = 62) før og etter reseksjon, og sammenlignet med ikke-kreftpasienter (n = 32) før og etter operasjonen for godartet sykdom. Co-kultur eksperimenter som utsatte frisk donor PBMC til lungekreftceller
in vitro
ble utført for å evaluere effekten på PBMC cytokin uttrykk. PBMC genuttrykk av CCI3, IL8 og IL1β var høyere hos lungekreftpasienter i forhold til de samme pasientene på hver av fire sekvensielle tidspunkter etter fjerning av deres svulster, mens CXCL10 og IL2Rα var i hovedsak uendret. Dette mønsteret ble også påvist når lungekreftpasienter ble sammenlignet med ikke-cancerpasienter. Når ikke-kreftpasienter operert for godartede sykdommer, disse cytokin uttrykk endringene var ikke påviselig. Lungekreft cellelinjer, men ikke godartede bronkial epitelceller, indusert lignende endringer i cytokingen og protein uttrykk av frisk donor PBMC i en
in vitro
co-kultur system. Vi konkluderer med at PBMC fra scenen I lungekreftpasienter har forskjellige cytokin uttrykk mønstre i forhold til både ikke-kreftpasienter, og lungekreftpasienter etter fjerning av svulster. Disse uttrykk mønstre blir kopiert av frisk donor PBMC utsatt for lungekreft cellelinjer, men ikke godartede bronkiale epitelceller
in vitro
. Disse funnene har implikasjoner for forståelsen av immunresponsen mot lungekreft
Citation. Chang DH, Rutledge JR, Patel AA, Heerdt BG, Augenlicht LH, Korst RJ (2013) Effekten av Lung Cancer på cytokin uttrykk på perifere mononukleære blodceller. PLoS ONE 8 (6): e64456. doi: 10,1371 /journal.pone.0064456
Redaktør: Sai Yendamuri, Roswell Park Cancer Institute, USA
mottatt: 12. oktober 2012; Godkjent: 15 april 2013; Publisert: 06.06.2013
Copyright: © 2013 Chang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Valley Hospital Foundation. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser: Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft er fortsatt den ledende årsak til kreft-relaterte dødelighet i USA, og er forventet å ta høyde for flere dødsfall i 2012 enn kolorektal, bryst og prostata kreft kombinert [1]. Selv om lungekreft har vært ansett for å være et dårlig immunogen malignitet, flere linjer av bevis tyder på en påvirkning av vertens immunsystem i å endre lungekreft utvikling og progresjon. Disse inkluderer rapporter om økt overlevelse i lungekreftpasienter med postoperative infeksjoner [2], økt tilbakefallsprosent blant pasienter som får perioperative blodoverføringer [3], [4], og høyere forekomst hos immunsupprimerte individer som de som tester positivt for humant immunsviktvirus (HIV) [5]. Til tross for disse observasjonene, rollen vertens immunsystemet i utvikling og progresjon av lungekreft er fortsatt uklart.
cytokiner og chemokiner (kjemotaktiske cytokiner) er viktige endogene regulatorer av immunsystemet og utskilles av immunceller, så vel som av tumor. I kreftpasient, disse molekylene har mangfoldige og komplekse roller i funksjon og trafficking av immun og andre celler, inkludert endoteliale progenitorceller [6]. Cytokin og kjemokin nettverk kan også bli «kapret» av cancerceller for å tilveiebringe et miljø som bidrar til tumorvekst [6], [7].
Gitt den uklare rollen som antitumor immunitet hos lungekreftpasienter, kombinert med den global betydning av cytokiner og kjemokiner til immunresponsen, hypotese vi at lungekreft ville ha spesifikke effekter på cytokin /chemokine ekspresjon og sekresjon av perifere mononukleære blodceller (PBMC). I denne forbindelse er formålet med denne studien er tredelt. Først, for å avgjøre om pasienter med stadium I lungekreft utstillings endret cytokin uttrykk i sirkulerende plasma og PBMC før potensielt kurativ reseksjon, sammenlignet med etter reseksjon, og å identifisere forskjellig uttrykt cytokiner. For det andre, for å bekrefte dette differensial uttrykk i PBMC hentet fra en større kohort av stadium I lungekreftpasienter, og sammenligne disse resultatene til en kohort av pasienter som gjennomgår thoraxkirurgi for godartede sykdommer. Tredje å finne ut om dette differensial cytokin uttrykk utløses når frisk donor PBMC blir utsatt for lungekreft celler
in vitro
.
