Abstract
Jaeumganghwa-tang (JGT,
Zi-yin-jiang -huo-tang
i kinesisk og
Jiin-koka-for bedriften på japansk) er en orientalsk urte formel som lenge har vært brukt som en tradisjonell medisin for å behandle luftveier og nyresykdommer. Nyere studier viser at JGT utstilt potente hemmende effekt på allergier, betennelser, smerter, kramper, og prostata hyperplasi. Flere konstituerende urter i JGT indusere apoptotisk kreft celledød. Imidlertid har anti-cancer aktiviteten til JGT ikke blitt undersøkt. I denne studien undersøkte vi de anti-kreft effekt av JGT bruker svært tumorigene HT1080 menneskelig fibrosarkom celler og belyst de underliggende mekanismene. I tillegg undersøkte vi om
Lactobacillus
gjæring av JGT forbedret sin anti-kreft aktivitet ved hjelp av
in vivo
xenograft modell fordi gjæring av urteekstrakter er tenkt å styrke sine terapeutiske effekter. Data viste at JGT undertrykte veksten av kreftceller effektivt ved å stimulere G1 cellesyklus arrest og deretter indusere apoptotisk celledød ved å forårsake mitokondriell skade og aktivering kaspaser. Fosforylering av p38 og ERK også spilt en rolle i JGT-indusert celledød.
In vitro
eksperimenter vist at JGT gjæret med
Lactobacillus acidophilus
, utpekt fJGT162, fremkalte lignende mønstre av celledød som gjorde non-gjæret JGT. I mellomtiden daglig oral administrering av 120 mg /kg fJGT162 til HT1080 bærende BALB /c nakne mus undertrykket tumorvekst betydelig (inntil 90%) sammenlignet med saltvannsoppløsning behandling, mens administrasjonen av ikke-fermentert JGT undertrykket tumorvekst ved ~ 70 %. Sammen er disse resultatene tyder på at JGT og fJGT162 er trygge og nyttige komplementær og alternativ anti-kreft urteterapi, og at
Lactobacillus
gjæring forbedrer
in vivo
anti-kreft effekt av JGT betydelig.
Citation: Kim A, Im M, Hwang YH, Yang HJ, Ma JY (2015) Jaeumganghwa-Tang induserer apoptose via mitokondrie Pathway og
Lactobacillus
Fermentering forbedrer sin anti-kreft aktivitet i HT1080 Menneskelig fibrosarkom Cells. PLoS ONE 10 (5): e0127898. doi: 10,1371 /journal.pone.0127898
Academic Redaktør: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, USA
mottatt: 25 februar 2015; Godkjent: 21 april 2015; Publisert: 28. mai 2015
Copyright: © 2015 Kim et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet har vært støttet av Grant K15280 tildelt Korea Institute of Oriental Medicine (Kiom) fra departementet for vitenskap, IKT og Future Planning (MSIP), Republic of Korea
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
i de senere årene har tradisjonell kinesisk medisin (TCM) fått økende oppmerksomhet som en ressurs for medisiner. Fordi TCM-basert urteekstrakter er generelt lavt i pris og viser liten toksisitet eller bivirkninger i klinisk praksis, har de blitt brukt som alternative legemidler til behandling av et bredt spekter av menneskelige sykdommer, inkludert kreft, i Kina, Japan, Korea og andre asiatiske land [1-4]. I TCM, er urter anvendes i kombinasjon som formler, som antas å forbedre deres terapeutiske effekt og redusere uønskede effekter samtidig. For eksempel har Ka-mi-kae-kyuk-tang (KMKKT), en formel på 10 orientalske urter, antiangiogene, anti-metastatisk og anti-kreft aktiviteter
in vivo
med ingen åpenbare bivirkninger [5]. Videre KMKKT stimulerer benmargen stamcelle hematopoiesis og lindrer anti-kreft narkotika-indusert leukopeni bivirkninger hos mus [6,7]. I tillegg Bojungbangdocktang (BJBDT), som har vært anvendt for forhindring eller behandling av kreft i Korea, fungerer ved å blokkere VEGF /VEGFR aktivitet til å inhibere angiogenese i humane navlestrengvene endotelialceller (HUVECs) [8]. Det hindrer også cisplatin-indusert toksisitet og apoptose i MCF-10A normale humane bryst epitelceller, men ikke i brystkreftceller [9]. Disse resultatene antyder sterkt at urtemedisiner har potensielt gunstige effekter på kreft progresjon og lindre konvensjonell chemotherapy- eller strålebehandling-indusert komplikasjoner.
