Abstract
Flere studier har ført til økende bevis for å støtte hypotesen om at mirnas spille en sentral rolle i flere prosesser i kreftutvikling, inkludert cellevekst, apoptose, differensiering og metastasering. I denne studien undersøkte vi den potensielle rolle MIR-31 i tykk- og endetarmskreft (CRC) aggressivitet og dens underliggende mekanismer. Vi fant ut at Mir-31 økte i CRC celler stammer fra metastaser og humane primære CRC vev med lymfeknutemetastaser. Videre høyt nivå uttrykk for MIR-31 var signifikant assosiert med en mer aggressiv og dårlig prognostisk fenotype av pasienter med CRC (
p
0,05). Den stabile over-uttrykk for MIR-31 i CRC celler var tilstrekkelig til å fremme cellevekst, invasjon, og migrasjon
in vitro
. Det tilrettelagt tumorvekst og metastase
in vivo
også. Videre studier viste at Mir-31 kan direkte binde til 3’untranslated regionen (3’UTR) av SATB2 mRNA og senere undertrykke både mRNA og protein uttrykk for SATB2. Ektopisk uttrykk for SATB2 av transient transfektert med pCAG-SATB2 vektor som koder for hele SATB2 kodende sekvensen kan reversere effekten av MIR-31 på CRC tumorigenesis og progresjon. I tillegg har ektopisk over-uttrykk for MIR-31 i CRC celler indusert epitelial-mesenchymale overgang (EMT). Våre resultater viste at oppregulering av MIR-31 spilte en viktig rolle i CRC celleproliferasjon, invasjon og metastase
in vitro Hotell og
in vivo
gjennom direkte undertrykkende SATB2, noe som tyder på en potensiell anvendelse av MIR-31 i prognose prognose og terapeutisk anvendelse i CRC
Citation. Yang MH, Yu J, Chen N, Wang XY, Liu XY, Wang S, et al. (2013) Forhøyet mikroRNA-31 Expression Regulerer Colorectal Cancer Progresjon ved å undertrykke sitt mål Gene SATB2. PLoS ONE 8 (12): e85353. doi: 10,1371 /journal.pone.0085353
Redaktør: Fazlul H. Sarkar, Wayne State University School of Medicine, USA
mottatt: 02.08.2013; Godkjent: 25 november 2013; Publisert: 30.12.2013
Copyright: © 2013 Yang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Natural Science Foundation National of China (No. 81000953, 81172242, 81071735), Store prosjekter av National Natural Science Foundation of China ((Nei. 81090422), State Key Program of National Natural Science Foundation of China (U1201226), National Basic Research Program of China (973 Program, nr 2010CB529402), Key Program av National Natural Science Foundation i Guangdong, Kina (2010B031500012) og Natural Science Foundation i Guangdong, Kina (10451051501004710) National. De bevilgende myndighet hadde noen rolle i studiedesign , datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
konkurrerende interesser:. Alle forfatterne har lest avisen og godkjent for å sende det til PLoS ONE forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer..
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP (CRC) er en av de vanligste kreftformene i verden. Selv om flere typer behandlinger har nylig blitt utviklet for pasienter med CRC, fortsetter dårlig prognose for å være i pasienter med fremskreden CRC [1]. De fleste CRC dødsfall har vært forbundet med tumorinvasjon og metastasering. Så, forstå de underliggende molekylære mekanismene for CRC metastaser er av avgjørende betydning i utviklingen av terapeutiske strategier for avanserte CRC pasienter.
microRNAs (mirnas) er en rikelig klasse av svært konservert, kort, regulatoriske (ca 22 nt) ikke-kodende RNA som er mye uttrykt i levende organismer. De bindes til 3’UTR av mRNA, forårsaker enten mRNA-molekyl degradering eller translasjonsbevegelse inhibering [2]. mirnas har ulike funksjoner, inkludert regulering av cellulær differensiering, proliferasjon og apoptose [3,4]. Derfor har mange studier har rapportert sentral rolle miRNAs i flere prosesser i kreftutvikling, inkludert metastase [3,5,6]. Videre analyser uttrykk har avslørt karakteristiske miRNA signaturer i bestemte kreft hos mennesker [7-9].