Materialer og metoder
pasientpopulasjon
Denne undersøkelsen ble gjennomgått og godkjent av The Valley Hospital Institutional Review Board og skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle deltagerne. To grupper av pasienter ble undersøkt. Den lungekreft pasientgruppen inkludert personer som gjennomgår kurativ lunge lobektomi og mediastinale lymfeknutetoalett, med scene jeg status bekreftet patologisk. Kontrollen pasientgruppen inkludert ikke-kreftpasienter som gjennomgår thoraxkirurgi for godartede tilstander, slik som spontan pneumothorax, diagnostisk reseksjon av en godartet lunge nodule, bulløs lungesykdom, bronkiektasier, mediastinum /lunge cyster, og hiatal brokk reparasjon.
Pasienter ble ekskludert fra studien dersom de fikk kronisk steroid terapi, funnet å ha avansert lungekreft (stadium II, III, IV) patologisk etter reseksjon, hadde andre samtidige kreftformer enn ikke-melanom hudkreft, kreves adjuvant eller neoadjuvant kjemoterapi , strålebehandling eller begge deler, eller hadde en historie med HIV-infeksjon, hepatitt B eller C eller andre immunsuppressive eller myeloproliferative sykdommer. Kontroll pasienter ble ekskludert hvis de var under thoraxkirurgi for inflammatoriske /infeksjonstilstander (empyem, interstitiell lungesykdom, eller aktiv lungebetennelse) eller hadde en historie med andre typer kreft.
preoperative blodprøver ble samlet inn i løpet av en to uke vindu før operasjonen, mens postoperative prøver~~POS=HEADCOMP ble tatt ved 3 (2-4 måneder), 6 (5-7 måneder), 9 (8-10 måneder) og 12 (11-13 måneder) etter operasjonen med mindre annet er angitt.
Blood Prøvetaking og behandling
Lungekreft og kontrollere pasientens blod ble tegnet av perifert venepunksjon til BD Vacutainer CPT cellepreparat Rør med Sodium Heparin (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Blood behandlingen ble utført i henhold til produsentens protokoll. PBMC pellets ble høstet og lagret ved -80 ° C for RNA-ekstraksjon og etterfølgende analyser. Plasma ble også lagret og lagret ved -80 ° C.
Sunn donor blod leukocytter (buffy coat) som brukes i
in vitro
eksperimenter ble kjøpt fra fellesskaps Blood Services (Paramus, NJ) . Disse PBMC ble fremstilt ved sentrifugering av blod på Ficoll-Paque PLUS tettshetsgradient medium (GE Healthcare, Pittsburgh, PA) i 30 minutter ved 805 x
g
RCF (relativ sentrifugalkraft) ved romtemperatur. Isolerte PBMC ble hentet og vasket to ganger i PBS ved sentrifugering i 15 og 10 minutter ved 453 x
g
ved 4 ° C. Isolerte PBMC ble deretter brukt til
in vitro
co-kultur analyser.
Luminex analysen
Luminex analysen er en multiplex perle basert immunologisk, som gjør det mulig for den samtidige måling av flere analytter (f.eks cytokiner) ved hjelp av et bibliotek av antistoff-koplet fargekodede perler (kalt mikrosfærer). For det første screening av plasmaproteiner, ble plasma samlet inn fra 15 stadium I lungekreftpasienter preoperativt og 3-7 måneder etter operasjonen. Plasmaprøver ble deretter analysert ved anvendelse av Menneskelig Cytokine 30-plex Panel, LHC6003, (Luminex plattform, Life Technologies, Carlsbad, CA). Analyser ble utført i henhold til produsentens protokoll med det unntak at prøvene, perler og buffer ble inkubert over natten ved 4 ° C. Reaksjonene ble utført ved hjelp av Luminex 100 instrument (Luminex, Austin, TX), standardkurver ble generert, og data ble samlet inn og analysert ved hjelp av Luminex 100 Integrert Software versjon 2.3. Supernatanter fra
in vitro
ko-kultur-eksperimenter ble også evaluert ved bruk av Luminex analysen, i henhold til den protokoll som er beskrevet ovenfor. For de innledende plasma screening studier ble det relative proteinnivåer uttrykt ved å beregne forholdet mellom den midlere ganger endring i proteinekspresjon (preoperativt til postoperativt), og trans verdiene til loggen
2 målestokk. Pasienter med minst ett datapunkt som viser uttrykket ovenfor Luminex minimal registreringsnivået ble inkludert i forholdet beregningene.
