Abstract
Serine /treonin kinase 31 (STK31) er en av de nye kreft /testis antigener som sine biologiske funksjoner forblir i stor grad uklart. Her viser vi at STK31 er overuttrykt i mange menneskelige kolorektal kreft cellelinjer og vev. STK31 co-lokaliserer med pericentrin i centrosomal regionen i alle faser av cellesyklusen. Interessant, når celler gjennomgå mitose, STK31 lokaliserer også til sentromerer, sentral spindel, og midbody. Denne lokalisering virkemåten er lik den for kromosomale passasjerproteiner, som er kjent for å være viktige spillere av spindelenheten sjekkpunkt. Ekspresjon av STK31 er cellesyklusavhengig gjennom regulering av en antatt D-boksen nær sin C-terminale region. Ectopically-uttrykte STK31-GFP øker cellemigrering og invasive egenskaper uten å endre formeringshastigheten av kreftceller, mens knockdown ekspresjon av endogen STK31 av lentivirus-avledet shRNA resulterer i mikrotubuli-monteringsfeil som forlenger varigheten av mitose og fører til apoptose. Til sammen tyder våre resultater at den avvikende ekspresjon av STK31 bidrar til tumorgenisitet i somatiske kreftceller. STK31 kan derfor fungere som en potensiell terapeutisk mål i humane somatiske kreft
Citation. Kuo PL, Huang YL, Hsieh CC-J, Lee JC, Lin BW, Hung LY (2014) STK31 er en celle-syklus regulert Protein som bidrar til tumorigenitet av epithelial kreftceller. PLoS ONE 9 (3): e93303. doi: 10,1371 /journal.pone.0093303
Redaktør: Cayetano Gonzalez, forskning biomedisin, Spania
mottatt: 30 desember 2013, Godkjent: 03.03.2014; Publisert: 25 mars 2014
Copyright: © 2014 Kuo et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd NSC101-2325-B-006-001 og NSC102-2325-B-006-001 fra National Science Council, gi IBMs-CRC100-P01 fra Academia Sinica, Prosjekt å fremme faglig dyktighet og utvikle forskning i verdensklasse Centers , og Center for Infectious Disease og signal Transduksjon Research, National Cheng Kung University. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Celledeling i pattedyrceller er regulert av et antall proteinkinaser som styrer progresjon gjennom ulike faser av cellesyklusen. Tidligere studier indikerte at misregulation av cellesyklus kinaser kan resultere i ubegrenset spredning og avvikende deling av celler som fører til genomisk ustabilitet, som begge er kjennetegnene på kreftutvikling [1], [2]. Akkumulert bevis indikerer at mitotiske kinaser er ansvarlig for å beskytte cellene mot kromosomavvik og Aneuploidy. Mitotiske kinaser som Polo-liknende kinaser (Plks) og Aurora kinaser er involvert i regulering av sentrosomen syklus og mitotisk spindel formasjon. Når bipolar spindel er dannet, er spindelenheten sjekkpunkt (SAC) proteiner som Bub1 og BubR1 nødvendig for å sikre riktig bipolar orientering av søsterkromatider og riktige forbindelser mellom kinetochores og spindel mikrotubuli [2]. Endringer i signalveier involvert i disse mitotiske kinaser kan resultere i en avkjørsel fra mitose med en følgelig avvik kromosom nummer, som fører til Aneuploidy og til slutt kreft [3].
sentrosomen har vært ansett som en viktig komponent i dyr celledeling. Det består av to Sentrioler med et ortogonalt arrangement er omgitt av elektron-tette pericentriolar materiale (PCM) [4], [5]. Mange centrosomal proteiner som ligger i PCM har blitt oppdaget, og de spiller viktige roller som er sterkt korrelert med centrosomal funksjoner [6]. Disse centrosomal proteiner kan deles inn i forskjellige klasser i henhold til deres funksjoner. Den første klassen består av proteiner som tjener som stillas for montering av andre proteiner, og således er nødvendig for å opprettholde strukturen av sentrosomen. Det er også en gruppe av proteiner som fungerer i microtubule kjernedannelse. Endelig er mange regulatoriske molekyler, inkludert kinaser, fosfataser og signalmolekyler, implisert i cellesyklusregulering [7]. Flere linjer av bevis indikerer at den avvikende ekspresjon av centrosomal proteiner eller sentrosomen dysfunksjon kan knyttes til tumorgenese [8] – [10].
