Abstract
I noen esophageal kreftpasienter, kan strålebehandling ikke hindre fjernmetastaser noe som resulterer i dårlig overlevelse . Den underliggende mekanismen for metastaser hos disse pasientene er ikke godt etablert. I denne studien har vi vist at ioniserende stråling kan forårsake epitelial-mesenchymale overgang (EMT) sammen med økt celle migrasjon og invasjon gjennom nedregulering av fosfatase og tensin homolog (PTEN), og aktivering av Akt /GSK-3β /Snail signalering. Vi utviklet en radioresistant (RR) esophageal squamous kreftcellelinje, KYSE-150 /RR, ved fraksjonert ioniserende stråling (IR) behandling, og bekreftet sin radioresistance bruker en klonogene overlevelse analyse. Vi fant at den KYSE-150 /RR-cellelinjen viste typiske morfologiske og molekylære karakteristika EMT. I forhold til foreldre celler, KYSE-150 /RR celler viste en økning i post-IR koloni overlevelse, migrasjon, og invasivitet. Videre ble det observert en reduksjon i PTEN i KYSE-150 /RR-celler. Vi postulerte at over-uttrykk for PTEN kan indusere mesenchymale-epitel overgang i KYSE-150 /RR celler og gjenopprette IR-indusert økning av cellemigrasjon. Mekanistisk inhiberer fraksjonert IR ekspresjon av PTEN, noe som fører til aktivering av Akt /GSK-3β signalering og er assosiert med forhøyede nivåer av sneglen protein, en transkripsjonsfaktor involvert i EMT. Tilsvarende behandling med LY294002, en phosphatidylinositol-3-kinase inhibitor, hermet PTEN overekspresjon effekt i KYSE-150 /RR celler, videre foreslå en rolle for Akt /GSK-3β /Snail signalering i effekter mediert gjennom PTEN. Sammen utgjør disse resultatene sterkeste at fraksjonert IR-mediert EMT i KYSE-150 /RR cellene er gjennom PTEN-avhengige veier, fremhever en direkte proinvasive effekten av strålebehandling på kreftcellene
Citation. Han E, Pan F, Li G, Li J (2015) Oppdelte Ioniserende stråling Fremmer epitelial-Mesenchymale Overgang i human Esophageal kreft celler gjennom PTEN Deficiency-mediert Akt Activation. PLoS ONE 10 (5): e0126149. doi: 10,1371 /journal.pone.0126149
mottatt: 27 oktober 2014; Godkjent: 29 mars 2015; Publisert: May 22, 2015
Copyright: © 2015 Han et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. forskningen ble støttet av general Financial Grant fra Kina Postdoktor Science Foundation (til JL, Grant No. 2013M542451) (https://jj.chinapostdoctor.org.cn/V1/Program1/Info_Show.aspx?InfoID=270124f8-9c55-4916-ab8d-1ee53c952329). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Esophageal kreft er en av de mest utfordrende formene for kreft på med den åttende høyeste dødeligheten blant alle krefttilfeller over hele verden. [1] det er den fjerde mest diagnostisert kreft og den fjerde største årsaken til kreftdød i Kina. [2] esophageal plateepitelkarsinom (ESCC) er den viktigste histopatologiske subtype av esophageal kreft i Kina. Strålebehandling er bærebjelken i behandlingen av ESCC, men lokal svikt har vært en stor utfordring, med vedvarende eller tilbakevendende sykdom som blir rapportert i ca 40-60% av pasientene. [3] En undergruppe av esophageal kreftpasienter ikke klarer å svare på strålebehandling på grunn til fremveksten av radioresistant (RR) tumorceller. Det kliniske forløpet hos disse pasientene er preget av hyppige tilbakefall og fjernt metastatiske lesjoner. Gransker de underliggende mekanismene som er involvert i utviklingen av RR kreftceller er av stor betydning for å studere effekten av strålebehandling på ESCC.