PBMC Gene Expression Database
genuttrykk i PBMC seks lungekreft tilfellene, før og 2-5 måneder etter kurativ reseksjon ble oppnådd ved bruk av Affymetrix U133 + 2,0 mikromatriser, ved hjelp av RNA isolert fra PBMC cellelysater motsetning til plasmaprøver. Dette arbeidet har blitt beskrevet tidligere [8]. Hybridisering intensiteter ble brukt til å beregne fold forskjeller mellom preoperativ og postoperative prøver.
RNA Utvinning og kvalitetsvurdering
RNA ble ekstrahert fra PBMC lysatene ved hjelp RNeasy Mini Kit (Qiagen Sciences, Valencia, CA) ifølge til produsentens protokoll med følgende modifikasjoner. Frozen PBMC pellets ble lysert direkte i RLT buffer for å minimere RNA degradering. Cellelysatene ble ledet gjennom QIAshredder (Qiagen) før etterfølgende rensing som beskrevet i protokollen. Ribonculease fritt DNase (Qiagen) ble brukt under on-kolonne fordøyelsen av DNA for å minimalisere tilstedeværelsen av gjenværende genomisk DNA.
RNA kvalitet og konsentrasjon ble vurdert ved hjelp av RNA Nano chips med Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA), og analysert ved hjelp av 2100 Expert programvare (Agilent). Den RIN (RNA Integrity Number) for det ekstraherte RNA var i området på 7,0 til 10,0 med gjennomsnittet av 8,8 ± 0,68 for alle RNA prøver brukt i denne studien.
Sanntids kvantitativ revers transkripsjon PCR (RT -qPCR)
RT-qPCR eksperimenter ble utført ved hjelp av 7500 real Time PCR instrument fra Applied Biosystems (Life Technologies Corp., Carlsbad, California). Alle materialer og protokoller ble oppnådd fra Applied Biosystems. Primer og probe sett (Tabell S1) ble utformet ved hjelp Primer Express programvare (Applied Biosystems) etter standard sett av design kriterier fastsatt av programvaren. Sett spredte et intron og bro en ekson-exon krysset og ble gjort til spesifikasjon av enten Applied Biosystems eller Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Primere og prober ble testet empirisk for fraværet av forstyrrelser før den anvendes for multipleksing. Den normaliserende kontroll benyttes for alle RT-qPCR eksperimentene var β-Actin (gen symbol ACTB), som ble anvendt som referanse-genet for alle beregninger. RT-qPCR multiplex analyser som består av tre til fire sett med primere og prober (inkludert som for ACTB.) Ble utført [9].
RT reaksjonen ble utført med to mikrogram RNA per reaksjon ved hjelp av High Capacity RNA til cDNA kit (Life Technologies Corp., Carlsbad, California). Kvantitativ PCR-reaksjon ble utført ved anvendelse av 30 ng av cDNA i tre eksemplarer. Foldendring Beregningene ble utført ved anvendelse av «sammenlignende C (T) metoden» fastslått av produsenten [10]. C (T), syklus terskel, blir også referert til som Cq (Kvantifisering syklus) verdi. For beregning, ble gjennomsnittet av triplikate CQ verdiene ble brukt til analysen. CQ verdier ble normalisert til de for ACTB.