Målretting av mitotiske kinaser har vært ansett som en meget vellykket strategi for anticancer-behandling [11 ], [12]. Små molekylære hemmere rettet mot CDK har Aurora kinaser, eller Plks blitt undersøkt for deres evne til å avbryte utviklingen av kreft [13] – [16]. Disse hemmende forbindelser viser effekt
in vivo
på menneskelige tumorxenotransplantater, og noen av dem blir nå undersøkt i kliniske studier [17]. På den annen side, kreftterapi involverer immunterapi ved bruk av T-celler, som gjenkjenner cancerantigener, er blitt en lovende tilnærming kreftbehandling [18], [19]. Således, er identifisering av nye tumorantigener og tumor-spesifikke T-celle epitoper nyttige i kreftimmunterapi. Én gruppe av tumorantigener kalles kreft /testis antigener (oppfordringer), dets ekspresjon normalt være begrenset til testis [20]. Immunogene kreftvaksiner rettet mot CTAs ikke utgjør en betydelig risiko for bivirkninger fordi deres uttrykk er begrenset til mannlige kjønnsceller, et immunologisk privilegert sted i kroppen, og dermed er ideelle mål for behandling av kreft.
Vår forrige rapport indikerte at
serin /treonin kinase 31
(
STK31
) mRNA nivå i testikkelvevet pasienter uten modne kjønnsceller er betydelig lavere enn for normale menn [21]. En tidligere rapport viste at STK31 er en roman CTA [22]. Her undersøker vi involvering og fysiologiske rollen til STK31 i kreftutvikling. Vi fant at STK31 lokaliserer til sentrosomen gjennom alle faser av cellesyklusen. Under mitose, STK31 aksjer tilsvar subcellulære lokalisasjoner med mitotiske kinaser Aurora-B Plk1. Den cellesyklusavhengig ekspresjon av STK31 styres av ubiquitin-proteasom-degradering. Nedbryting av STK31 påvirket microtubule monteringsprosessen under inter, noe som tyder på sin potensielle rolle i microtubule kjernedannelse. I tillegg er en mangel av STK31 forsinkelser mitotisk progresjon, resulterer i en manglende å gå ut fra mitose, og fører til apoptose. Til sammen vår studie gir en potensiell kreft terapeutisk strategi som kan bli vurdert for fremtidige søknader.
Materialer og metoder
pasientprøver
Menneske kolorektal kreft vev ble oppnådd i samsvar med Helsinkideklarasjonen. Studien ble godkjent av Institutional Review Board of National Cheng Kung universitetssykehus. Den skriftlig informert samtykke fra donor ble lagret i databasen National Cheng Kung universitetssykehus og brukes til forskning.
plasmider, cellelinjer og Transfeksjon
Menneskelig STK31 full lengde cDNA ble klonet inn i vektor pEGFP -N1. AZ521, en human kolorektal kreft cellelinje, ble dyrket i DMEM-medium (Sigma) pluss 10% MEM (GIBCO) og 1% NEAA (Bio-vest). HCT116, en human kolorektal kreft cellelinje, ble opprettholdt i RPMI-1640 medium (GIBCO). Alle media ble supplert med 10% FBS (Bioscience), 100 enheter /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin (GIBCO). For transient transfeksjon ble cellene dyrket opp til 80% samløpet og transient transfektert med STK31-GFP hjelp Lipofectamine 2000 (Invitrogen) i henhold til produsentens protokoll.
Lentiviral Short-hårnål RNA (shRNA) Transfeksjon
pLKO.1 Mission kort RNA (shRNA) vektorer mot
STK31 plakater (TRCN0000003274, TRCN0000003275, TRCN0000003276, og TRCN0000028838-A4, TRCN0000028841-B4, TRCN0000028758-F3, TRCN0000028817-G1, TRCN0000028819-H2) var hentet fra National RNAi Kjerne Facility (Institute of Molecular Biology /Genomisk Research Center, Academia Sinica, Taiwan). Effektiviteten av
STK31
shRNA ble overvåket av både Immunoblot og Q-PCR-analyse (Tall S2A og S2B). For STK31 knockdown ble celler dyrket til 80% konfluens og infisert med
STK31
shRNAs ved en multiplisitet av infeksjon (MOI) på fire supplementert med 8 ug /ml polybrene (Sigma). Etter 48 timer på infeksjon, ble 1 pg /ml puromycin (Sigma) tilsatt til vekstmedium for valg. Etter ytterligere 48 timers dyrkning ble cellene samlet opp for total RNA rensning eller totalt cellelysat ekstraksjon.