Epitelial-mesenchymale overgang (EMT) er en prosess der differensierte epitelceller gjennomgå bemerkelsesverdige morfologiske endringer fra en epitelial brostein fenotype til en langstrakt fibroblastisk fenotype [3], som er karakterisert ved redusert ekspresjon av epitel-markører som E-cadherin og økt ekspresjon av mesenchymale markører så som vimentin og N-cadherin. [4] for tiden EMT har vært innblandet i to av de viktigste prosessene som er ansvarlige for kreftrelatert dødelighet dvs. invasjon og progresjon til fjernt metastatisk sykdom, og oppkjøpet av terapeutisk motstand. [5] Nyere studier tyder på at EMT spiller en avgjørende rolle i utviklingen av kreft radioresistance. Stråling-mediert EMT har vært mye studert i ulike typer svulster, både
in vitro Hotell og
in vivo
, for eksempel colorectal, cervical, bryst og lungekreft. [6-10] Men forblir den nøyaktige rolle EMT og de underliggende mekanismene som er involvert i utviklingen av radioresistance i spiserørskreft som skal belyses.
fosfatase og tensin homolog (PTEN) er en viktig tumor-suppressor genet, som er en negativ regulator av fosfatidylinositol-3-kinase (PI3K) -Akt veien, for derved å delta i reguleringen av cellesyklusen, proliferasjon, apoptose, celleadhesjon, og EMT under embryonal utvikling og progresjon av kreft. [11, 12]. Det har blitt rapportert at den reduserte ekspresjon av PTEN, post-IR, induserer radioresistance gjennom fremme celleproliferasjon og hemming av celle apoptose i ikke-småcellet lungekreft og nasofaryngeal karsinom. [13, 14] Direkte gjenopprette PTEN funksjon har tidligere vært rapportert å være en verdifull tilnærming for å oppnå bestrålingssensibilisering
in vitro
. [15] Men om PTEN deltar i stråle utløst EMT og metastase i ESCCs er ennå ikke klart.
Derfor, denne studien, hypotese vi rollen PTEN i utviklingen av stråling-indusert EMT i ESCC. Vi undersøkte om (i) bestråling kunne forbedre invasivitet av ESCCs ved å fremkalle EMT, (ii) PTEN mangel var involvert i stråleindusert EMT, og (iii) stråling-indusert EMT var gjennom aktivering av Akt /GSK-3β /Snail signale .
Materialer og metoder
Material
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium ble hentet fra Gibco (Life Technologies Corporation, IN), Fetal bovin serum (FBS) ble kjøpt fra HyClone (Thermo, MA). Antistoffer for PTEN, E-cadherin, N-cadherin, Slug, sneglen, vimentin, Akt, fosforylert Akt (p-Akt), GSK-3β, phosphorylatedGSK-3β (p-GSK-3β) og pepperrot (HRP) -konjugert sekundært antistoff ble kjøpt fra CST (Cell Signaling Technology, MA). Den PI3K inhibitor, LY294002, ble kjøpt fra Sigma (Sigma-Aldrich, MO). GoScript Reverse Transcription System og GoTaq qPCR Master Mix Kit var fra Promega (Promega, WI).
Cell linje og cellekultur
Menneskelig ESCC cellelinje, KYSE-150 (JCRB1095, levert av Dr . Fangfang Bu) [16, 17], ble dyrket i RPMI 1640 medium med 10% FBS og 100 enheter av penicillin-streptomycin og inkubert ved 37 ° C med 5% CO
2 i en fuktet inkubator. Før kultur, ble KYSE-150 cellelinje godkjent av kort tandem repeat profilering (Beijing Microread Gene Technology Co, Kina).