gjæring av medisinske urter, en nedbryting prosessen formidlet av mikrober eller sopp, er antatt å utøve gunstige virkninger på absorpsjon, biotilgjengelighet, og farmakologisk aktivitet av urteekstrakter ved akselerering av produksjon eller omdannelse av aktive komponenter i deres metabolitter eller ved å skape lavmolekylære stoffer som aglykon fra glykosid [10,11]. I tillegg har flere studier vist at fermenteringen av medisinske urteekstrakter forbedrer deres terapeutiske effekter. For eksempel fermentering av
Anoectochilus formosanus
ved hjelp av
Lactobacillus acidophilus
forbedret antioksiderende aktivitet ved å øke mengden av den totale fenol [12]. Nylig, vår gruppe rapporterte gunstige effektene av
Lactobacillus
gjæring, hvor hwangryunhaedoktang (HR) og oyaksungisan (OY) viste forbedret anti-inflammatorisk virkning i LPS-stimulerte RAW 264.7 celler etter gjæring [13,14]. I tillegg er administrasjonen av fermentert HR hadde en større hemmende virkning på bentap i ovariektomiserte (OVA) rotter ved å øke bentetthet og ben mikrostruktur sammenliknet med ikke-fermentert HR [15].
Jaeumgangwha-tang ( JGT,
Zi-yin-jiang-Huo-tang
i kinesisk,
Jiin-koka-for bedriften på japansk) er en orientalsk tradisjonelle urte formel, og har lenge vært brukt i Kina, Japan og Korea for å gi næring yin og direkte ild nedover som følge av mangel på nyre vann. JGT har blitt beskrevet i Dongui Bogam, til en koreansk bok holdt av Heo Jun (1539-1615), har farmakologiske effekter for behandling av luftveis og nyresykdommer, nattesvette, hoste, feber på ettermiddagen, rikelig slim, hemoptyse, tap av matlyst, spytter blod, forstoppelse, og flushing. Nyere studier har vist at JGT hemmet allergiske reaksjoner, betennelser, smerter og kramper, og forsterket immunrespons [16]. I tillegg JGT hemmet utviklingen av testosteron-propionat (TP) -indusert benign prostata hyperplasi (BPH) dramatisk i en rottemodell [17]. JGT består av 12 urter, inkludert
Paeoniae Radix
,
Angelicae Gigantis Radix
,
Rehmanniae Radix Preparata
,
Atractylodis Rhizoma Alba
,
Liriopis Tuber
,
Rehmanniae Radix Crudus
,
Citri Unshius Pericarpium
,
Anemarrhenae rhizoma
,
Phellodendri Cortex
,
Glycyrrhizae Radix et rhizoma
,
Zingiberis rhizoma Crudus
, og
Zizyphi Fructus
. Flere enkelt urter i JGT, inkludert
Angelicae Gigantis Radix
,
Asparagi Tuber
,
Anemarrhenae Rhizoma
, og
Paeoniae Radix
, lokke fram anti-kreft effekt ved å indusere apoptose [18]. Imidlertid har ingen studier ennå rapportert anti-kreft effekt av JGT.
I denne studien undersøkte vi den anti-kreft effekt av JGT i form av celledød og hemme tumorvekst
in vivo
ved hjelp av svært tumorigene HT1080 menneskelig fibrosarkom celler og belyst den detaljerte virkningsmekanismen bak sin kjemoterapeutiske aktivitet. Videre har vi undersøkt om
Lactobacillus
gjæring forbedret anti-kreft effekt av JGT å bruke en
in vivo
svulst xenograft modell.
Materialer og metoder
cellelinjer
menneske~~POS=TRUNC fibrosarkom HT1080 celler (KCLB no. 10121), menneskelige prostata adenokarsinom PC-3 celler (KCLB no. 21435), og menneskelig magekarsinom AGS celler (KCLB no. 21739) ble hentet fra den koreanske celle~~POS=TRUNC Bank (Seoul, Korea) og dyrket i RPMI 1640 (Cellgro, Manassas, VA, USA) supplert med 10% (v /v) varmeinaktivert føtalt bovint serum (Cellgro) og penicillin (100 E /ml) /streptomycin (100 ug /ml) (Cellgro) ved 37 ° C i en fuktet 5% CO
2 inkubator. Murine hepatocytter ble isolert ved hjelp av en perfusjon system med noen modifikasjoner og inkuberes som beskrevet tidligere [19].