Flere forskere rapporterte at Mir-31 oppregulert i CRC [10-12] og plateepitelkarsinom tungen [13], men nedregulert i brystkreft [14], magekreft [15], ondartet mesothelioma [16] og bukspyttkjertelkreft [17] med QRT-PCR. Men, den kliniske prognostisk betydning, funksjon og regulatoriske aktiviteten av MIR-31 i Barnekonvensjonen er ikke helt forstått ennå. I denne studien utforsket vi utvetydig rolle MIR-31 i barnekonvensjonen og fant at oppregulering av MIR-31 var assosiert med aggressiv fenotyper av CRC og dårlig prognose for pasienter. Videre undersøkelser viste at over-uttrykk for MIR-31 i CRC ført til økt tumor celleproliferasjon og motilitet
in vitro Hotell og
in vivo
. Denne studien avgjør en positiv rolle MIR-31 i kreftutvikling, invasjon, og migrasjon, via undertrykke SATB2 uttrykk i CRC.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
Bruk av vev for denne studien er godkjent av etisk komité av Nanfang Hospital, Southern Medical University. Alle pasientene signert informert samtykke før bruk av disse kliniske materialer for forskningsformål. Denne studien ble utført i henhold til anbefalingene i Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr av National Institutes of Health. Protokollen ble godkjent av komité for etikk av dyreforsøk av Southern Medical University (Permit Number: SYXK2011-0074). Alle operasjoner ble utført under natrium pentobarbital anestesi, og alle anstrengelser ble gjort for å minimere lidelse.
Tissue forberedelse og cellekultur
Frisk og formalinfikserte, parafininnstøpte, prøver kolorektal kreftvevet var innhentet fra pasienter med diagnosen primær CRC og deretter gjennomgikk elektiv kirurgi i Nanfang Hospital, Southern Medical University (Guangzhou, Kina). Bruken av vev for denne studien er godkjent av etisk komité av Nanfang Hospital, Southern Medical University. Hele 31 tilfeller av frisk CRC vev ble ferskt frosset i flytende nitrogen og lagret ved -80 ° C inntil videre anvendelse. Og 143 tilfeller av arkiv CRC vevsprøver ble samlet inn og brukt i clinicopathological og prognostisk undersøkelse av MIR-31. Ingen pasienter mottatt noen preoperativ kjemoterapi eller strålebehandling. Et omfattende sett med clinicopathological data ble besatt, inkludert alder, kjønn, størrelse av primærtumor, tumor differensiering, T scenen, lymfeknutemetastaser og fjernmetastaser. Komplett oppfølging, alt fra 1-96 måneder, var tilgjengelig for kohort av 143 pasienter, og median overlevelse var 56 måneder.
Den menneskelige embryonale nyreceller 293T og de menneskelige CRC cellelinjer DLD-en , HCT116, SW480, SW620, Lovo ble oppnådd fra en celle bank ved Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Kina). I tidligere studier har vi beskrevet en subklon heter M5 med forbedrede metastatisk evner i leveren. Vi har også beskrevet en subklon heter SCP 51 med høye metastatisk evner i leveren og lymfeknute. Disse subkloner ble isolert ved
in vivo
utvalg av SW480-celler gjennom en prosess som er beskrevet i tidligere studier [18-20]. Alle CRC-cellelinjer ble dyrket i RPMI 1640 medium (Gibco, Gaithersburg, MD, USA) med 10% føtalt bovint serum (HyClone, Logan, USA) og 100 U /ml penicillin /streptomycin (Gibco). De ble holdt i et fuktet kammer med 5% CO
2 ved 37 ° C. 293T ble opprettholdt i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) supplert med 10% FBS.