Fraksjonert ioniserende stråling (FIR) behandling [18]
KYSE -150 celler ble dyrket i 25 cm
2 kolber. På å oppnå ca 75% samløpet, ble cellene bestrålt med en Gy av X-ray i romtemperatur ved hjelp av Hitachi MBR-1520-R irradiator (Hitachi Medical Corporation, Tokyo, Japan) ved en dose på 4.73Gy /min, og cellene ble returnert til inkubatoren umiddelbart etter bestråling. Cellene ble sub-dyrket inn i nye kolber på ca 90% samløpet. Denne prosessen ble gjentatt for å oppnå eksponering for stråling ved en dose på 1 Gy, 3 ganger; 2 Gy, 3 ganger; og 4 Gy, 7 ganger, og hver eksponering var i et intervall på tre dager; med den totale dosen være 37 Gy over en to måneders periode. Flere kloner ble isolert fra celler og RR individuelt dyrket. De parentale celler ble behandlet ved bruk av samme fremgangsmåte, bortsett fra at de ikke var bestrålt. Klonogene analyser ble anvendt for å bestemme motstandsnivå og et RR klon angitt KYSE-150 /RR er valgt for vårt eksperiment.
klonogene overlevelsesanalyse
sperre og RR-celler ble sådd ut på seks-brønns platene 500, 1000, 2000, 3000, 4000 celler per brønn. Tjuefire timer senere ble cellene behandlet med en enkelt dose av stråling (0, 2, 4, 6, eller 8Gy henholdsvis). Celler ble returnert til inkubatoren umiddelbart etter bestråling for å tillate kolonier til å danne. Etter 14 dager ble kolonier fiksert med metanol og farget med krystallfiolett. Kolonier som inneholder 50 celler ble talt under mikroskopet. Gjenlevende fraksjon, (SF) ble beregnet som antall kolonier /(Cells Seeded x Plating Efficiency). En overlevelseskurve ble utledet ved bruk av GraphPad Prism 5,0. Hvert eksperiment ble gjentatt minst tre ganger.
Plasmid konstruksjon og transfeksjon
Rekombinant plasmid pcDNA3.0-PTEN ble konstruert ved innsetting av humant PTEN cDNA i pcDNA3.0 vektor (Invitrogen, CA ) med primere som følger: forover, 5 «cggggtaccccggccaccATGACAGCCATCATCAAAGAGATC 3» (understreket Kpn1 + Kozak), og omvendt, 5 «ccgctcgagcggTCAGACTTTTGTAATTTGTGTATGC 3» (understreket Xho1). KYSE-150 /RR celler ble transfektert med pcDNA3.0-PTEN eller pcDNA3.0 vektor kontroll. Alle transfections ble utført ved hjelp av ScreenFectA Transfeksjon reagens (InCellA, Egggenstein-Leopoldshafen, Tyskland) i henhold til produsentens anvisninger. Transfekterte celler ble analysert ved Western blotting, eller kvantitativ revers transkripsjon-polymerasekjedereaksjon (RT-qPCR).
RNA-interferens-analyse
KYSE-150-celler, som ikke ble bestrålt, ble transfektert med 100 nmol av små interfererende RNA (siRNA) -PTEN eller nontargeting egge-siRNA hjelp ScreenFectA Transfeksjon reagens i henhold til produsentens anvisninger. siRNA-PTEN ble syntetisert ved å bruke følgende sekvens: 5′-GGGCCAGGTCATAAATAAT-3 «; mens den egge-siRNA-sekvensen var som følger: 5»-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 «
Western blot-analyse
Cellene ble lysert i natriumdodecylsulfat (SDS) lysebuffer, og ble homogenisert. protein utvinning. Like mengder av protein fra hvert lysat ble separert ved SDS-PAGE (10% akrylamid) og blottet på PVDF Western blotting-membraner (Millipore Corporation, Massachusetts). Dette ble etterfulgt av inkubasjon med primære antistoffer mot PTEN, E-cadherin, N-cadherin, Slug, sneglen, vimentin, Akt, p-Akt og glyseraldehyd 3-fosfat dehydrogenase (GAPDH, som lasting kontroll), og HRP-konjugert sekundært antistoff . Blottet signaler ble deretter visualisert med forsterket kjemiluminescens (Thermo, MA).
