Abstract
Bakgrunn
CD44 er et stor cellulære reseptor for hyaluronic syrer. Stammen strukturen av CD44 kodet av ti normale eksoner kan forstørres ved ti variant eksoner (v1-V10) av alternativ spleising. Vi har lykkes i å forberede MV5 humant IgM og sin klasse svitsjet GV5 IgG monoklonalt antistoff (mAb) erkjenner ekstracellulære domenet til en CD44R1 isoform som inneholder den innsatte regionen kodet av variant (v8, v9 og V10) eksoner og uttrykkes på overflaten av ulike menneskelige epiteliale kreftceller.
Metoder og hovedfunnene
Vi demonstrerte veksthemming av menneskelige kreft xenografter av en GV5 IgG mAb omformet fra en MV5 IgM. Den epitop som gjenkjennes av MV5 og GV5 ble identifisert til en v8-kodende region ved analyse av mAb-binding til forskjellige rekombinante CD44-proteiner ved hjelp av enzymbundet immunosorbent assay. GV5 viste fortrinnsrett reaktivitet mot forskjellige ondartede humane celler versus normale humane celler vurderes av flowcytometri og immunhistokjemi analyse. Når ME180 human uterin cervix carcinoma-celler ble inokulert subkutant i atymiske mus med GV5, ble det observert signifikant inhibering av tumordannelse. Videre intraperitoneale injeksjoner av GV5markedly hemmet veksten av etablerte tumorer synlige fra HSC-3 human strupehode karsinomceller som var blitt transplantert subkutant en uke før den første behandling med GV5. Fra
in vitro
eksperimenter, antistoffavhengig cellulær cytotoksisitet og internalisering av CD44R1 syntes å være mulige mekanismer for
in vivo
anti-tumor aktivitet ved GV5.
Konklusjoner
CD44R1 er en utmerket molekylære mål for mAb terapi av kreft, muligens bedre enn molekyler målrettet av eksisterende terapeutiske mAb som Trastuzumab og Cetuximab erkjenner human epidermal vekstfaktor reseptor familien
Citation. Masuko K, Okazaki S, Satoh M, Tanaka G, Ikeda T, Torii R, et al. (2012) Anti-tumoreffekt mot human kreft xenotransplantater av et humant monoklonalt antistoff til en variant 8-epitop av CD44R1 uttrykt på kreft stamceller. PLoS ONE 7 (1): e29728. doi: 10,1371 /journal.pone.0029728
Redaktør: Patrick Tan, Duke-National University of Singapore Graduate Medical School, Singapore
mottatt: 15 august 2011; Godkjent: 02.12.2011; Publisert: 17 januar 2012
Copyright: © 2012 Masuko et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av den «Academic Frontier» Project of Kinki universitet (2005-2007) og «Antiaging Center» Prosjekt av Kinki universitet (2008-2012) for private universiteter: matchende fondet tilskudd fra MEXT (Kunnskapsdepartementet, Kultur, Sport , vitenskap og teknologi), og også støttet av «A-STEP (Tilpasningsdyktig og sømløs Technology Transfer Program gjennom Research Men disse mAb som ikke reagerer med celler som uttrykker CD44s-GFP, viser at GV5 opprettholder spesifisiteten av MV5 og spesifikt gjenkjenner et humant CD44R1 protein ved flowcytometri (FCM). I motsetning til dette, MV1 omsatt med HEK293F celler som uttrykker CD44s-GFP eller CD44R1-GFP. Spesifisiteten til humant mAb ble også underbygget av FCM-analyse ved bruk RH7777 rotte celler transfektert med cDNA for human CD44s eller CD44R1 (data ikke vist). Deretter ble MV1, MV5 og GV5 testet for reaktivitet med forskjellige rekombinante humane CD44-proteiner kondensert til glutation-S-transferase (GST) (Fig. 3B). R1a er et immunogen for produksjon av anti-CD44 mAb human, og R1b inneholder kortere polypeptider i eX5 og v8 regioner enn R1a. Epitopen definert med humant mAb ble lokalisert til et EX5-kodende region for MV1, og en v8-kodende region for MV5 og GV5 ved hjelp av enzymbundet immunosorbent assay (ELISA). Peptidet epitopen definert med MV5 eller GV5 syntes å bli eksponert i humane celler, fordi disse mAb absolutt og spesifikt omsatt med HEK293F celler som uttrykker CD44R1, selv om CD44R1 er tungt glykosylert og ekspresjonen av disse epitoper kan bli påvirket av glykosyleringen som varierer mellom celletyper eller celle forhold.