Western Blot analyse og antistoff
Cellelysater ble fremstilt i lyseringsbuffer (150 mM NaCl, 1% NP40, 0,5% Na-deoksycholat, 1 mM EDTA, og 50 mM Tris-HCl; pH 7,4) med tilsetning av 1X protease inhibitor cocktail (Roche Molecular Diagnostics) og 1X fosfatase-inhibitor cocktail (P0044, Sigma). Anti-α-tubulin (DM1A), anti-γ-tubulin (GTU88), anti-actin, anti-GAPDH, anti-cyclin B, anti-fosfo-histon-3 /serin-10, og anti-A-B Aurora-antistoffer ble innkjøpt fra Sigma. Anti-myc antistoff ble oppnådd fra Invitrogen. Anti-pericentrin (Ab4448) ble kjøpt fra Abcam. Anti-GFP antistoff (JL-8) ble kjøpt fra Clontech.
Real Time PCR og primere
Total RNA ble ekstrahert ved hjelp Trizol reagens (Invitrogen) i henhold til produsentens illustrasjonen. Revers transkripsjon ble utført med 1 pg av total RNA ved hjelp av Improm-II revers transkriptase (Promega). Sanntids-PCR ble utført ved anvendelse av SYBR fordel qPCR premix (Bio-Rad) i en CFX96 Real-Time System og C1000 Thermal Cycler (BIO-RAD), og reaksjonen ble utført ved bruk av følgende betingelser i 44 sykluser: 95 ° C i 15 s, 60 ° C i 10 s, og 72 ° C i 5 sek. Sekvensene til primerne som anvendes er som følger: forover primer og revers primer til humant
STK31
er henholdsvis 5′-CAGGACCAGAAACTGATTGAAG-3 «og 5′-TCCATTCAAAGAAGCTGGAGTAG-3»,. Sanntids fluorescens overvåking og smeltekurve analyse ble utført med Bio-Rad i henhold til produsentens anbefalinger (Bio-Rad). Data ble analysert ved Bio-Rad CFX Manager versjon 1.5 for å fastslå terskelen syklus (
Cp
) over bakgrunnen for hver reaksjon. Den relative mengde av mål-genet ble normalisert til den av
aktin
av det samme cDNA.
Immunofluorescence Farging
Celler dyrket på dekkglass ble skylt med PBS og deretter fiksert med 3,7% formaldehyd i 6 minutter ved romtemperatur, eller fast med is-kald metanol /aceton (v /v, 01:01) i 10 minutter ved -20 ° C. Etter fiksering ble cellene permeabilisert ved inkubering med 0,01% Tween-20 i PBS i 3-5 minutter ved romtemperatur. For å detektere centrosomes eller mikrotubuli, ble cellene farget med monoklonale anti-γ-tubulin (GTU-88, 1:200 fortynning) eller anti-α-tubulin (DM1A, 1:200 fortynning), henholdsvis, fulgt av inkubering med Alexa Fluor 488 eller 568 kanin-anti-mus IgG (1:200 fortynning, Invitrogen). For å detektere endogene STK31, ble cellene farget med monoklonalt mus STK31 antistoff, 1G10, etterfulgt av inkubasjon med Alexa Fluor 488 eller 568 kanin-anti-mus IgG. Bilder ble observert med en fluorescens mikroskop (Personal DV Applied Precision, Issaquah, WA) har en deconvolution funksjon (
softWORX
).
flowcytometri
AZ521 celler med forskjellig cellecyklus behandling ble fiksert med 80% etanol i 24 timer ved -20 ° C og deretter farget med propidiumjodid (PI) i 30 minutter ved romtemperatur. Cellesyklus fase fordeling ble analysert ved hjelp av et FACS Calibur instrument (BD Biosciences).