RNA-ekstrahering og RT-qPCR-analyse
Total RNA fra dyrkede celler, etter forskjellige behandlinger, ble ekstrahert med TRIZOL-reagens ( life Technologies Corporation, IN) i henhold til produsentens instruksjoner. Ett mikrogram av total RNA ble brukt for revers transkripsjon. En mikroliter av det totale revers transkripsjon produkt ble tilsatt til sanntids-qPCR blanding (20 ul) inneholdt 10 ul 2 x GoTaq qPCR Master Mix og primere (følelse og anti-sense, 1 ul) for å bestemme mRNA ekspresjon av human PTEN, E -cadherin, N-cadherin, Snail, Slug, vimentin og β-aktin. Genet ekspresjon av mRNA fra hver prøve ble beregnet ved normalisering med β-aktin. Alle primere ble utformet ved hjelp av IDT PrimerQuest Input programvare (tabell 1). Prøvene ble amplifisert med en precycling hold ved 95 ° C i 30 s, 40 sykluser av gløding og forlengelse ved 60 ° C i 34 sek. Hver måling ble utført i tre eksemplarer med ApplidBiosystems 7500 StepOne Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Inc., CA) og analysert ved hjelp av Applied Biosystems 7500 programvare v2.0.1.
Migrasjon og invasjon analysen
De migrasjon analysene ble utført i en 24-brønns transwell kammer som inneholder polykarbonat filtre med 8-mikrometer porer (Corning, Acton, MA). En total på 500 ul medium inneholdende 20% FBS som kjemotaktisk faktor ble tilsatt til det nedre kammer, og deretter 1 x 10
5 celler i hver gruppe i serumfritt DMEM ble tilsatt til det øvre rom av kammeret og inkubert i 24 timer. Den øvre overflaten av kammeret ble så skrapet for å fjerne ikke-migrerende celler. Migrerte celler ble farget med 0,1% krystallfiolett og fotografert under et lysmikroskop (x 100). Kamrene ble vasket med 100 ul 10% eddiksyre, og OD ble målt ved 560 nm farget celle elueringsmiddel. Hver gruppe ble fremstilt i tre duplikate brønner. For invasjon assay, et transwellsystem belagt med 2 mg /ml av basalmembran, Matrigel, (Corning, Acton, MA) ble anvendt. Resten av fremgangsmåten var lik den migrasjon analyse som beskrevet ovenfor
sårhelende assay
Cellene ble sådd ut i 12-brønners plater og dyrket til 40% konfluens.; den konfluent cellemonolaget ble oppskrapt med en 20 ul pipette for å frembringe en vertikal linje over midten av brønnene. Spredningen av sårheling ble observert etter 0 og 24 timers intervall, og ble fotografert ved hjelp av et lysmikroskop.
Statistisk analyse
Forskjeller ble evaluert ved Students t-test for sammenligning av to grupper. Data ble uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik (SD). En
P
verdien av 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
Effekt av bestråling på mobilnettet morfologi og EMT markører
Etter to måneder. av FIR med en total dose på 37 Gy, ble subkloner isolert og navngitt KYSE-150 /RR-celler, og deres RR karakter ble demonstrert ved klonogene celleoverlevelsesanalyse. Fig 1A viser at KYSE-150 /RR-celler som overlevde i lengre tid sammenlignet med foreldreceller.
(A) Radiation celleoverlevelseskurvene og de klonogene figurer av styre KYSE-150 celler uten bestråling og radioresistance subklon KYSE-150 /RR celler. (B) Morfologi av KYSE-150 og KYSE-150 /RR-celler ble undersøkt med fasekontrastmikroskopi. (C) Uttrykk for EMT markører (E-cadherin og vimentin) og transkripsjons repressors av E-cadherin (Snail og Slug) ble oppdaget av QRT-PCR, data vist som gjennomsnitt ± SD, *
P
0,05. Data representerer middel med standardavviket fra tre uavhengige eksperimenter. (D) Representative vestlige blotter av E-cadherin, vimentin, Snail og Slug var viste.