Dyr
Fem uker gamle BALB /c nakne mus ble kjøpt fra Nara Biotech ( Seoul, Korea) og holdt under spesifikke patogen-frie anlegget under konstante betingelser (12 timers lys-mørke-syklus ved 22 ± 1 ° C og 55 ± 5% fuktighet). Alle dyreforsøk ble godkjent av Animal Care og bruk komité i Korea Institute of Oriental Medicine (Kiom, Daejeon, Korea) med referansenummer # 14-040 og utført i henhold til retningslinjene fra Animal Care og bruk komité på Kiom.
Kjemikalier og antistoffer
Rhodamine 123, propidiumjodid (PI), 4 «, 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI), og 3- (4,5-dimetyl-2-tiazolyl ) -2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) ble kjøpt fra Sigma Chemical Co. (St. Louis, Missouri, USA). SP600125, SB203580, og PD98059 ble oppnådd fra Calbiochem (San Diego, CA). Antistoffer mot p21, p27, cyclin B, cyclin D, cyclin E, cyclin-avhengig kinase (CDK) 2, CDK4, CDK6, BCL-2, XIAP, Bad, p-Bad, Bax, Bim, Bok, caspase-3, spaltes caspase-7, caspase-8, caspase-9, poly ADP ribose polymerase (PARP), p38, p-p38 (Thr180 /Tyr182), ekstracellulære regulert kinase (ERK) 1/2, p-ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204), ble c-Jun N-terminal kinase (JNK), og p-JNK (Thr183 /Tyr185) kjøpt fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA). Anti-α-tubulin ble oppnådd fra Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA, USA). For væskekromatografi (HPLC), ble acetonitril av HPLC-kvalitet erholdt fra J. T. Bakers (Philipsburg, NJ, USA) og trifluoreddiksyre (TFA) og 5-hydroksymetyl-furfural (5-HMF) ble oppnådd fra Sigma. Paeoniflorin og glycyrrhizin ble kjøpt fra Tokyo Chemical Industry Co (Tokyo, Japan). Nodakenin, nodakenetin, berberine, og palmatine ble hentet fra Faces Biochemical Co (Wuhan, Kina), og hesperidin ble hentet fra Korea Food and Drug Administration (KFDA, Osong, Korea).
Utarbeidelse av JGT, aJGT og fJGT162
Urter for et avkok av JGT ble kjøpt fra Yeongcheon Oriental Herbal Market (Yeongcheon, Korea) og mengden av hver urt ble oppført i tabell 1. ektheten av plantearter ble validert av Prof. Ki Hwan Bae (Chungnam National University, Daejeon, Korea), og alle bilag prøver ble deponert i urte bank i Kiom. I alt 1874,5 g hakkede JGT formel ble fuktet i 18,745 l destillert vann, kokt i 3 timer under anvendelse av Herb Extractor (Cosmos-600 Extractor, Gyungseo Co., Korea), og deretter filtrert gjennom standard testsikter (150 um, Retsch, Haan , Tyskland). Før gjæring ble avkok JGT justert til pH 7,0 ved anvendelse av 1 M NaOH og deretter sterilisert ved autoklavering i 15 minutter ved 121 ° C. En ren kultur av
Lactobacillus acidophilus
(KFRI162) ble oppnådd fra Korea Food Research Institute (KFRI) og inkubert i MRS-medium i 24 timer ved 37 ° C som tidligere beskrevet [20]. For å forberede fJGT162, autoklaveres JGT (aJGT) ble tilsatt med 1 × 10
8 CFU /ml
L
.
acidophilus
, og fermentert ved 37 ° C i 48 timer. Den endelige pH av villtype JGT, aJGT, og fJGT162 var 7,00 ± 0,00, 5,45 ± 0,01 og 3,80 ± 0,01, respektivt. JGT, aJGT, og fJGT162 ble ført gjennom en 60 um nylonnett filter (Millipore, Bedford, MA, USA), frysetørket og lagret i en eksikator ved 4 ° C. For
in vitro
eksperimenter, det frysetørkede pulver ble oppløst i 10% (v /v) DMSO i destillert vann (DW) til en sluttkonsentrasjon på 50 mg /ml og sentrifugert ved 14000 rpm i 10 min ; supernatanten ble deretter filtrert (0,22 um, porestørrelse).
celle proliferasjonsanalyse og DAPI farging
cellene utspredt i 96-brønners kulturplater (5 x 10
3 /brønn) ble behandlet med de angitte konsentrasjoner i 48 timer, og MTT-analyser ble utført som tidligere beskrevet [21]. For DAPI farging, celler dyrket og behandlet med JGT i 35 mm glassbunn rettene ble fiksert med 4% paraformaldehyd i 10 minutter, permeabilisert med 0,1% Triton X-100 i 10 minutter og farvet med DAPI (0,5 ug /ml) i 10 min, og observert under et konfokal laser scanning mikroskop (FV10i-W; Olympus Optical Co Ltd, Tokyo, Japan).