TUNEL-analysen
Celler ble fiksert med 4% paraformaldehyd og permeabilisert med 0,1% Triton X-100 i PBS som følger med 0,1% natriumcitrat. Tunel Analysen ble utført med en
I Situ
celledød Detection Kit, TMR, (Roche) i henhold til produsentens protokoll.
sårhelende analysen
AZ521 celler og HCT116 cellene ble sådd på 3 cm skåler med en konsentrasjon på 1 x 10
5 celler per brønn. Etter 24 timer av transfeksjon med GFP og GFP-STK31 ble cellene såret av milde tip-skrape. Bredden av lesjonsområdet varierte fra 500 um til 1 mm, og ble avbildet ved mikroskop ved 0 timer, 6 timer, 12 timer og 24 timer. Migrasjon Effektiviteten ble målt ved viklet intervall.
Transwell-analysen
A transwell med en porestørrelse på 3,0 um (Millipore, Bedford, Massachusetts) ble belagt med 5 ug /cm
2 kollagen gel og lufttørket over natten, eller 0,5 mg /ml matrigel (BD biosciences) i 1 time. GFP- eller GFP-STK31-transfekterte celler ble resuspendert i kulturmedium uten 10% føtalt bovint serum (FBS) og sådd inn i en transwell plassert i en 24-brønners plate inneholdende vekstmedium med 10% FBS. Etter 24 timers inkubering, ble transwell renset med PBS og fiksert med 3,7% formaldehyd i 10 minutter ved romtemperatur. Endelig filtrene ble fjernet fra brønnene og montert med forlenge Gold antifade reagens med DAPI, og cellene på filtrene ble telt under en immunfluorescens mikroskop (Olympus, BX51).
Resultater
Expression av STK31 i ulike humane kreftcellelinjer og kliniske menneske kolorektal Vev
STK31
overekspresjon i kliniske kolorektal kreft prøver tidligere har blitt rapportert [23]. Å analysere uttrykk for
STK31
i kreftcellelinjer, Q-PCR ble utført på humane kreftcellelinjer AZ521, A549, HeLa, og A375. Blant disse, som stammer fra ulike vev, AZ521, et adenokarsinom i ventrikkel, viste den høyeste
STK31
mRNA uttrykk (figur 1A). Uttrykket av
STK31
mRNA ble videre undersøkt i mange kolorektal kreftceller sammenlignet med AZ521. Resultatene viste at alle disse cellene uttrykte høye nivåer av
STK31
(figur 1B). Det samme resultat oppsto i humane kliniske kolorektale vev, som uttrykte høye nivåer av
STK31
i cancervev i forhold til normalt vev fra den samme person (figur 1C). På bakgrunn av det høye nivået av endogent
STK31
mRNA, AZ521 ble brukt som celle-modellen i denne studien.
(A) Total RNA fra fire humane kreftcellelinjer av forskjellig vev, AZ521 ( en human kolorektal kreft cellelinje), A549 (en human lunge-cancercellelinje), HeLa (en human cervical cancer-cellelinje), A375 (en human melanoma cancercellelinje), og en normal human bryst epitelcelle (normal) som var isolert for real-time PCR for å bestemme
STK31
mRNA nivåer.
STK31
ble betydelig overuttrykt i den humane magecancercellelinje, AZ521, sammenlignet med andre humane kreftcellelinjer. (B) Total RNA preparert fra seks gastrointestinale kreftcellelinjer ble brukt for å oppdage
STK31
mRNA uttrykk nivå ved real-time PCR som beskrevet i A. (C) Paret menneskelige kolorektal kreft vev (N, normalt vev; T, tumorvev) ble samlet for å isolere total RNA for å detektere ekspresjonsnivåene av
STK31
av RT-PCR.
Actin
ble brukt som en intern kontroll. Åtte representant paret prøver ble vist.