(A) MV1 (til venstre), MV5 (i midten) og GV5 (til høyre) ble sammenlignet for reaktivitet med HEK293F celler som uttrykker human CD44R1-GFP (øverst) eller menneskelige CD44s-GFP (lavere) til FCM. (B) Reaktivitet av antistoffer mot ulike GST-smeltet rekombinante CD44 proteiner (R1a og R1b, Δex5-v8-v9-v10-Δex16, v8, v9, v10 og EX5) smeltet til GST ble bestemt av ELISA. Forskjell i lengden på Δex5 og Δex16 mellom R1a og R1b rekombinante proteiner er beskrevet i «Materialer og metoder».
Anti-CD44R1 fullt menneskelig GV5 selektivt reagert med menneskekreft cellelinjer, men ikke med ulike menneskelige normale celler
Noen av de eksisterende terapeutiske mAb er målrettet mot human epidermal vekst reseptor (HER) familie [24] – [27]. Vi sammenlignet med reaktiviteten av GV5, Cetuximab (anti-HER1) og trastuzumab (anti-HER2) med HCT116 humane kolonkreftceller, normale humane epidermale keratinocytter (NHEK) og humane navlestrengvene endotelialceller (HUVEC) (fig. 4A, C) . GV5, Cetuximab og Trastuzumab var definitivt reaktive med HCT116 humane kreftceller. GV5 svakt reagert med NHEK, selv om Cetuximab sterkt og Trastuzumab moderat reagert med NHEK. Videre GV5 var nesten ikke-reaktiv med HUVEC, selv om Cetuximab og Trastuzumab vesentlig reagert med HUVEC. Deretter undersøkte vi reaktiviteten av GV5 overfor forskjellige andre humane cellelinjer (Fig. 4B). GV5 definitivt reagert med ulike dyrkede humane epiteliale kreftformer (BT20 bryst, KATOIII mage, LS-174T kolon, ME180 cervix, KPK-en nyre og KU-en blære), selv om dette mAb ikke reagerer eller bare svakt reagert med Molt-4 T leukemi, SK-MEL-37 melanom og non-kreftcellelinjer fra voksen hud (EK325), fetal tarm (Int407) og embryonale nyre (HEK293F). GV5 også omsettes med MKN-7 mage og HeLa-S-uterin cervix-karsinom-cellelinjer, men ikke med U-2OS osteosarkom, Jurkat, Daudi og HL60 leukemicellelinjer (Fig. 4C). Ekspresjon av CD44R1 i mange karcinomaceller var heterogen (Fig. 4B), som i tilfeller med humane xenograft i atymiske mus (fig. 1, fig. 2). I tillegg gjorde GV5 ikke reagerer med hvilende små lymfocytter i det hele tatt; Det er også interessant at det ikke reagerer med lymfocytter stimulert med rekombinant human interleukin-2 (IL-2) i 48 timer eller 12-
O
-tetradecanoylphorbol-13-acetat (TPA) pluss Ca ionofor ( A23187) i 24 timer, noe som indikerer at aktiverte T og B-lymfocytter ikke er reaktive med GV5 (fig. 4C). Spesifisiteten til GV5 indikerer at CD44R1 er et tumor-selektive og overlegen målmolekyl sammenlignet med HER1 og HER2. Faktisk var alvorlig hud toksisitet observeres ved behandling av cetuximab mot tykktarmskreftpasienter, sannsynligvis på grunn av binding til HER1 på huden keratinocytter. I forbindelse med uttrykket av HER2, GV5 sterkt omsettes med en BT20 trippel-negative brystkreftcellelinje som ikke uttrykker østrogen og progesteronreseptorer og HER2, selv om dette mAb ikke reagerer med HER2-over-uttrykke SK-BR-3- brystkreft-cellelinje (fig. 4B, C). Derfor forventer vi at anti-CD44R1 terapeutisk mAb kunne kompensere for anti-HER2 mAb i behandling av brystkreft.