Cell syklus analyse
Celler i eksponentiell vekstfase ble behandlet med 1000 ug /ml JGT for 12, 24 og 48 timer. Etter høsting ble cellene vasket to ganger med iskald PBS og fiksert i iskald 70% etanol ved -20 ° C i minst 24 timer. De fikserte cellene ble vasket to ganger med iskald PBS, og intracellulær DNA ble farget ved bruk av PI-oppløsning (0,1% Triton X-100, 0,1 mM EDTA, 50 pg /ml RNase A, 50 ug /ml PI i PBS) ved 4 ° C i 30 min i mørket. Cellesyklus distribusjon ble analysert ved hjelp av FACSCalibur flowcytometri (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) og WinMDI 2.8 programvare (J. Trotter, Scripps Research Institute, La Jolla, CA, USA).
Måle mitokondrie membranpotensialet (MMP, ΔΨ
m)
etter behandling med JGT (500 og 1000 ug /ml) i 24 og 48 timer ble cellene vasket to ganger med PBS og deretter inkubert med rhodamin 123 fluorescens-fargestoff i en endelig konsentrasjon på 5 uM ved 37 ° C i 30 minutter. Fluorescensen av rodamin 123 ble analysert ved hjelp av et FACSCalibur strømningscytometer og observert under et fluorescens mikroskop (Olympus TH4-200; Olympus Optical Co. Ltd). For JC-1-farging, celler dyrket og behandlet med JGT i 35 mm glassbunn rettene ble farget med JC-1 (5 ug /ml) i mørke i 10 min ved 37 ° C, vasket med dyrkningsmedier, og observert i henhold en konfokal laser scanning mikroskop.
Western blot analyse
Cellene ble vasket to ganger med PBS og helcellelysater ble oppnådd ved bruk av M-PER pattedyr Protein Extraction Reagent (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA). Proteinkonsentrasjoner ble bestemt ved anvendelse av bicinchoninic syre kit (Sigma). En lik mengde protein ble elektroforese, immunoblottet og detektert som tidligere rapportert [21].
In vivo
tumor xenograft modell
BALB /c nakne mus ved 6 -week-alder (n = 15) ble injisert subkutant i mageregionen med HT1080 celler (2 × 10
6 /mus). På dag 7 etter tumorinokulasjon når tumorene nådde et volum på ~ 100 mm
3, ble musene tilfeldig delt i tre grupper (n = 5 pr gruppe), og daglig administrert med saltvann (kontroll), aJGT (120 mg /kg), eller fJGT162 (120 mg /kg) i et volum på 100 ul i 14 dager. Administrert dose for mus ble beregnet ut fra mengden som brukes i menneskelige voksne (37,49 g /60 kg kroppsvekt /dag) og utbyttet av pulverisert ekstrakt (39,74% i aJGT og 39,53% i fJGT162). Musene ble observert for grovt utseende og adferd, og deres kroppsvekter ble målt daglig. På dag 21 ble musene avlivet ved intraperitoneal injeksjon av en blanding av Zoletil (Virbac, Magny-en-Vexin, Frankrike) og Rompun (Bayer, Seoul, Korea) (2: 1, 200 mL), og deretter tumorer ble skåret ut for måling av vekten sin.
sikkerhet vurdering av aJGT og fJGT162
for å vurdere sikkerheten av aJGT og fJGT162, seks uker gamle BALB /c hårløse mus (n = 3 per gruppe) ble foret bærer (saltvann), aJGT (120 mg /kg), eller fJGT162 (120 mg /kg) daglig i løpet av 14-dagers forsøksperiode. Brutto utseende og oppførsel av mus ble daglig sjekket og deres kroppsvekt ble målt annenhver dag. På dag 14 ble musene avlivet, og vekter av viktige organer ble målt. Innsamlede fullblods og serumprøver ble analysert for hematologiske og serologiske parametere ved hjelp ADVIA 2120i hematologi system (Siemens Healthcare Diagnostics, Tarrytown, NY) og XL 200 (Erba Diagnostics Mannheim, Tyskland), henholdsvis.