RNA isolering og kvantitativ real-time PCR
Total RNA ble ekstrahert med TRIzol Reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA. ). cDNA ble syntetisert med PrimeScript RT reagent Kit (Promega, Madison, WI, USA). En stamme-løkken kvantitativ RT-PCR ble utført for å påvise ekspresjon av modent MIR-31 med ABI TaqMan
® mikroRNA Assay Kit (Applied Biosystems, Foster City, USA) og genspesifikke primere (Applied Biosystems, Foster City , USA) ved hjelp av en ABI 7500 real-Time PCR system. Analysen ble utført i tre eksemplarer for hvert tilfelle for å tillate for vurdering av teknisk variasjon.
In situ hybridisering og evaluering av farging av MIR-31
In situ hybridisering (ISH) ble utført i henhold til produsentens protokoll (Exiqon, Vedbæk, Danmark). Parafin-embedded seksjoner (4 mikrometer tykke) ble deparaffinized med xylen og rehydrert med fortynnet etanol av reagenskvalitet. Objektglassene ble behandlet med proteinase K ved 37 ° C i 20 minutter. Deretter ble de prehybridisert i en hybridiserings-oppløsning ved 50 ° C i 2 timer. Deretter ble 40 nM av en låst nukleinsyre-modifisert, 5 «digoksigenin (DIG) -merket oligonukleotid-probe av HSA-MIR-31 eller en kryptert kontroll sonde (Exiqon) ble tilsatt til hybridiseringsoppløsningen og hybridisert ved en temperatur på 50 ° C natten over. Et alkalisk fosfat-konjugert anti-DIG-antistoff (Roche, Mannheim, Tyskland) ble brukt. Etter å ha blitt vasket i fargeløsning, ble seksjonene inkubert i NBT /BCIP utviklende oppløsning (Roche) ved 37 ° C i 15 til 30 minutter. Deretter ble de kontra med atom rask rødt.
For å vurdere pasientenes kliniske kjennetegn, de ISH farget vevssnitt ble anmeldt og scoret separat av to blindet patologer. Farging for MIR-31 ble vurdert ved hjelp av en forholdsvis enkel, reproduserbar scoring metoden [21,22]. På en skala fra 0 til 3, ble den fargeintensitet poeng som følger: negativ (ingen farging, 0), svak (lys blå, 1), middels (blå, 2), eller sterk (mørk blå, 3). Graden av farging er definert som prosentandelen av positive flekker områder av tumorceller eller normale colonic epitel-celler i forhold til hele tumorområdet eller hele seksjonen for normale prøver. Graden av farging ble scoret på en skala fra 0 til 4, som følger: 0, 0%; 1, 1-25%; 2, 26-50%; 3, 51-75%; og 4, 76-100%. Summen av flekker intensitet og farging-grad score ble anvendt som sluttfarging score for MIR-31 (0-7). For statistisk analyse, ble en endelig farging score på ≥ 3 anses å være høy.
Vector forberedelse
En 184-bp DNA fragment som tilsvarer forhånds MIR-31 ble valgt, og flanke -sekvensen ble amplifisert og klonet inn i pLVTHM lentiviral vektor (https://www.addgene.org/Didier_Trono) for å generere PLV-MIR-31 ekspresjonsvektor. pLVTHM lentiviral vektor kodes forbedret grønt fluorescerende protein (EGFP) som er optimalisert for lysere fluorescens og større uttrykk i pattedyrceller. Den tidligere beskrevne vektor pCAG-SATB2 [19] ble brukt til å oppregulerer ekspresjonen SATB2.
full-lengde 3’UTR av SATB2 (2711bp) ble klonet og deretter settes inn i nedstrøms luciferasereportergenet av pGL3-kontroll Vector (Promega, Madison, WI, USA). Dette ble gjort for å generere pGL3-SATB2-3’UTR. To antatte MIR-31 bindingsseter på 3’UTR av SATB2 ble seterettet og muterte, henholdsvis ved hjelp GeneTailor seterettet mutagenese System (Invitrogen). Alle plasmider ble verifisert ved sekvensering. Alle primer sekvenser for gjenkjenning og miRNA sekvenser er vist i tabell S1.