Endogen STK31 ligger i sentrosomen, kinetochore, Central Spindel, og midbody under Mitosis
For å ytterligere undersøke fysiologiske roller STK31 i somatiske kreftceller, bestemt STK31 monoklonalt (1G10, figur 2A) og polyklonale (19717) antistoffer ble generert mot ulike menneske STK31 peptider (figur 2A, øvre). Spesifisiteten av disse to antistoffer ble demonstrert ved Western blot analyse av totale lysatene fra AZ521 celler eksogent uttrykker EGFP-merket human STK31 protein (STK31-GFP) eller mus Stk31 protein (Stk31-GFP) (figur 2A). Resultatene viser at endogen STK31 (Figur 2A, spor 7), eksogent STK31-GFP (figur 2A, kolonne 8), og Stk31-GFP-fusjonsprotein (figur 2A, kolonne 9) kan detekteres av det monoklonale antistoff, 1G10. Polyklonale STK31 antistoffer, 19717, kan bare oppdage den eksogene STK31-GFP (figur 2A, spor 5), men ikke den endogene STK31 og Stk31-GFP (figur 2A, baner 4 og 6). Spesifisiteten av det monoklonale antistoff, 1G10, på A549-celler og AZ521-celler ble også bekreftet å detektere den endogene STK31 (figur S1). Den differensialproteinnivåer av A549 celler og AZ521 cellene er i linje med mRNA-ekspresjon som bestemt av sanntids revers transkripsjon PCR (figur 1A).
(A) Skjematisk representasjon av STK31 polypeptidet. To epitoper, aminosyrer 231-350 og 982-996, ble anvendt som antigener for å generere det monoklonale antistoff, 1G10, og polyklonale antistoffer, 19 717, henholdsvis. Etter rensing ble spesifisiteten av 19717 (kolonnene 4-6) og 1G10 (kolonnene 7-9) bekreftet ved immunblot (IB) analyse ved anvendelse av AZ521 total lysat (kolonnene 1, 4 og 7), STK31-GFP (inneholder den humane skjema STK31 sporene 2, 5 og 8), eller Stk31-GFP (inneholder mus skjema Stk31 baner 3, 6 og 9) transfektert AZ521 cellelysatene. Anti-GFP ble anvendt som en positiv kontroll for IB for å påvise ekspresjon av STK31-GFP og Stk31-GFP (kolonnene 1-3). α-tubulin ble anvendt som en kontroll lasting. (B) AZ521-celler ble farget med dobbelt 1G10 (grønn) og pericentrin (rød, en kjent centrosomal protein). DNA ble visualisert ved anvendelse DAPI (blå). Prophase, a-d; metafase, e-h; anaphase, i-l; og telophase, m-s. Sammenslåtte Bildene vises på høyre side (d, h, l og p). (C) AZ521 celler ble ko-immunfarget med 1G10 (grønn, a-e) og anti-Aurora B (rød, f-j) antistoffer. Det fusjonerte bilder vises (k-o). (D) Celler ble dobbelt farget med STK31 (grønn), Aurora-B (rød) og DNA (blå). Bare fusjonerte bildene ble vist. Piler indikerte colocalization av STK31 og Aurora-B gjennom cellesyklusen.
For å få et innblikk i den biologiske funksjonen til STK31 i kreftceller, den subcellulære lokalisering av endogen STK31 ble bestemt. AZ521 celler ble ko-immunfarget med antistoffer mot STK31 (1G10) og pericentrin (PCNT), en sentrosomen-assosiert protein ved immunofluorescens-analyse. Under profase og meta, STK31 samlokalisert med PCNT, noe som tyder på en sammenheng med spindel stolper (figur 2B, a-h). I tillegg ble STK31 funnet å ligge på centromeric regionen under metafase (figur 2B, e-h), spindel midtsone ved anafase (figur 2B, i-l), og til slutt konsentrert på midbody under telophase (figur 2B, m- p).
for ytterligere å bekrefte lokaliseringen av STK31 under mitose, AZ521 celler ble immunostained med antistoffer mot STK31 og kromosom passasjeren komplekset (CPC) protein, Aurora-B (figur 2C). CPC er sammensatt av Aurora-B kinase, INCENP, overlevende, og borealin [24], og er kjent for å migrere fra indre sentromerer til spindelen midtsone og ekvatoriale celle cortex under metafase-anaphase overgang. Immunfluorescens farging viste at Aurora-B viser den cellulære lokalisering re-oppførsel som er indikert i tidligere studier (figur 2C, f-j). Bemerkelsesverdig, ble STK31 farging (figur 2C, a-e) funnet å være samlokalisert med Aurora-B på centromeric regionen, spindel sone, og midbody (figur 2C, k-o). Merk at i tillegg til samlokalisering med Aurora-B, ble STK31 også funnet å ha sterke signaler på spindel stolper (figur 2D, piler). Denne subcellulære fordeling av STK31 er lik som Polo-lignende kinase 1 (PLK1) [25].