Cell Kultur og
in vitro
Co-kultur Experiment
A549 og HCC827 humane lungekreftcellelinjer ble kjøpt fra ATCC ( Manassas, VA). A549-celler ble dyrket i F12K medium, HCC827 celler i RPMI. Begge kulturmedium supplert med 10% føtalt bovint serum, 0,028% HEPES (4- (2-hydroksyetyl) -1-piperazinetansulfonsyre), 0,02% natriumpyruvat, 0,02% penicillin /streptomycin, og 0,004% gentamicin. Alle reagenser som ble brukt for celledyrking ble anskaffet fra Life Technologies (Carlsbad, CA). Den primære humane bronkiale epitelceller (NHBE), tilsvar BEBM dyrkingsmedium (supplert med BEGM bullet kit), og reagenser ble kjøpt fra Lonza (Allendale, NJ). NHBE kultur og subkultur ble utført i henhold til leverandørens protokollen (Lonza). Cellekulturer ble holdt ved 37 ° C med 5% CO
2.
A549, HCC927 og NHBE celler ble dyrket i to dager i 3 ml medium i 35 mm (6-brønns) retter (BD Biosciences , Franklin Lakes, NJ) til 80-90% konfluens. Etter to dager ble 0,4-um Transwell innsatser (Corning Corp, Corning, New York) som er lagt inn i brønnene og 5 x 10
6 av frisk donor PBMC, suspendert i 3 ml av tilsvarende cellekulturmedium, ble tilsatt til hver transwell . Ko-kultur kontrollene besto av brønner inneholdende bare fullstendig cellekulturmedium (F12K, RPMI eller BEBM, supplert som beskrevet ovenfor) uten de ondartede eller godartede epitelceller. Co-Kulturene ble deretter inkubert i 6 og 18 timer. Etter inkubering ble cellekultursupernatanter oppsamlet, sentrifugert (453 x
g
RCF, 4 ° C, 15 min), og alikvoter lagret ved -80 ° C for Luminex analysen. For genekspresjon analyse, ble transwell innsatsene fjernet og PBMCer umiddelbart lysert
in situ
ved hjelp av RLT-buffer (RNeasy kit, Qiagen) og enten lagret ved -80 ° C eller anvendt umiddelbart for RNA-ekstraksjon for RT-qPCR. For flowcytometrisk analyse av protein ekspresjon og 10 timer etter tilsetning av PBMC for å transwell innsatser, ble 1 pl /ml av Golgi-plugg /Brefeldin A (BD Biosciences) tilsatt for å hemme protein transport. PMA (forbol-12-myristat-13-acetat, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) ble tilsatt til utvalgte brønner som en positiv kontroll samtidig med GolgiPlug. Etter 8 flere timer med inkubasjon ble PBMC høstes og brukes for flowcytometri å oppdage intracellulære cytokiner.
flowcytometrisystemer
For å definere PBMC cellepopulasjoner, ble pasienten blod trukket inn i BD Vacutainer Plus Plastic K
2EDTA samtidig det ble samlet for RNA ekstraksjon. Immuncellepopulasjoner ble preget av flowcytometri følge standard prosedyrer fastsatt av The Valley Hospital Clinical Pathology Laboratory. Flowcytometri ble utført ved hjelp av en Beckman Coulter Cytomics FC500 og CXP cytometer programvare. Dataanalyse ble utført ved hjelp av Kaluza programvare fra Beckman Coulter. Reagensene for strømningscytometri ble anskaffet fra forskjellige kilder: Anti-human-CD11b-PECF594, anti-human-IL8-PE, anti-menneske-CD14-FITC, og anti-human-IL1β-PE fra BD Biosciences; anti-human-CD8-PE-Cy5, anti-menneske-CD56-PE-Cy7, og anti-human-CCI3-PE fra eBioscience (San Diego, CA); anti-human-CD3-ECD og antihuman-CD45-PE-Cy7 fra Beckman Coulter (Brea, CA); anti-human-CD4-FITC og anti-menneske-CD19-PE-Cy5 fra Dako (Carpinteria, CA).
For
in vitro
co-kultur eksperimenter, intracellulære cytokin flekker var utføres etter Cytofix /Cytoperm protokollen fra BD Biosciences. Kort fortalt ble PBMC fra co-kultur eksperimenter høstet, vasket og farget for celleoverflatemarkører. Etter overflaten flekker, ble cellene vasket, fikset med Cytofix /Cytoperm og farget for intracellulær CCI3, IL8, og IL1β. Etter farging ble cellene vasket igjen før analysene.