Lentivirus produksjon og infeksjon
viruspartikler ble høstet 48 timer etter PLV-MIR-31 transfeksjon med konvolutten plasmid pMD2.G og emballasjen vektor psPAX2 inn 293T celler ved hjelp lipofektamin 2000 reagens (Invitrogen ). CRC-celler ble infisert med de rekombinante lentivirus-overførende enheter pluss 8 mg /ml polybrene (Sigma, St. Louis, Missouri, USA) og deretter underkastet FACS-analyse for GFP uttrykk for å oppnå CRC-celler med stabil over-ekspresjon av MIR-31. Den tomme lentiviral vektor pLVTHM ble brukt som kontroll (MIR-con).
oligonukleotid transfeksjon
MIR-31 etterligner og antisense-hemmere som inneholder 2′-OMe (
O
metyl) modifikasjoner ble syntetisert ved GenePharma (Shanghai, Kina). Oligonukleotid transfeksjon ble utført med Lipofectamine 2000 reagens (Invitrogen).
Luciferase reporter analysen
I nærvær av enten MIR-31 eller MIR-con, Firefly luciferase konstruksjon ble ko-transfektert med en kontroll
Renilla
luciferase vektor pRL- CMV (Promega) inn SW480 celler. En dobbel luciferase-analyse (Promega) ble utført 48 timer etter transfeksjon. Forsøkene ble utført in triplo uavhengig av hverandre.
celle proliferasjonsanalyse og cellesyklusanalyse
Cellene ble sådd ut i 96-brønners plater ved 2 x 10
3 per brønn. Celleproliferasjon ble evaluert ved hjelp av celletelling Kit-8 (CCK-8, Dojindo, Rockville, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. For celle-syklusanalyse, ble cellene sådd ut i 6-brønners plater ved 5 x 10
5 per brønn. Den cellesyklusfordelingen ble analysert ved hjelp av propidiumjodid (Sigma-Aldrich) farging og flowcytometri [23].
kolonidannelse assay
Cellene ble sådd ut i 6-brønners plater ved 2 x 10
2 per brønn og opprettholdt i RPMI1640 inneholdende 10% FBS i 2 uker. Etter 2 uker ble cellene vasket to ganger med PBS, fiksert med metanol og farget med 0,5% krystallfiolett. Antallet kolonier ble tellet under et mikroskop [24].
sårtilheling og invasjon analyser
Cell migrasjon ble vurdert ved å måle bevegelse av celler i en skrapt, acellulær området skapt av en 200 mL pipette tube, og spredning for sårheling ble observert etter 0 og 48 timer, henholdsvis. Fotografier ble tatt med for å vurdere nivået på migrasjon i hver gruppe av transfekterte celler. Migrering ble kvantifisert ved å telle det totale antall celler som migrerte mot det opprinnelige sår feltet. For invasjon analysen, ble Matrigel-belagte kamre (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) som inneholder 8 mikrometer porer brukt. Celler ble sådd ut i de øvre kamre (belagt i matrigel) på 2 x 10
5-konsentrasjon i serumfritt medium. Det nedre kammer i transwell ble fylt med vekstmedium inneholdende 10% FBS som en chemo-lokkemiddel. Etter at kamrene ble inkubert ved 37 ° C i 48 timer, ble ikke-invaderte celler på toppen av transwell skrapes av med en bomullsdott. Vellykket translokerte celler ble fiksert med 10% formalin. Deretter ble de farget med 0,1% krystallfiolett i 30 minutter og tellet under et lysmikroskop.