The Expression of STK31 er Cell Cycle avhengig
For å undersøke cellesyklusen uttrykk mønster av STK31, ble AZ521 cellene synkronisert med nocodazol (NZ) eller dobbel tymidin behandling bekreftet ved flowcytometri (figur 3A), og ekspresjon av endogene STK31 protein ble bestemt ved Western blot-analyse. Resultatet viste at STK31 proteinekspresjon blir redusert i løpet av G2-fasen og nådde sitt laveste nivå i M-fasen (Figur 3B). Western blot-analyse av totale cellelysater som frigjøres fra nocodazol behandling viste at STK31 proteinnivåene var lavest i NZ-behandlede celler (figur 3C, spor 2), og etter frigivelse, STK31 økt gradvis i løpet av mitose (figur 3C, sporene 3-10). Etter spennende mitose, cellesyklusen på nytt inn i G1 fasen, som ble indikert av cyclin-B1 nedbrytning ved 180 min etter utgivelsen, og STK31 nivået økt (figur 3C, spor 7). Ectopically-uttrykte STK31-GFP presenterer det samme uttrykk mønster med endogent STK31 (figur 3D). To hovedstrategier er involvert i cellesyklusregulert proteiner. For det første kan proteinet overflod styres ved transkripsjonsnivå. For det andre, protein omsetningen med proteolytisk nedbrytning, som er den viktigste mekanismen som regulerer exit fra mitose, blir målrettet av APC /C-Cdh1 kompleks gjennom sin ødeleggelse boksen (D-boks). Vi først sjekket uttrykket av endogen
STK31
mRNA av Q-PCR, og funnet ut at
STK31
mRNA redusert ved prometafase (Figur 3E). Interessant er også protein ekspresjon av STK31 presentert på et lavere nivå i G2-fasen (figur 3B), og mRNA-nivå ikke har noen åpenbar forskjell med asynchronized celler (figur 3E). I tillegg, ved å analysere aminosyresekvensen av STK31, har vi funnet at STK31 inneholder den konserverte D-boks motiv ved Arg
643 posisjon (R
643) (figur 4A). For å bekrefte at redusert nivå av STK31 ved mitose exit skyldes APC /C-indusert ubiquitin-proteasome nedbrytning, ble D-box mutant av GFP-STK31 generert til å analysere sin cellesyklusen uttrykk mønster (Figur 4A). Fra figur 4B, ekspresjon av GFP STK31-D-box mutant var signifikant økt i G2-fasen i forhold til villtype STK31-GFP.
(A) Asynchronized eller nocodazol (NZ) -behandlet AZ521 cellene samlet for å analysere cellesyklus befolkningen ved flowcytometri. Prosentandelene av G1, S og G2 /M er vist nedenfor. De runde-up-celler etter behandling ble NZ utskiftninger av og definert som M-faseceller, og de festede celler gjenværende etter shake-off ble ansett for å være den G2-fasen. (B) Total AZ521 lysater fra asynchronized (Asy), M fase (M), og G2 stadium av celler ble oppsamlet for Western blot-analyse med anti-STK31 polyklonale antistoffer. Fosfor-histon H3 serin 10 (P-H3 /S10) er en markør for mitotiske celler. (C) AZ521 celler frigjøres fra nocodazol behandling med forskjellige tidspunkter (0-360 min) ble samlet for å analysere ekspresjon mønster av STK31 av IB-analyse. Anti-B-Cyclin og anti-fosfo-histon H3 (p-H3 /S10) antistoffer ble anvendt som mitotiske markører. (D) AZ521 celler som uttrykker GFP ectopically eller STK31-GFP ble behandlet med nocodazol. M fase runde opp celler ble samlet av shake-off, og resterende festet celler samles som G2 fase. Asynchronized celler (Asyn) er vist. α-tubulin eller GAPDH ble benyttet som intern kontroll for IB. (E) Total RNA fra forskjellige cellesyklus stadier av AZ521 ble høstet for å analysere uttrykk for
STK31
mRNA ved real-time PCR. Tre uavhengige eksperimenter ble utført (N = 3), og midler med standardfeil er vist.