RR cellene demonstrert morfologiske endringer. Kontroll KYSE-150 celler (KYSE-150 Ctrl) hadde en epitel-lignende morfologi, med stram celle-celle sammen og brostein-lignende utseende (figur 1B venstre). De KYSE-150 /RR-celler utviklet en spindellignende morfologi, med økt dannelse av pseudopodia og tap av celle-til-celle kontakt, noe som er karakteristisk for mesenchymale fenotype (Fig 1B høyre). Gevinsten av disse morfologiske funksjoner i RR underlinjer kan antyde overfor sine forvandlet egenskaper, for eksempel migrasjon og invasjon. [19]
For å bekrefte om dette fenotype endringen ble tilskrevet EMT, mRNA og protein uttrykk for EMT- tilhørende genene ble oppdaget av QRT-PCR og Western blot. KYSE-150 /RR-celler viste at nedregulering av epiteliale markør E-cadherin, og oppregulering av mesenchymale markør vimentin, sammenlignet med KYSE-150 Ctrl celler (figur 1C og 1D). Snail og Slug, negative regulatorer av E-cadherin, var avgjørende for EMT. [19] I KYSE-150 /RR celler, ble både sneglen og Slug betydelig økt på proteinnivå (figur 1D), men ble ikke endret på mRNA nivå (figur 1C). Disse resultater viser at bestråling er tilstrekkelig til å indusere EMT i ESCC cellelinje.
Virkningene av bestråling på cellemigrering og invasjon
Tumorceller som gjennomgår EMT har økt cellemigrering og invasjon evne. For å undersøke om KYSE-150 /RR celler vise slike egenskaper, vurderte vi det migrasjon og invasjon evne KYSE-150 Ctrl og KYSE-150 /RR celler
in vitro
. Sårhelende analysen viste at KYSE-150 /RR celler hadde betydelig raskere nedleggelse av sår området sammenlignet med KYSE-150 Ctrl celler (figur 2A). Celle migrering og invasjon av KYSE-150 /RR-celler ble funnet å være økt med 50% og 33% henholdsvis, sammenlignet med KYSE-150 Ctrl celler (figur 2C). Representative bilder for migrering og invasjon egenskaper fra hver av cellelinjen er vist i figur 2B.
(A) KYSE-150-celler ble underkastet en sårhelende assay med eller uten stråling ved 100 x forstørrelse. Representative bilder ble fotografert rett og 24 timer etter scratch. (B) Representative bilder av migrasjon analysen og invasjon analysen av KYSE-150 celler med eller uten stråling ble fotografert etter 24 timer med krystallfiolett flekken. (C) Oppsummering grafer for migrasjon og invasjon (data vist som gjennomsnitt ± SD, *
P
0,05).
PTEN-mangel er nødvendig for bestråling-indusert EMT
det er rapportert at ekspresjon av PTEN er redusert i RR tumorceller. [13, 14] Vi undersøkte mRNA og protein ekspresjon av PTEN i KYSE-150 Ctrl og KYSE-150 /RR-celler. Våre resultater viste at stråling betydelig redusert ekspresjon av PTEN både på mRNA og proteinnivåene (fig 3A). For å fastslå effekten av PTEN mangel på celle migrasjon og EMT, siRNA målretting av PTEN ble brukt (figur 3B venstre). Migrering og invasjon assay viste at knockdown av PTEN resulterte i en klar vandrende fenotype i KYSE-150-celler sammenlignet med kjøretøyets transfekterte celler (figur 3D). Western blot viste at KYSE-150-siPTEN celler utstilt tap av celle adhesjon markør E-cadherin og høyde i mesenchymale differensiering markør vimentin (Fig 3C venstre).
(A) stråling reduserer uttrykk for PTEN i betydelig kese-150 /RR celler uansett i mRNA nivå (data presentert som gjennomsnitt ± SD, **
P
0,01) og proteinnivå (representative vestlige blotter). (B) Den transfekterte effektiviteten av siPTEN i KYSE-150 (til venstre) og pcDNA-PTEN i KYSE-150 /RR celler (høyre) (data presentert som gjennomsnitt ± SD, **
P
0,01) . (C) Representative western blot-analyse viste at ekspresjon av PTEN, E-cadherin og vimentin i KYSE-150-celler transfektert med siPTEN eller vehikkel, eller KYSE-150 /RR-celler transfektert med pcDNA-PTEN eller pcDNA3.0. Viste data representerer tre ulike eksperimenter. (D) Representative bilder av migrasjon og invasjon analysen av KYSE-150 celler transfektert med siPTEN eller bilen etter 48 timer (til venstre); Sammendrag grafer er for migrasjon og invasjon (høyre, data vist som gjennomsnitt ± SD, *
P
0,05). (E) Representative bilder av migrasjon analysen og invasjon analysen av KYSE-150 /RR celler transfektert med pcDNA-PTEN eller pcDNA3.0 ble fotografert etter 24 timer med krystallfiolett flekk (til venstre); Oppsummering grafer for migrasjon og invasjon (høyre, data vist som gjennomsnitt ± SD, *
P
0,05). siPTEN er en forkortelse for siRNA-PTEN.