Statistical Analysis
Forskjeller i gjennomsnitts uttrykk nivåer mellom kreftpasienter og kontrollpasienter og endringer i gjennomsnitts uttrykk nivåer i løpet av tiden var evaluert samtidig ved hjelp av gjentatt tiltak for analyse av varians (ANOVA). Denne type ANOVA står for den samtidige virkning av begge faktorer uttrykk [11]. Sammenligningen av kreftpasienter og kontrollpasienter i det vesentlige evaluerer effekten av tumoren tilstedeværelse på ekspresjonsnivåer, mens vurderingen av uttrykket som en funksjon av tiden evaluerer effekten som gjennomgår en kirurgisk metode, hadde hver pasient i studien.
p-verdier ≤0.05 ble betraktet som statistisk signifikant. IBM-SPSS statistikk programvare (versjon 19) ble brukt for alle statistiske analyser.
Resultater
innledende analyse av plasma fra stadium I lungekreftpasienter for Cytokin protein nivåer
Å vurdere om cytokiner og kjemokiner ble uttrykt forskjellig i plasma fra fase i lungekreftpasienter (n = 15) før og etter (3-7 måneder post-operativt) kurativ reseksjon en human multipleks immunoassay ble anvendt, og resultatene er vist i tabell 1. av de opprinnelige 30 immun cytokin /chemokin /vekstfaktor mål analysert ved Luminex, nivåene av 21 mål var over deteksjonsgrensen i lungekreft pasientenes plasmaprøver (tabell 1), mens uttrykk nivåer av 9 mål (tumornekrosefaktor alfa, IL2, IL4, IL5, IL10, IL13, IL17, granulocytt Makrofagindusert Colony Stimulating Factor, Interferon gamma) var under deteksjonsgrensen i både preoperative og postoperative prøver (data ikke vist).
Identifisering av 5 gener for videre undersøkelser
for å underbygge de første funnene for de 21 målene identifisert av Luminex analysen, og å bidra til å definere mål for videre undersøkelser, avhørt vi en microarray database tidligere generert i vårt laboratorium som sammenligner genekspresjonsmønster i PBMC erholdt fra trinn i lungekreftpasienter før og etter kurativ reseksjon. I likhet med de protein data, genuttrykk for de fleste av disse 21 cytokiner var høyere før kurativ reseksjon av stadium I lungekreft, sammenlignet med etter reseksjon (tabell 1).
Fem cytokiner ble valgt for videre etterforskning av undersøke de innledende screening plasmaproteindata og (mRNA) database microarray parallelt, med fokus på mål som var betydelig opp /nedregulert (p /= 0,05). Som vist i tabell 1, av de fire cytokiner (proteiner) som ble påvist i plasma på de høyeste nivåene
før
å iscenesette jeg lungekreft reseksjon (CCI3 (chemokin med CC motiv ligand 3), IL8 (Interleukin 8), IL6 (interleukin 6), IL1β (interleukin en beta)), tre ble støttet opp av PBMC genuttrykk data fra microarray database (
CCI3, IL8, IL1β
) på mRNA-nivå. Tilsvarende de to cytokiner (proteiner) som ble funnet på de laveste nivåene
før
å iscenesette jeg lungekreft reseksjon (CXCL10 og løselig IL2Rα) ble begge bekreftet av PBMC genuttrykk data fra microarray database. Figur S1 viser grafisk de summerte screening plasmaprotein resultater og PBMC mRNA database funn for de 5 gener valgt for videre studier.