In vivo
funksjoner assays
Balb /C-nu /nu athymiske nakne mus (4-6 uker gamle) ble kjøpt fra Forsøksdyr Centre of Southern Medical University. Musene ble holdt under patogen frie forhold i en 12 timers mørke /lys syklus og
ad libitum
tilgang til mat og filtrert vann. Dyr som brukes til eksperimentering mottatt human behandling. For tumorvekstanalyse, totalt 2 x 10
6 celler av SW480 med stabil over-ekspresjon MIR-31, eller kontrollcellene, ble injisert subkutant i venstre og høyre flanke av mus (n = 6 per gruppe). Deretter, fluorescens avgitt av celler ble oppsamlet og bilder ble analysert gjennom en hel-legeme GFP avbildningssystem (Lighttools, Encinitas, CA) som kunne visualisere sanntidstumorvekst. Tumorstørrelse ble målt ved hjelp av digitale calipers hver tredje dag. Etter 30 dager med overvåking, ble musene avlivet ved cervikal dislokasjon og tumorer ble dissekert. Tumorvolumet ble beregnet som følger:. Volum = (D x d
2) /2, hvor D medførte den lengste diameter og d menes den korteste diameter
For etablering av metastaserende modell, mus cecum ble exteriorized etter laparotomi henhold natrium pentobarbital anestesi (6 mg /100 g kroppsvekt). De subkutane svulster ble terninger i 1 mm
3 kuber og implantert i mesentery på cecum terminus av mus. Deretter ble tarmen returnert til bukhulen og lukket med kirurgiske forheng. Elektriske varmeflasker ble brukt til å hjelpe postoperative utvinning for mus etter xenografter implantasjon. Dyrehelsestatus ble overvåket etter operasjonen daglig, inkludert deres fysiske aktivitet, hydrering, spise og drikkevaner og ambulation. Kroppsvekt av kontroll og SW480 /MIR-31 mus ble også registrert hver tredje dag. Humane endepunkter hadde vært planlagt i slutten av eksperimentet, og som et middel til å gjenoppleve smerte eller ubehag. En integrert kriterium for behovet for å eutanasi ble gjennomført i vår studie, inkludert fysisk underskudd, sykdom, nød, immobilitet, vekttap og maksimal tumorstørrelse. Når de dukket tydelig fysisk underskudd, for eksempel tørre eller sløve øyne, klebrig slimhinner, krum, bevegelse og reduksjon, sett bort fra observatøren, dyspné eller kakeksi, ble musene anses å oppfylle kriteriene for aktiv dødshjelp, og ble ofret for å redusere lidelse og nød. Ved slutten av eksperimentet (8 uker), ble fortsatt i live musene avlivet ved cervikal dislokasjon. Organene ble fjernet og fiksert med 10% nøytral bufret formalin. Deretter ble påfølgende vevssnitt innhentet og farget med hematoksylin-eosin (H E) for å observere de metastatiske knuter av organer i henhold mikroskop. Alle eksperimentelle prosedyrer ble utført i henhold til anbefalingene i Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr av National Institutes of Health. Protokollen ble godkjent av komité for etikk av dyreforsøk av Southern Medical University. Alle nødvendige tiltak ble iverksatt for å redusere lidelse og nød til musene.
Western blot-analyse
Protein lysater ble separert ved 10% SDS-PAGE-gel-elektroforese og overført til PVDF-membran (Amersham Pharmacia Biotech, NJ, USA). Membranen ble analysert med følgende antistoffer: anti-SATB2 (Abcam, Cambridge, UK), anti-E-cadherin (Cell Signaling Technology, Inc), anti-N-cadherin (Cell Signaling Technology), anti-vimentin (Cell Signaling Technology), og anti-β-catenin (Cell Signaling Technology). Til slutt ble membranen probet med HRP (pepperrotperoksidase) -merket geite-antimuse-IgG (Santa Cruz Biotechnology, USA) og detekteres av kjemiluminescens. Et polyklonalt anti-β-aktin-antistoff (Santa Cruz Biotechnology) ble anvendt som en protein-lastekontroll. Intensiteten av proteinfragmenter ble kvantifisert med nummer én-programvaren (4.5.0 basic, Bio-Rad).
Immunohistochemistry (IHC)
vevsblokker ble kuttet i 4 mikrometer seksjoner og behandles for IHC i samsvar med en tidligere beskrevet protokoll [19].