Vi brukte en vektor koding PTEN (Fig 3B høyre), for å bekrefte rollen PTEN i stråleindusert EMT og tumormetastaser. Vi fant at overekspresjon av PTEN forårsaket KYSE-150 /RR-celler til å gjenopprette ekspresjon av E-cadherin og redusere ekspresjonen av vimentin (figur 3C høyre). Videre er økt migrasjon og invasjon evner KYSE-150 /RR celler ble betydelig hemmet av overekspresjon av PTEN (Fig 3E). Dataene indikerer at PTEN mangel er nødvendig for stråleindusert EMT og vandrende /invasiv fenotype.
PTEN redusert Snail uttrykk gjennom aktivering av PI3K /Akt /GSK-3β signale
sneglen og Slug er transkripsjons repressors som spiller viktige roller i metastase ved downregulating E-cadherin. [19] som nevnt tidligere, ble sneglen og Slug oppregulert i KYSE-150 /RR celler på proteinnivå, men ikke på mRNA nivå. For å avgjøre om forhøyet uttrykk av sneglen og Slug skyldtes PTEN mangel på bestråling, endret vi PTEN uttrykk ved trans med siRNA mot PTEN eller PTEN ekspresjonsvektor, og deretter Western blot ble utført for å bestemme uttrykket av sneglen og Slug. Som vist i figur 4A, sneglen ekspresjon betydelig øket i KYSE-150 Ctrl-siPTEN-celler sammenlignet med KYSE-150 Ctrl-siCtrl celle, mens den ble redusert i KYSE-150 /RR-pcDNA-PTEN-celler sammenlignet med KYSE-150 /RR-pcDNA celler. I kontrast, ble uttrykk for Slug ikke vesentlig endret på PTEN uttrykk. Videre QRT-PCR viste ingen signifikant endring i sneglen mRNA-nivåer (figur 4B). Disse resultatene tyder på at oppregulering av sneglen ved bestråling skyldes nedgangen i PTEN nivåer.
(A) Uttrykk for sneglen og Slug oppdaget av western blot analyse i KYSE-150 celler transfektert med siPTEN eller kjøretøy, eller KYSE-150 /RR-celler transfektert med pcDNA-PTEN eller pcDNA3.0. (B) Expression of Snail ble oppdaget av QRT-PCR, data vist som gjennomsnitt ± SD. (C) Representative western blot-analyse viste at ekspresjon av Akt, p-Akt, GSK-3β og p-GSK-3β. Viste data representerer tre ulike eksperimenter. siPTEN er en forkortelse for siRNA-PTEN. (D) Representative western blot-analyse viste at ekspresjon av Akt, p-Akt, GSK-3β, p-GSK-3β, sneglen og E-cadherin i KYSE-150 /RR-celler med eller uten fosfatidylinositol 3-kinase (PI3K) inhibitor, LY294002 (40 mm).