CCI3, IL8, IL1β, CXCL10, etter og
IL2Rα
Bekreftelse av RT-qPCR av forskjellig uttrykt Cytokiner etter reseksjon av Stage jeg Lung Cancer
for å validere og utvide de oppnådde resultatene fra de innledende Luminex og microarray data, ble PBMC genekspresjon evaluert i mye større kohorter av Stage i lungekreftpasienter (n = 62) og kontrollpasienter som gjennomgår thoraxkirurgi for godartede sykdommer (n = 32). Demografiske trekk ved disse to kohorter av pasienter er vist i tabell S2.The fem utvalgte mål gener,
CCI3, IL8, IL1β, CXCL10, etter og
IL2Rα, etter ble ytterligere undersøkt av real- time RT-qPCR analyse. Av de 62 pasientene i lungekreft kohorten som gjennomgikk blodprøvetaking før reseksjon, 58 hadde blod trekkes for analyse under den postoperative perioden, det samme gjorde 16 av de 32 kontrollpasienter. Figur 1 viser de relative endringer i uttrykk oppdaget for de 5 gener i den postoperative perioden for lungekreft og kontrollpasienter. Interessant, PBMC genuttrykk for de tre cytokiner (
CCI3, IL8, IL1β
) påvist i plasma ved forhøyede nivåer
før
til lungekreft reseksjon under den innledende screening ble funnet å være nedregulert
etter
lungekreft reseksjon ved alle tidspunkter. Videre, det samme mønster ble ikke detektert i kontroll pasienter som gjennomgår kirurgi thorax for godartede sykdommer. Endelig PBMC genuttrykk for 2 cytokiner (
CXCL10, IL2Rα
) som ikke ble påvist i plasma ved forhøyede nivåer
før
til lungekreft reseksjon under den innledende screening var ikke signifikant forskjellig
etter
reseksjon (figur 1). Etter analyse av disse data ved hjelp av gjentatte målinger ANOVA, blir det klart at
IL8 Hotell og
IL1β
uttrykk er betydelig nedregulert etter reseksjon av stadium I lungekreft, et funn som ikke er knyttet til effekten av thorax på ikke-cancerpasienter.
CCI3
ser også ut til å bli nedregulert på en lignende måte, i den grad at det nærmer seg statistisk signifikans (figur 2). Videre, flowcytometri av PBMC viser en uniform populasjon av lymfocytt-undertyper i alle pasientkullene, noe som tyder på at endringer i genekspresjon ikke synes å være på grunn av forskjeller i celle representasjon i PBMC-lymfocytt-populasjoner, selv om disse dataene ikke eliminere muligheten av subtile endringer i subpopulasjoner (figur S2).
Genekspresjon i 5 utvalgte cytokiner i PBMC fra trinn i lungekreft (fylte sirkler) og ikke-kreft kontrollpasienter (åpne sirkler) etter operasjonen blir demonstrert. Hver postoperativ punkt representerer den gjennomsnittlige (+/- SEM) fold endring i ekspresjon ved den angitte postoperativ endepunktet sammenlignet med preoperative nivå, uttrykt i log
2 målestokk. Preoperative verdier (preop) er vist som null for referanseformål. Endringer mindre enn null representerer downregulation etter operasjonen. For kreftpasienter, antall sampler som benyttes i beregningene er: preop: n = 58; 3 mnd: n = 48; 6 mnd: n = 43; 9 mnd: n = 40; 12 mnd: n = 40. For kontrollpasienter, antall sampler som benyttes i beregningene er: preop: n = 16; 3 mnd: n = 11; 6 mnd: n = 9; 9 mnd: n = 6; 12 mnd: n = 7.
en gjentatt tiltak variansanalyse ble benyttet for å isolere effekten av nærvær eller fravær av lungekreft på uttrykk for
CCI3 plakater (p = 0,07),
IL8 product: (p = 0,01),
IL1β product: (p = 0,004),
CXCL10 product: (p = 0,4) og
IL2Rα product: ( p = 0,69). Hver søyle representerer den gjennomsnittlige (+/- SEM) i forhold ganger endring for hvert cytokin som omfatter alle postoperative data i forhold til uttrykket før operasjonen, uttrykt i log
2 skala. En negativ relativ ganger endring indikerer downregulation etter stadium I lungekreft reseksjon.