(A) A putative D-box motiv ligger innenfor aminosyrene 643-651 av STK31. Den konservert posisjon, Arg643 (R643), innenfor D-boksen ble vist. (B) Asynchronized (ASY), M fase, og G2 scenen AZ521 celler med STK31-GFP eller STK31-GFP /D-box mutant uttrykk ble samlet for å utføre IB analyse ved hjelp av anti-GFP antistoff. Expression nivåer av STK31-GFP vises som forholdstall. Fosfor-histon H3 serin 10 (P-H3 /S10) er en markør for mitotiske celler. GAPDH er en lasting kontroll.
overekspresjon av STK31 Øker Cell Migrasjon og Invasivitet
På grunn av overekspresjon av STK31 i kreftcellelinjer og kolorektal kreft vev (figur 1), den fysiologiske rollen til STK31 i tumorigenesis var under etterforskning av ectopically-overexpressed STK31-GFP. STK31-GFP ikke øke celleformeringshastigheten i AZ521 og HTC116 celler (figur 5A) eller cellesyklusen fordelings (figur 5B). Imidlertid er overekspresjon av STK31-GFP gjorde øke cellemigrering evne AZ521 og HTC116 (figur 5C). Basert på Transwell migrasjon og invasjon analyser, overexpressed STK31-GFP aktivert mer AZ521 og HTC116 celler til å passere gjennom matrigel eller collegen-belagt brønner (Figur 5D). Av Q-PCR-analyse, uttrykket nivået av
matrise metallopeptidase to plakater (
MMP2
), en migrering markør, ble økt i STK31-GFP-uttrykt celler, men stort sett deprimert i sh
STK31
-transfected celler (figur 5E).
(A) lik mengde AZ521 eller HCT116-celler med GFP eller STK31-GFP uttrykk var sådd, og cellevekst ble deretter overvåket ved å beregne levedyktige celler på den angitte tiden. Tre uavhengige eksperimenter ble utført og deres kvantitative resultater er vist. Ekspresjon av GFP eller STK31-GFP på dag 1 og dag 5 ble påvist ved hjelp av anti IB-GFP-antistoff. α-tubulin er en intern kontroll. (B) AZ521 celler med GFP eller STK31-GFP ekspresjon ble samlet for å analysere cellepopulasjon fordeling ved strømningscytometri. (C) AZ521 eller HCT116-celler med GFP eller STK31-GFP uttrykk ble benyttet for å utføre den sårhelende migrasjonsanalyse. Intervallet av cellemigrering på forskjellige tidspunkt (0-24 timer) ble målt og er vist. Kvantitative resultater er vist nedenfor. (D) AZ521 (øverst) eller HCT116 (lavere) celler med GFP eller STK31-GFP uttrykk ble sådd til type II kollagen-belagt eller Matrigel belagt trans-brønner for å utføre cellemigrasjon eller invasjon analyser. Etter farget med DAPI, en DNA-spesifikk fargestoff, ble cellene tellet, og de kvantitative resultatene er vist. Tre uavhengige forsøk ble gjort. (E) Celler transfektert med STK31-GFP eller infisert med lentiviral baserte
STK31
shRNA (sh
STK31
) ble samlet for å oppdage uttrykk for
MMP-2
av real-time PCR (til høyre). Overexpressed STK31-GFP ble oppdaget av IB-analyse (til venstre). Uttrykket av
STK31
i sh
STK31
celler ble bestemt ved real-time PCR og normalisert etter
β-aktin product: (i midten).
uttømming av STK31 Årsaker microtubule Monteringsfeil under Interphase
STK31 ble postulert å involvere microtubuli organisasjon på grunnlag av sin centrosomal lokalisering. For å teste dette, brukte vi en kald behandling for å indusere microtubule depolymerization og deretter indusere microtubule ettervekst. Cellene ble deretter fast og immunostained med anti-α-tubulin å observere re-montering og forlengelse av mikrotubuli. Celler med
STK31
shRNA tagget med EGFP (sh
STK31
-GFP, knockdown effektivitet se figur S2B) viste feil på tre nivåer: liten /ingen defekter (Figur S3A), moderate defekter (figur S3b) og alvorlige defekter (Figur S3C). Vi sammenlignet med celler transfektert med sh
STK31
-GFP og cellene transfektert med luciferase shRNA merket med EGFP (shLuc-
GFP
) som kontroller, og bestemmes antall celler for hver type ( Figur S3D). Resultatene viste at cellene utarmet i STK31 klarte ikke å vise forsvarlig organisering av mikrotubuli.