Aktivering av PI3K /Akt /GSK-3β vei fremstår som et sentralt trekk ved EMT, med GSK-3β regulerer Snail uttrykk gjennom posttranslational modifisering. [20, 21] Vi hypotese om PTEN regulerer Snail uttrykk gjennom PI3K /Akt /GSK-3β sti i ESCC celler. Som vist i figur 4C, fosforylering av Akt og GSK-3β ble oppregulert i KYSE-150 /RR-celler, men ikke i KYSE-150 Ctrl celler. Og knockout av PTEN faktisk lettet fosforylering av Akt i KYSE-150 Ctrl legemer, ledsaget av en økning i fosforylering av GSK-3β (fig 4C, midten). I kontrast, overekspresjon av PTEN hemmet Akt og GSK-3β fosforylering i KYSE-150 /RR-celler (fig 4C, høyre). For å fremlegge bevis for PTEN-avhengig hemming av PI3K /Akt /GSK-3β signale videre, den PI3K inhibitor, LY294002, ble brukt til å etterligne effekten av PTEN overekspresjon i KYSE-150 /RR celler. LY294002 (40 pM) hemmet Akt og GSK-3β fosforylering in KYSE-150 /RR-celler, og ekspresjon av sneglen ble nedregulert og at av E-cadherin-protein ble oppregulert (figur 4D). Disse resultatene tyder på at PTEN mangel aktiverer Akt /GSK-3β /Snail sti ved bestråling.
Diskusjoner
Strålebehandling er en effektiv behandling for kreftfaren selv på et avansert stadium. Det gjenstår imidlertid tilbakefall og metastaser på grunn av utvikling av radioresistance blant tumorceller en stor utfordring. Tidligere studier har vist at RR fenotype var korrelert med flere faktorer, inkludert endringer i cellesykluskontrollpunkter, redusert vekst, redusert og apoptose. [22, 23] Epithelial mesenchymale overgang er også tenkt å være regulert ved eksponering for stråling. Akkumulerte bevis indikerer at ioniserende stråling er en av de indusere av EMT, som har vist seg å skje ved tidspunktet for initiering av metastasering, som fører til kreft progresjon, og er assosiert med utvikling av resistens overfor radioterapi i oral, bryst og lunge cancer . [6, 7, 24]
for å undersøke klinisk radioresistance har regimer med FIR blitt brukt
in vitro
å bestemme molekylære mekanismene bak radioresistance. I denne studien utviklet vi KYSE-150 /RR-celler avledet fra kloner som hadde overlevd etter FIR behandling, [18], som hensiktsmessig etterligner radioterapi motstand i ESCC. KYSE-150 celle er en mye brukt spiserørskreft cellelinje for studiet av stråling motstand i spiserørskreft. [18, 25-27] KYSE-150-cellelinjen ble utviklet av Dr. Yutaka Shimada i 1991 fra den dårlig differensiert ESCC resektert fra øvre spiserøret av en 49 år gammel japansk kvinne som får strålebehandling. [16] Derfor denne cellelinjen kan enkelt endres til en RR cellelinje. Vi fant at fenotypen til KYSE-150 /RR-celler byttet fra en epitelial morfologi til en mesenchymale morfologi etter bestråling. Samtidig gjennomførte vi migrering og invasjon analyse og funnet at migrering og invasjon evne KYSE-150 /RR-celler ble øket sammenlignet med foreldreceller, noe som tyder på at EMT er involvert i utvikling av radioresistance og metastase i ESCC.
En viktig steg i EMT er nedregulering av E-cadherin. E-cadherin reguleres enten av transkripsjonsfaktorer, slik som snegle-relaterte zink-finger transkripsjon repressorer (snegle og Slug), SIP-1 /ZEB–2 og grunnleggende helix-loop-helix transkripsjonsfaktor, Twist, eller ved ubiquitylation-indusert endocytose. I vår studie fant vi FIR økt uttrykk av både Snail og Slug på proteinnivå og ikke endre sin mRNA uttrykk. Ektopisk overekspresjon av Snail fører også til anskaffelse av økt motstand mot apoptose og kreft stamcellelignende egenskaper i ulike epitelceller. [28] Aktivering av sneglen og Slug kan være en av mekanismene som er involvert i utviklingen av radioresistance i ESCC etter strålebehandling .