Uttrykk for
CCI3, IL8 Hotell og
IL1β
er høyere i PBMC fra Stage jeg Lung kreft~~POS=TRUNC pasienter~~POS=HEADCOMP sammenlignet med pasienter uten Lung Cancer
for å finne ut om PBMC fra scenen jeg lungekreftpasienter har høyere uttrykk nivåer av
CCI3, IL8 Hotell og
IL1β
enn pasienter uten lunge kreft, ble RT-qPCR resultatene fra de preoperative PBMC-prøver fra fase i lungekreft (n = 62) og styre gruppene (n = 32) sammenlignet. Som vist i figur 3, det betyr uttrykket i lungekreftpasienter var signifikant høyere sammenlignet med kontrollene etter
CCI3
og
IL1β plakater (10 og 29 ganger, henholdsvis). Selv om det ikke er statistisk signifikant, mener uttrykk for
IL8
var seks ganger høyere i lungekreftpasienter i forhold til kontroller. I kontrast, selv om statistisk signifikant,
IL2Rα
uttrykk var bare to ganger høyere i lungekreftpasienter, mens
CXCL10
uttrykk var i hovedsak uendret. Viktigere, på tre og tolv måneder etter operasjonen, uttrykk nivåer synes å utjevne mellom kreft og kontroll gruppene (figur 3).
A. Preoperativ PBMC genuttrykk i fase I lungekreftpasienter (n = 62) sammenlignet med ikke-kreftpasienter planlagt å gjennomgå thoraxkirurgi for benign sykdom (n = 32).
CCI3 product:: p = 0,003;
IL8
: p = 0,23;
IL1β product:: p = 0,05;
CXCL10 product:: p = 0,55;
IL2Rα product:: p = 0,01. B. Tre måneders postoperativ PBMC-genekspresjon i trinn I lungekreftpasienter (n = 48) sammenlignet med ikke-kreft pasienter (n = 11).
CCI3 product:: p = 0,79;
IL8 product:: p = 0,3;
IL1β product:: p = 0,1;
CXCL10 product:: p = 0,8;
IL2Rα product:: p = 0,29. C. tolv måneders postoperativ PBMC-genekspresjon i trinn I lungekreftpasienter (n = 40) sammenlignet med ikke-cancerpasienter (n = 7).
CCI3 product:: p = 0,76;
IL8 product:: p = 0,52;
IL1β product:: p = 0,87;
CXCL10 product:: p = 0,22;
IL2Rα product:: p = 0,58. For alle paneler, representerer hver stang er forholdet mellom den midlere ekspresjonsnivået i kreftpasientene enn den midlere ekspresjonsnivået i kontrollpasienter, uttrykt i log
2 målestokk. En positiv verdi indikerer at uttrykket er høyere i kreftpasienter sammenlignet med kontrollpasienter. To eksempler på t-tester ble brukt for å bestemme betydningen av forskjeller i uttrykket.
Den cytokin profilen til frisk donor PBMC Ligner
in vivo
Funn etter samtidig kultur med lungekreft celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP
for å forlenge analyse av virkningene av lungekreft på PBMC cytokin uttrykk, ble en
in vitro
co-kultur som brukes, som beskrevet i materialer og metoder. To forskjellige humane lungekreft-cellelinjer ble anvendt i de nedre kamre Transwell: A549, en lunge carcinoma cellelinje huse en K-Ras mutasjon og HCC827, en lunge adenokarsinom-cellelinje med en EGFR-mutasjon (E746-A750 del). Som en ytterligere kontroll ble godartede NHBE celler også anvendes i de lavere Transwell kamrene. PBMC, som brukes i de øvre transwells, ble fremstilt fra friske donorer uten kjent lungekreft historie.
Eksponering av sunne donor PBMC for 6 og 18 timer til enten A549 eller HCC827 celler indusert oppregulering av
CCI3, IL8 Hotell og
IL1β
mRNA i en tidsavhengig måte sammenlignet med sham-eksponerte PBMC (4A og 4B). Selv
IL2Rα
mRNA ble også oppregulert, er omfanget langt mindre enn det som ble sett for
IL8 Hotell og
IL1β
. I kontrast,
CXCL10
uttrykk var enten uendret eller nedregulert etter co-inkubasjon med lungekreftcellelinjer. Interessant, dette mønsteret av cytokin genekspresjon ble ikke sett i PBMC co-dyrket med godartet NHBE celler (Figur S3). Videre, de samme buffy coats anvendes for ko-kultur av NHBE celler og PBMC (ikke viser noen cytokinrespons) ble også eksponert for A549 og HCC827 lungekreftceller hvor en reaksjon lik den som er vist i figur 4 ble satt pris (data ikke vist) .