Den knockdown uttrykk for STK31 av shRNA Resultater i Mitotisk Progresjon Stans i GC-en Cell
For å analysere hvordan uttømming av STK31 påvirker mitotisk progresjon, brukte vi levende celle time-lapse mikroskopi for å overvåke skjebnen til GC-1 celler transfektert med sh
STK31
-GFP og sammenlignet dem med celler transfektert med sh
Luc
-GFP (figur S4) etter frigjøres fra en dobbel tymidin blokk. Vi timet varigheten av mitotisk progresjon fra kromosom kondens (mitotisk oppføring) til cytokinese (mitotisk exit). Vi fant ut at det tok 185 minutter for sh
Luc
-GFP celle for å fullføre mitose (Tall S4A-S4H), mens 357 min er nødvendig for sh
STK31
-GFP celle for å nå telophase (Tall S4i-S4P). Varigheten av intervallet fra celler transfektert med sh
STK31
-GFP økte to ganger i forhold til transfeksjon med sh
Luc
-GFP (figur S4, P og H, henholdsvis). Dette tyder på at STK31 mangel forårsaker en forsinkelse i mitotisk progresjon i GC-en celle.
Den knockdown uttrykk for STK31 av shRNA Årsaker Mitotisk Catastrophe og fører til apoptose i kreftceller
Vi undersøkte potensielle rolle STK31 med knockdown tilnærming. Western blotting ble utført på AZ521 celler infisert med lentiviral STK31 shRNA (sh
STK31
) hentet fra Academia Sinica å teste knockdown effektivitet (Figur 6A). Vi først sjekket effekten av lentiviral sh
STK31
-infected celler forstyrrer cellepopulasjon på grunn av subcellulære lokalisering og cellesyklusen avhengige uttrykk mønster av STK31. Flowcytometri analyse indikerte at et økt subG1 og en redusert G2 /M ble observert i lentiviral sh
STK31
infiserte celler (Figur 6b). For å bekrefte om STK31 mangel fører til apoptose, både aktiv caspase 3 og en TUNEL analysen ble utført på AZ521 celler infisert med lentiviral sh
STK31
. Fra figur 6C og 6D, STK31 knockdown celler viste en åpenbar apoptose befolkning.
(A) Etter 72 timer infeksjon av lentiviral baserte
STK31
shRNA (sh
STK31
) eller kontroll shRNA (shCtrl), AZ521 cellene ble høstet for å bestemme STK31 uttrykk ved IB. (B-D) Kontroll (shCtrl) eller sh
STK31
-infected celler (sh
STK31
) ble samlet for å analysere cellesyklus populasjonen ved strømningscytometri (B), for å påvise ekspresjon av aktiv caspase-3 av IB (C), og for å utføre TUNEL assay (D). Celler ble behandlet med DNase I ble anvendt som positive kontroller i C og D. Celler uten behandling var de negative kontroller for TUNEL assay. Den røde signal i 6D representerer de apoptotiske celler. ***,
P
verdi 0,001. (E) Time-lapse bilder av celler transfektert med
STK31
shRNA tagget med EGFP (sh
STK31
-GFP) (A-H). Ble cellene synkronisert med nocodazol (150 ng /ml) i 16 timer. Etter utgivelsen fra nocodazol ble cellene observert med time-lapse mikroskopi. Nabo utransfekterte celler (markert med en hvit pil) med hell gjennomgikk mitose og komplett cytokinese, mens knockdown celle (indikert av den gule pilen) holdt seg på et langvarig mitotisk lignende scenen. Vi timet varigheten av mitose fra atom konvolutt sammenbrudd (ved 0 min, a) og funnet at 272 min knockdown celle endte opp med en apoptotisk-lignende funksjon (h).
Vi spurte videre om uttømming av STK31 induserer den samme virkning på mitotisk progresjon i kreftceller. Likeledes ble time-lapse mikroskopi brukes til å overvåke AZ521 celler transfektert med sh
STK31
-GFP. Cellene ble behandlet med nocodazol i 16 timer og deretter gjennomgikk levende celle bildebehandling. Den sh
STK31
-GFP cellene ikke klarte å avslutte mitose, mens kontrollcellene fullført mitose og gikk inn i G1 fasen (figur 6E).