Kromatografisk analyse av JGT , aJGT, og fJGT162
for å sammenligne phytochemical profiler av JGT, aJGT, og fJGT162, HPLC ble utført ved hjelp av en HPLC-DAD maskin (LaChrom Elite, Hitach Høy Technologies Co., Tokyo, Japan) som beskrevet tidligere med noen endringer [22]. Kromatografisk separasjon ble oppnådd ved anvendelse av en Phenomenex Luca C
18-kolonne (4,6 mm x 250 mm, 5 um). En gradient eluering med 0,1% TFA i deionisert vann (A) og acetonitril (B) ble utført som følger: 0-5 min med 5% B, 5-15 min med 5-12% B, 15-25 min med 12% B, 25-65 minutter med 12-50% B, og 65-70 minutter med 50-50% B. strømnings~~POS=TRUNC hastigheten~~POS=HEADCOMP og injeksjonsvolumet var 1 ml /min og 10 ul, henholdsvis, og HPLC-kromatogrammene ble oppnådd ved anvendelse av UV ved 190-400 nm. Standard (5-125 pg /ml) og prøveløsningene (20 mg /ml) ble oppløst og fortynnet i metanol.
Statistisk analyse
Data er presentert som gjennomsnitt ± standard avvik (SD) . Forskjeller mellom gruppene ble analysert ved hjelp av Student
t
-test med Sigmaplot 8.0 programvare (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). En
p
-verdi 0,05 ble ansett å indikere en betydelig forskjell.
Resultater
JGT minsker levedyktighet og induserer G
en cellesyklus arrest i HT1080 celler
For å undersøke anti-kreft effekten av JGT og belyse de detaljerte mekanismene for sin kjemoterapeutisk aktivitet, vi brukte svært tumorigent HT1080 human fibrosarkom cellelinje. Vi først undersøkte effekten av JGT på cellevekst ved hjelp av MTT-analyser etter behandling med 25 til 1000 mikrogram /ml JGT i 48 timer. Som vist i figur 1A, behandling med 500 og 1000 mikrogram /ml JGT redusert HT1080 celleviabilitet markert og indusert de fleste cellene til å krympe og runde opp, noe som er et typisk trekk ved apoptose. I tillegg JGT redusert levedyktighet av human gastrisk karsinom AGS og humant prostatakarsinom-PC-3-celler på en doseavhengig måte, mens en tilsvarende konsentrasjon av DMSO opp til 0,2% hadde liten innflytelse på celle-proliferasjon (S1 Fig). I motsetning til dette var normale hepatocytter ikke påvirket av JGT behandling, selv etter 48 timer med 1000 pg /ml, i form av celleproliferasjon eller morfologisk utseende, noe som tyder på at JGT er ikke hepatotoksisk (figur 1B). Analyse av cellesyklusutvikling ved bruk av PI farging viste at JGT behandling i 12 og 24 timer økte andelen av celler i G
1 fase til 38,49 og 44,71%, henholdsvis, sammenlignet med ubehandlede kontrollceller (33,22%). Antallet av apoptotiske celler i subG
0 /G
1 fase ble betydelig øket ved JGT til 4,99, og 9,49% etter behandling i henholdsvis 24 og 48 timer, sammenlignet med ubehandlede kontrollceller (1,13%), noe som tyder at JGT-mediert G
en cellesyklus arrest stående celledeling og dermed celledød (fig 2A) som inkubasjonstiden var forlenget. I samsvar med dette, Western blotting viste at JGT økte nivåer av CDK-inhibitorer p21 og p27 og redusert nivå av cyclin B, cyklin D, cyklin E, CDK2, CDK4 og CDK6 i HT1080-celler i betydelig grad sammenlignet med ubehandlede kontrollceller (Fig 2B ).
Menneskelige fibrosarkom HT1080-celler (A) og murine hepatocytter (B) ble behandlet med de angitte doser av JGT i 48 timer, og cellelevedyktigheten ble bestemt ved hjelp av MTT-analyser. JGT-behandlede celler ble observert i henhold til et invertert mikroskop (40 x forstørrelse). Dataene er representative for tre uavhengige eksperimenter utført in triplo og uttrykkes som gjennomsnitt ± SD. *
p
0,05 vs. ubehandlet kontroll.