Lungekreftcellelinjer samtidig var dyrket med frisk donor PBMC som beskrevet i materialer og metoder. PBMC genekspresjon og supernatant-proteinnivåer ble evaluert for hver av 5 utvalgte cytokiner. A. genekspresjon i PBMC utsatt for A549 celler. B. genekspresjon i PBMC utsatt for HCC827 celler. For panelene A og B representerer hver bar den midlere (n = 8 friske donorer) relativ gangers endring (+/- SEM) mellom lungekreft celle eksponert PBMC PBMC og utsatt for mediene alene, uttrykt i log
2 målestokk. Lukkede linjene viser 6 timer co-kultur, mens de åpne linjene viser 18 timers co-kultur. C. cytokin protein nivåer i supernatanten løpet co-kultur av A549 celler med frisk donor PBMC. D. Cytokin protein nivåer i supernatanten løpet co-kultur HCC827 celler med frisk donor PBMC. For paneler C og D, representerer hver stolpe er gjennomsnittlig (n = 8 friske donorer) relativ gangers endring (+/- SEM) mellom lungekreft celle utsettes PBMC (18 timer med ko-kultur) og PBMC utsatt for mediene alene, uttrykt i log
2 skala. En prøve t-tester ble benyttet for å bestemme betydningen av den observerte gjennomsnittlige fold endringer. I alle paneler, indikerer en stjerne p 0,05. ND indikerer data under deteksjonsnivå.
For å vurdere cytokin protein nivåer i co-kultur system, ble supernatantene høstet etter 18 timer med co-kultur med lungekreft cellelinjer, og evaluert ved hjelp av Luminex analysen (figur 4C og 4D). Mens IL8, CXCL10 og sIL2Rα konsentrasjoner etterlignet de tilsvarende genuttrykk data (figur 4A og 4B), CCI3 og IL1β nivåer under deteksjonsgrensene i alle prøvene for begge cellelinjer. For å møte denne mangelen på påvisbare CCI3 og IL1β i kultursupernatantene ble PBMC evaluert ved hjelp av flowcytometri for den intracellulære tilstedeværelse av CCI3, IL8 og IL1β. Som vist i figur 5A, intracellulær CCI3, IL8 og IL1β ble detektert i CD3 + fraksjonen (T-celler) av frisk donor PBMC som hadde blitt ko-dyrket med enten lungekreft-cellelinje, men ikke i de som er dyrket i fravær av lungekreft celler. Et lignende resultat ble oppnådd for CD14 + PBMC fraksjon (monocytter), vist i figur 5B. Tvert imot er de CD19 + fraksjon (B-celler), og CD56 + fraksjonen (NK-celler) viste ingen økning i de intracellulære nivåene av disse cytokinene (data ikke vist).
Etter ko-kultur, PBMC ble fiksert og evaluert ved å bruke flowcytometri for intracellulære cytokiner (CCI3, IL8 og IL1β). Vist er en representativ frisk donor (av tre utført). A. CD3 + cellefraksjon. Abscissen representerer CD3 flekker, mens enkelte cytokin farging er reflektert langs koordinere. Prosentandelen av dobbelt fargede celler er avbildet i øvre høyre hjørne av hver underpanelet. B. CD14 + cellefraksjon. Abscissen representerer CD14 flekker, mens enkelte cytokin farging er reflektert langs koordinere. Prosentandelen av dobbelt fargede celler er avbildet i øvre høyre hjørne av hver underpanelet.
Diskusjoner
Rollen av cytokiner i biologi av menneskelig malignitet er kompleks, men mye av interaksjonen mellom tumorceller og vertens immunceller er antatt å være formidlet av denne store familien av proteiner og glykoproteiner [6]. Som et resultat, er det en økende mengde litteratur vurdere serum cytokinnivåer med hensyn til clinicopathologic funksjonene til både hematologisk og faste tumorer, inkludert lungekreft. Mange av disse studiene har imidlertid bare i forhold serum cytokin nivåer av kreftpasienter som hos friske frivillige, med vekt på den potensielle nytten av disse målingene som en biomarkør [12], [13].