Aktivering av protein kinase B (Akt) pathway spiller en sentral rolle i de tre store radioresistance mekanismer, som er iboende radioresistance; tumor-celle-proliferasjon og hypoksi. PTEN, som en inhibitor for Akt, er rapportert å assosiere med radiosensitiviteten. Det er blitt rapportert at ekspresjon av PTEN ble redusert i RR-celler av magesekken [15] og nasofaryngeal [14] karsinom, i mellomtiden, mens andre synes PTEN å være avgjørende for dempning av invasjon og EMT. [11, 29] Vi har funnet uttrykk av PTEN å bli nedregulert etter FIR, og overekspresjon av PTEN restaurert fenotypen av KYSE /150 /RR celler fra mesenchymale morfologi til epitelial morfologi, sammen med redusert migrasjon og invasjon.
for å undersøke hvilken rolle videre PTEN i strålings-utløste EMT, Akt /GSK-3β /sneglen sti ble studert, som tidligere er blitt implisert i utviklingen av strålings-indusert lunge-kreft. [10, 30] Vi antok en rolle for PTEN som fører til øket E -cadherin uttrykk via Akt /GSK-3β /Snail veien. Aktiv GSK-3β kan fosforylere Snail å lette sin degradering, [20, 21] omvendt inaktivering av GSK-3β kan stabilisere Snail. [30] Våre data viste at overekspresjon av PTEN kan dempe strålingen-indusert ekspresjon av sneglen via defosforylering av Akt i KYSE-150 /RR celler, som akselererte den nedregulering av p-GSK-3β og fremmet Snail degradering. Snail, som en av transkripsjons repressors av E-cadherin, ved å bli nedregulert forårsaket oppregulering av E-cadherin uttrykk. For ytterligere å påvise involvering av PI3K /Akt /GSK-3β signalering i et PTEN avhengig måte, PI3K-inhibitor, LY294002, ble anvendt for å etterligne virkningen av PTEN overekspresjon i KYSE-150 /RR-celler. LY294002 hemmet Akt og GSK-3β fosforylering i KYSE-150 /RR celler, og uttrykk for sneglen ble nedregulert og E-cadherin protein ble oppregulert. Vurderes samlet, tyder dataene på at nedregulering av PTEN er knyttet til inaktivering av GSK-3β, og PTEN-avhengige PI3K /Akt /GSK-3β signalering er nødvendig å oppregulere Snail for stråleindusert EMT å utvikle seg i ESCCs.
vimentin, en viktig cytoskeletal komponent av mesenchymale celler, blir ofte brukt som en markør for EMT i løpet av metastatisk progresjon. Det har blitt rapportert at blokkering av PI3K /Akt signaliserer svekket vimentin uttrykk i muntlige carcinoma celler. [31] I vår studie, vimentin var oppregulert i KYSE-150 /RR celler (figur 1D) og overekspresjon av PTEN inaktivert PI3K /Akt signalisering som fører til nedregulering av ekspresjon vimentin i disse cellene (figur 1C). Dette tyder på at PTEN-mangel er nødvendig for stråling-indusert EMT. Det er bemerkelsesverdig at Slug, annen E-cadherin transkripsjon repressor, er oppregulert i strålings (Fig 1 D); imidlertid, ble Slug nivåer ikke funnet å være påvirket av PTEN ekspresjon (Fig 4A). Dette funnet viser at stråling-indusert EMT er en kompleks prosess og andre veier kan også være involvert.
Vår undersøkelse har belyst detaljene i EMT sti i stråling utløst ESCC (fig 5). Denne studien understreker viktigheten av PTEN som et potensielt terapeutisk mål. Den nedregulering av PTEN og oppregulering av PI3K veien utløst av stråling fremkaller kaskader fører til EMT. Alle disse effektene sammen bidra til metastase og tilbakefall etter strålebehandling. Derfor foreslår vi at PTEN mangel etterkant strålebehandling for kreftfaren spiller en viktig rolle i utviklingen av RR tumormetastaser. Således kan overekspresjon av PTEN vise seg å være en nyttig strategi for å hindre kreftcelleinvasjon og metastase som kan utvikle seg etter at radioterapi i ESCC.
PTEN fungerer som et oppstrøms regulator av PI3K /Akt /GSK-3β signale nettverk for å fremkalle de kaskader av EMT. Slug regulerer E-cadherin uttrykk i en PTEN selvstendig måte.