(A), HT1080-celler ble inkubert med 1000 mikrogram /ml JGT til 12, 24 og 48 timer, og cellesyklusfordelingen ble analysert etter PI farging. (B) Konsentrasjonene av cellesyklusrelaterte proteiner i JGT-behandlede celler ble bestemt ved Western blotting. Bandet intensiteter i forhold til de av ubehandlede celler ble beregnet ved hjelp ImageJ programvare etter normalisering til tubulin uttrykk. Dataene er representative for tre uavhengige eksperimenter.
JGT fører caspase-avhengig apoptotisk celledød i HT1080 celler ved å fremkalle mitokondrieskade
For å avklare apoptotisk celledød forårsaket av JGT, må vi først vurderte nivåene av apoptose relaterte proteiner ved hjelp av Western blotting. Som vist i figur 3A, JGT redusert ekspresjon av anti-apoptotiske proteiner Bcl-2 og XIAP betydelig økte nivåene av pro-apoptotiske Bad, Bax, Bim, og Bok, og indusert spaltning av caspase-3, -7, -8, -9, og PARP. I likhet med observasjoner i HT1080 celler, JGT regulert cellesyklus-relatert, anti-apoptotisk, og pro-apoptotiske proteiner og økt PARP spalting i PC-3 celler (S2 fig). DAPI farging bekreftet at JGT økte antall apoptotiske kjerner som viser kromatin kondensering og DNA-fragmentering (figur 3B). I indre apoptose vei, er avbrudd av mitokondriemembranen potensial (MMP,
m) en irreversibel punkt i døden kaskade, og styres av pro- og anti-apoptotiske medlemmer av Bcl-2 familien. Nærmere bestemt, favoriserer pro-apoptotiske Bax lekkasje av apoptotiske faktorer fra mitokondriene, mens anti-apoptotiske Bcl-2 inhiberer denne lekkasje [23-25]. Måling MMP (ΔΨ
m) med rhodamine 123 fluorescens fargestoff avdekket at JGT behandling indusert tap av MMP (ΔΨ
m) betydelig i dose- og tidsavhengige oppførsel. Behandling med 500 og 1000 mikrogram /ml JGT i 48 timer sank prosentandelen av celler med en høy MMP (ΔΨ
m) til 82,15% og 58,20%, henholdsvis, sammenlignet med ubehandlede kontrollceller (94,38%) (figur 4A) . Fluorescens mikroskopi bekreftet dette reduksjon i MMP (ΔΨ
m; fig 4B). I tillegg ble tapet av MMP (ΔΨ
m) indusert ved JGT bekreftet ved bruk av det fluorescerende fargestoff JC-1, som utviser en potensiell avhengig akkumulering i mitokondriene. På et høyt MMP (ΔΨ
m), JC-1 er fortsatt i samlet form og er observert som rød Punktum flekker, mens det ser ut som grønn diffus monomere flekker på et lavt MMP. Som vist i figur 4C, JGT induserte en dose-avhengig bemerkelsesverdig tap av MMP (ΔΨ
m) 48 timer etter behandling.
(A) HT1080-celler ble behandlet med 500 og 1000 mikrogram /ml JGT i 24 og 48 timer, og nivåer av celledød-relaterte proteiner ble undersøkt ved Western blotting. Bandet intensiteter i forhold til ubehandlede celler ble beregnet ved hjelp ImageJ programvare etter normalisering til tubulin uttrykk. (B) For påvisning av apoptotiske kjerner,-celler behandlet med 500 og 1000 mikrogram /ml JGT i 48 timer ble farvet med DAPI og observert under et konfokalt mikroskop. Dataene er representative for tre uavhengige eksperimenter, og uttrykt som betyr ± SD av 5 tilfeldige felt per prøve. *
p
0,05 vs. ubehandlet kontroll.
(A) depolarisering av mitokondriemembranen potensial (MMP, ΔΨ
m) ble undersøkt i kontroll- og JGT-behandlede HT1080 celler etter farging med rhodamine 123. prosent~~POS=TRUNC av celler med en høy MMP (ΔΨ
m) sammenlignet med ubehandlede kontrollceller ble beregnet ved hjelp av WinMDI 2,8. (B) rhodamin 123-fargede celler ble observert under et fluorescens mikroskop (40 x og 200 x forstørrelse). (C) Et tap av MMP (ΔΨ
m) ble undersøkt ved hjelp JC-1 farging etter behandling med JGT i 48 timer (200 x og 600 x forstørrelse). Dataene er representative for tre uavhengige eksperimenter.