Statistisk analyse
Alle statistiske analyser ble utført ved hjelp av SPSS 16.0 statistiske programvarepakken. I minst tre uavhengige eksperimenter, ble dataene presentert i form av gjennomsnitt ± SEM. Forskjeller mellom variabler ble vurdert av følgende tre statistiske tester: χ
2 test, Fishers eksakte test, eller Enveis ANOVA. For pasienter med ulike nivåer av MIR-31 uttrykk, ble overlevelseskurver plottet ved hjelp av Kaplan-Meier metoden og sammenlignet med log-rank test. Multivariat overlevelse analyse ble utført på alle parametere som ble funnet å være signifikant i univariat analyse ved hjelp av Cox regresjonsmodellen. En
p
verdi mindre enn 0,05 ble ansett som statistisk signifikans.
Resultater
MIR-31 ble oppregulert med metastatisk CRC celler og humane primære CRC vev med lymfeknute metastaser
Vi først undersøkt MIR-31 uttrykk av en stilk-løkke kvantitativ RT-PCR i et panel av CRC cellelinjer og 31 par av CRC og tilstøtende ikke-neoplastiske slimhinner vev. Resultatene viste at MIR-31 var bemerkelsesverdig oppregulert i CRC vev sammenlignet med tilstøtende ikke-neoplastiske normale vev (
p
= 0,0004, figur 1A). Det ble observert at den opp-regulering av MIR-31 i tumorprøver var forbundet med lymph node-metastasering i betydelig utstrekning (
p
= 0,0045, figur 1B). Hos pasienter med lymfeknutemetastaser, den relative gjennomsnittet uttrykk for MIR-31 var over 7,82 ganger høyere enn hos pasienter uten metastaser (61,54 ± 16,68
vs
.7.87 ± 2.47). I tillegg var MIR-31 lav i SW480 og DLD-1 celler, som stammer fra primære tumorer, mens det var forholdsvis høy i SW620, Lovo, M5 og SCP51 celler, som stammer fra metastaser (figur 1C), særlig i M5 og SCP51 cellelinjer, som har høy metastatisk potensial mellom CRC-cellelinjer. Denne foreningen indikerte at Mir-31 kan godt ha en sentral rolle i CRC metastaser.
(A) Expression nivåer moden MIR-31 i paret CRC og tilstøtende normalt vev. (B) Den MIR-31 uttrykk i CRC vev med eller uten metastaser i forhold til kamp normalt vev. nmCRC betegner CRC vev uten metastaser; mCRC betegner CRC vev med lymfeknutemetastaser. (C) Uttrykk for MIR-31 i CRC cellelinjer og subkloner. miRNA overflod ble normalisert til U6 RNA. (D) Expression analyse av MIR-31 i normal kolorektal slimhinne og CRC vev av
i
situ
hybridisering. (A) Negative uttrykk for MIR-31 i normal kolorektal slimhinne; (B) Lav uttrykk for MIR-31 i CRC vev; (C, d) Høy uttrykk for MIR-31 i CRC vev; (E) negativ kontroll; (F) Kaplan-Meier-analysen for overlevelse av pasienter med CRC ifølge MIR-31 ekspresjon. Logg Rank = 6,682,
p
= 0,010.
Over-uttrykk for MIR-31 var assosiert med en aggressiv fenotype og dårlig prognose for pasienter med CRC
for ytterligere å undersøke clinicopathological og prognostisk betydning av MIR-31 nivåer, målte vi MIR-31 uttrykk i en stor kohort av 143 arkivert parafin-embedded CRC og normal kolon vev ved hjelp av ISH. Vi observerte at 75/143 (52.45%) CRC hadde høy grad uttrykk MIR-31, mens 11/55 (20%) normal slimhinne vev hadde høy grad uttrykk for MIR-31 (
p
0,001). Den korrelasjonsanalyse mellom clinicopathological egenskaper og MIR-31 nivå viste høyt nivå uttrykk for MIR-31 var signifikant assosiert med T-stage (
p
= 0,045), lymfeknutemetastase (
p
= 0,001), og fjern metastase (
p
= 0,026) hos pasienter med CRC, men ikke forbundet med alder, kjønn, tumorlokalisering, tumorstørrelse og tumordifferensieringsgrad (
p
. 0.05, tabell 1)
Kjennetegn
n
MIR-31 uttrykk
lav (%)
høy (%)
P
verdi
Kjønn Male8739 (44,83) 48 (55.17) 0,416 Female5629 (51.79) 27 (48.21) Alder (år) 506535 (53.85) 30 (46.15) 0,169 ≥507833 (42.31) 45 (57.69) Tumor nettstedet Proximal colon4220 (47.62) 22 (52,38) 0,369 Distal colon3721 (56.76) 16 (43.24) Rectum6427 (42.19) 37 (57.81) Tumor størrelse (cm i diameter) 54519 (42.22) 26 (57,78) 0,387 ≥59849 (50.00 ) 49 (50,00) Tumor differensiering Good136 (46.15) 7 (53.85) 0,979 Moderate10450 (48.08) 54 (51.92) Poor2612 (46.15) 14 (53,85) T-stage1-22316 (69,57) 7 (30,43) 0,045 38740 (45.98) 47 (54.02) 43 312 (36,37) 21 (63,63) N-stage05938 (64.41) 21 (35,59) 0,001 1-28430 (35.71) 54 (64,29) Distant metastasis09451 (54.26) 43 (45.74) 0,026 14 917 (34,69) 32 (65.31) Tabell 1. sammenheng mellom clinicopathological funksjoner og uttrykk av MIR-31.
CSV ned CSV
for å evaluere den prognostiske verdien av MIR-31 for CRC, analyserte vi sammenhengen mellom MIR-31 uttrykk og overlevelse varighet ved hjelp av Kaplan -Meier analyse med log-rank test. Resultatene viste at høyt nivå uttrykk for MIR-31 ble korrelert med kort overlevelse av pasienter med CRC (51,85 ± 3,78
vs
.76.64 ± 4,30,
p
= 0,010, figur 1D ). Videre indikerte multivariat Cox regresjonsanalyse som høyt nivå uttrykk for MIR-31 er en uavhengig prognostisk faktor for dårlig overlevelse av pasienter med CRC (tabell 2).
Variabler
Univariat analyse
Multivariatanalyse
P
verdi
HR
95% konfidensintervall
P
verdi
HR
95% konfidensintervall
Gender0.516 0,826 0.464-1.471Age0.391 0,785 0.451-1.366Tumor site0.915 0,982 0.707-1.365Tumor size0.581 1.190 0.642-2.207Tumor differentiation0.074 1,648 0.953-2.850T-stage0.001 2,262 1.419-3.6060.032 1,695 1.045-2.750 N-stage0.041 1,563 0.846-2.7280.604 0,847 0.453-1.586M-trinns 0.0014.338 2,441 til 7,707 0.0013.563 1.940-6.545miR-31 expression0.012 2,145 1.182-3.8900.048 1,877 1.007-3.488Table 2. Total overlevelse analyser av univariate og multivariate COX regresjonsanalyse.
CSV ned CSV
Exogenetic over-uttrykk for MIR-31 forfremmet CRC celler vekst, invasjon, og migrasjon
in vitro
for å undersøke mulighetene biologiske funksjonen til MIR-31 i CRC tumorigenesis og progresjon, ble SW480 og DLD-1 celler infisert med PLV-MIR-31 eller PLV-con, henholdsvis. Dette ble gjort for å etablere to stabile MIR-31-overekspresjon cellelinjer og to mock cellelinjer (MIR-con). En økt ekspresjon av MIR-31 ved infeksjon i to cellelinjer ble bekreftet ved sanntids RT-PCR (figur 2A). Som vist i figur 2B-2D, over-ekspresjon av MIR-31 økte kreftcellevekst og dens evne til å danne kolonier enn det i mock-celler og villtype ikke-infiserte celler (
p
0,001 ). Flowcytometri og cellesyklusanalyse viste en signifikant reduksjon i prosentandelen av celler i G1 /G0 fase (
p
= 0,004 i SW480
, p
= 0,008 i DLD1) og en økning i S-fasen av CRC celler behandlet med MIR-31 (
p
= 0,002 i SW480
p
= 0,001 i DLD1, figur 2E).