JGT induserer celledød ved å aktivere p38 og ERK
Tidligere studier har vist at MAPK signalveier kan indusere enten celledeling eller celledød avhengig av celletype og den stimulus [26,27]. Behandling med 1000 mikrogram /ml JGT forhøyede nivåer av fosforylert p38 og ERK betydelig, men hadde liten innflytelse på JNK-fosforylering i HT1080 celler (figur 5A) og PC-3 celler (S3 Fig). For å klargjøre rollen av p38 og ERK-aktivering i JGT-mediert celledød, ble farmakologiske inhibitorer av p38 (SB203580), ERK (PD98059), og JNK (SP600125) anvendt. Pre-inkubasjon med SB203580 og PD98059 beskyttet JGT-behandlede celler fra døden effektivt, mens SP600125 hatt liten effekt. Videre pre-inkubasjon med den pan-caspase inhibitor z-VAD-FMK hemmet JGT-mediert celledød nesten helt (Fig 5B og 5C). Til sammen tyder disse data på at JGT-mediert celledød blir utøvet via p38 og ERK-aktivering, fulgt av kaspase-aktivering.
(A) Celler ble behandlet med 1000 pg /mL JGT i 1, 6, 12 og 24 h, og nivåene av total og fosforylert MAPK ble målt ved Western blotting. Bandet intensiteter i forhold til ubehandlede celler ble beregnet etter normalisering til tubulin uttrykk. Dataene er representative for tre uavhengige eksperimenter. (B) Etter forbehandling med eller uten spesifikke inhibitorer (10 pM), ble cellene behandlet med 500 og 1000 mikrogram /ml JGT i 48 timer, og observert under en invertert mikroskop. (C) Levedyktigheten av cellene i (B) ble bestemt ved anvendelse av MTT-analyser. Dataene er representative for tre uavhengige eksperimenter utført in triplo og uttrykkes som gjennomsnitt ± SD. *
p
0,05 vs. ubehandlet kontroll, #
p.
0,05 vs. ingen inhibitor
Fermentering av JGT forbedrer sin hemmende effekt på
in vitro
celleproliferasjon og
in vivo
tumorvekst uten bivirkninger
for å undersøke effekten av bakteriell gjæring av JGT, vi sammenlignet anti-proliferativ og celledøds induserende effekter av villtype JGT, autoklaveres /non-gjæret JGT (aJGT), og autoklaveres /gjæret JGT (fJGT162) i HT1080 celler. Som vist i figur 6A, aJGT og fJGT162 redusert antall av levedyktige celler på en doseavhengig måte, i likhet med effektene observert med JGT i figur 1A. Imidlertid viste fJGT162 en større hemmende virkning på celleformering enn gjorde det ikke-gjæret JGT og aJGT, og de apoptotiske morfologiske endringer i fJGT162-behandlede celler var mer alvorlige enn de i aJGT-behandlede celler. I PC-3-celler og AGS-celler, hadde fJGT162 forbedret aktivitet på hemming av celleproliferasjon og induksjon av celledød i forhold til JGT og aJGT (S4 Fig). I tillegg, Western blotting viste at både aJGT og fJGT162 økte nivåene av p21, p27, Bax, og PARP-spaltning, og reduserte nivåene av cyclin B, cyklin D, cyklin E, CDK2, CDK4, CDK6, og XIAP vesentlig sammenlignet med ubehandlede kontrollceller (figur 6B). Videre både aJGT og fJGT162 aktivert p38 og ERK betydelig, men hadde liten effekt på JNK-aktivering (Fig 6C), i samsvar med effekten av JGT behandling. For å vurdere om de anti-kreft effekt av JGT ble forsterket av gjæring,
in vivo
tumor veksthemmende effekter av aJGT- og fJGT162 ble sammenlignet. HT1080-celler ble subkutant inokulert i mageregionen av BALB /c nakne mus, og 7 dager senere, mus (n = 5) med betydelig tumor (~ 100 mm
3) ble daglig behandlet med saltløsning, aJGT, eller fJGT162 i 14 dager. Som vist i figur 7A, behandling med 120 mg /kg aJGT undertrykket tumorvekst med hell sammenlignet med saltvannsbehandlede kontrollmus, mens fJGT162 oppviste et mer potent inhiberende effekt på
in vivo
tumorvekst enn gjorde aJGT. Kontrollmus hadde en gjennomsnittlig tumorvekt på 3,95 ± 0,50 g, mens mus som var behandlet med aJGT og fJGT162 hadde tumorvekter på 1,26 ± 0,56 g og 0,54 ± 0,38 g, og reflekterer reduksjoner på 68,1% og 86,3%, respektivt (figur 7B). Disse resultater antyder at JGT er en potent anti-kreft formulering, og at gjæring forbedrer
in vivo
anti-kreft-effekter av JGT Bemerkelsesverdig. I tillegg ble betydelig vekttap i aJGT- og fJGT162 administrert mus ikke observert i løpet av behandlingen, noe som indikerer aJGT og fJGT162 ikke fremkalle alvorlige toksiske effekter (figur 7C). For å vurdere om daglig inntak av aJGT og fJGT162 forårsaker alvorlig toksisitet, vi sammenlignet kroppsvekt, organvekt, og hematologiske /serologiske parametere i mus behandlet med kjøretøy (saltvann), aJGT, eller fJGT162. Administreringen av aJGT og fJGT162 i en dose på 120 mg /kg i 14 dager ikke påvirker kropps- og organvekt (S1 og S2 tabeller). I tillegg verdiene av GOT, GPT, BUN, CRE, og hematologiske parametre var ikke signifikant forskjellig mellom aJGT-, fJGT162-, og saltbehandlede mus (S3 og S4 tabeller). Disse dataene indikerer at gjentatt administrasjon av aJGT og fJGT162 ved dose på 120 mg /kg har ingen bivirkninger.
(A) HT1080 celler ble behandlet med de angitte konsentrasjoner av aJGT eller fJGT162 i 48 timer, og celleviabilitet ble evaluert ved hjelp av MTT-analyser og celle-morfologi ble observert under et invertert mikroskop. Dataene er representative for tre uavhengige eksperimenter utført in triplo og uttrykkes som gjennomsnitt ± SD. *
p
0,05 vs. ubehandlet kontroll, #
p
0,05 vs. JGT eller aJGT. (B) Nivåene av celle cycle- og celledød-relaterte proteiner i aJGT- eller fJGT162-behandlede HT1080-celler ble undersøkt ved hjelp av Western blotting 48 timer etter behandling. (C) Den aktiveringen av MAPK ble analysert ved Western blotting etter aJGT eller fJGT162 behandling i 1, 6 og 18 timer. Bandet intensiteter i forhold til de av ubehandlede celler ble beregnet etter normalisering til tubulin uttrykk.
(A) HT1080 celler (2 × 10
6 /mus i 200 mL PBS) ble inokulert subkutant i BALB /c nakne mus. Etter 7 dager ble musene behandlet daglig med saltvann (kontroll), 120 mg /kg aJGT, eller 120 mg /kg fJGT162 i 14 dager. På dag 21 etter tumor-inokulering, ble tumorene fjernet og fotografert. (B) Den endelige tumorvekt ved slutten av forsøket ble målt. (C) Kroppsvekt ble målt under forsøket. Dataene er midler ± SD.
Identifisere de viktigste komponentene i JGT, aJGT, og fJGT162 ved bruk av HPLC-DAD
For å analysere aktive ingrediensene i JGT, aJGT, og fJGT162, valgte vi 8 markør forbindelser: 5-HMF (
Rehmanniae Radix Preparata
), paeoniflorin (
Paeoniae Radix)
, glycyrrhizin (
Glycyrrhizae Radix et rhizoma
), nodakenin og nodakenetin (
Angelicae Gigantis Radix
), berberine og palmatine (
Phellodendri Cortex
), og hesperidin (
Citri Unshius Pericarpium
). En gradient eluering med vann og acetonitril ble brukt for å skaffe optimal separasjon, og TFA ble anvendt for å forbedre den toppform og hemme topp tailing. UV-bølgelengder av de åtte forbindelser ble justert basert på den maksimale UV-absorpsjon av hver komponent. Hver forbindelse i prøvene ble identifisert ved å sammenligne retensjonstider (
t
R
) og UV-spektra av kjemisk definerte standard forbindelser. Som vist i figur 8 og S5 Fig, 5-HMF (1,
t
R
: 9,3 min), paeoniflorin (2,
t
R
: 32,6 min), nodakenin (3,
t
R
: 40,7 min), hesperidin (4,
t
R
: 43,3 min), nodakenetin (5,
t
R
: 48,2 min), berberine (6,
t
R
: 51,2 min), palmatine (7,
t
R
: 51,7 min), og glycyrrhizin (8,
p
Data er presentert som gjennomsnitt ± SD.