(A) Real-time RT-PCR analyse av MIR-31 uttrykksnivået i SW480 og DLD-1 celler etter ektopisk over-uttrykk for MIR-31. (B, C) Effekt av MIR-31 på celleformering ble målt ved hjelp av CCK-8-analyse. (D) Sammenligning av kolonidannelse virkning av CRC-cellelinjer. (E) Cell-syklus fordeling av CRC-celler infisert med MIR-31 ble detektert ved strømningscytometri-analyse. (F, G) Effekter av MIR-31 utenfor livmoren over-uttrykk på celle motilities og invasivitet ble fastsatt ved bruk sårhelende (F) og matrigel invasjon (G) analyser. Resultatene ble presentert som gjennomsnitt ± SD. Resultatene var reproduserbare i tre uavhengige forsøk. *
p
0,05, **
p
. 0,001
Etter å observere Mir-31-mediert vekst aggrandizement, effekten av MIR-31 på invasiv kapasitet på CRC celler ble preget av såret-healing og matrigel invasjon analysen. Resultatene indikerte at exogenetic uttrykk for MIR-31 i CRC celler forårsaket en betydelig økning i celle migrasjon ved hjelp av en sårhelende assay (
p
= 0,001 i SW480
, p
0,001 i DLD1, figur 2F). Matrigel invasjonen assay også illustrert at overuttrykk av MIR-31 markert indusert invasivitet av CRC celler (
p
0,001 i både SW480 og DLD1, figur 2G). Resultatene indikerte at overuttrykk av MIR-31 var tilstrekkelig til å fremme både celleproliferasjon og migrasjon
in vitro
.
MIR-31 tilrettelagt CRC celler tumorvekst og metastase
in vivo
Siden Mir-31 fremmer vekst, migrasjon, og invasjonen av CRC celler
in vitro
, fristet vi å finne ut om Mir-31 kunne legge til rette for tumorvekst og metastase
in vivo
. For dette formål, SW480 celler med stabil over-ekspresjon MIR-31 (SW480 /MIR-31) og kontrollcellene (SW480 /MIR-con) ble inokulert subkutant i nakne mus. Som vist i figur 3A, hastigheten av tumorvekst i SW480 /mir-31 gruppen var signifikant enn den for SW480 /mir-con gruppe (
p
0,05, figur 3A og 3B). IHC farging viste at svulstene i kontrollgruppen viste mye lavere Ki-67-indeksen enn for MIR-31 over-uttrykk gruppe (Figur 3B).
(A) Eksterne hele kroppen fluorescens bilder av SW480 /MIR -31 og SW480 /MIR-con mus og tumorer (øvre) og bilder av subkutan svulst i mus (lavere) ble oppnådd. Pilene viser subkutane kreft. (B) Representative fotografier av H E farging viste tydelig invasjon i tarmveggen og metastasering av magen, pessar, bukvegg, lever, lymfeknuter, og lunge i SW480 /MIR-31cells grupper (
p
0,05, Figur 3D og 3E ). I tillegg ble det avdekket at Mir-31 over-uttrykk ført til kortere samlet overlevelses tider av dyr (
p
0,05, figur 3F)
Hemming av MIR-31 redusert. vekst, invasjon, og migrering av CRC celler
in vitro
for å bekrefte effekten av MIR-31 på modulere ondartede fenotyper av CRC celler, undersøkte vi også endring av aggressive fenotyper av CRC celler etter redusert uttrykk av MIR-31. MIR-31-spesifikk hemmer transfeksjon ble ansatt for å hemme MIR-31 uttrykk i M5 og SW620 celler, som hadde høy endogen MIR-31 uttrykk. Som vist i figur 4A, når sammenlignet med kontrollcellene, ble en betydelig langsommere spredning hastighet observert i MIR-31-inhibitor-transfekterte celler (
p
0,001). Videre Matrigel invasjon og sårhelende analyser bekreftet at inhiberingen av MIR-31 ekspresjonen reduserte invasivitet og migrasjon av M5 og SW620-celler, sammenlignet med kontrollceller (
p
0,05, 4B og 4C ).
(A) Hemming av MIR-31 hemmet celle spredning av M5 og SW620 celler ved CCK8 analysen. *
p
*
p