GV5, Cetuximab og Trastuzumab ble sammenlignet for reaktivitet med HUVEC, NHEK og HCT116 av FCM (histogrammer ) med en Accuri C6 strømningscytometer (A). Reaktivitet av GV5 med forskjellige humane celler ble analysert ved FCM, og avbildet som histogrammer (B) med en BD-LSR flowcytometeret og som ΔMFI (C) ved hjelp av en Accuri C6 strømningscytometer.
CD44R1 var spesifikt påvist i humane epitel-cancervev
Først ble fordelingen av CD44s og CD44R1 i humane kreftformer analysert med rotte-mAb (RV7 og RV9) mot human CD44, ettersom farging av humant vev med GV5 etterfulgt av anti-human immunoglobuliner resulterte ikke i det åpenbare resultat (data ikke vist). I IHA på menneskelige bryst og tykktarm vev (Fig. 5), begge Rv7 definerte CD44s og RV9 definerte CD44R1 (v8) ble definitivt uttrykt i cellemembranen av bryst og tykktarm kreft celler, selv om CD44s men ikke CD44R1 ble også uttrykt på celler i stroma. Uttrykk av CD44R1 i normale bryst epitelceller var lav og var negativ i tykktarm epitelceller. I tillegg ble CD44R1 heterogent uttrykt i kreftceller, som i tilfellet med farging av humane cancer xenografter (fig. 1 og fig. 2) og cancercellelinjer (Fig. 4B) av GV5 anti-CD44R1 humant mAb. I IHA på menneskelige mandlene, Mab RV9 anti-CD44R1 (v8) svakt farget epitel, spesielt celler i basal laget, men gjorde ikke skam lymfoblastoide celler i germinal sentrum av mandel vev, selv om RV7 anti-CD44s mAb definitivt farget celler i dette området, i tillegg til celler i hele epitelet (data ikke vist). Disse funnene sammenfaller godt med unreactivity av GV5 med aktiverte humane lymfocytter (fig. 4C). Resultatene fra FCM og IHA har vist utmerket kreft-spesifisitet CD44R1, utvilsomt bedre enn i CD44s. Vi neste undersøkte reaktivitet av biotinylert GV5 med menneskelige vevsprøver. GV5 definitivt reagert med plateepitelkreft karsinomer i livmorhalsen (primær kreft), hud (primær kreft) og lunge (metastatisk kreft i bløtvev), adenokarsinomer av mage og tykktarm, men ikke med aggregerte lymfatisk knuter av vermiform vedlegg (Fig. 6). Således er ekspresjonen av CD44R1 begrenset til epiteliale kreftformer, og står ikke i ferd med å lymfocyttaktivering
in vitro
eller
in vivo
, selv om ekspresjon av en gitt, iboende oncoprotein i lymfocytter er ofte oppregulert ved ulike aktiverings stimuli [28], [29].
Reaktivitet av anti-human CD44s eller anti-human CD44R1 (v8) rotte mAb med brystkreft og tykktarms vevssnitt fra menneskelige kirurgiske prøver var analysert med ABC immunoperoksidasefarging. Seksjoner fra PFA-fiksert og parafininnstøpte menneskelige bryst og tykktarm vev ble behandlet med mikrobølger i citratbuffer for henting av antigener, og inkubert med RV7 eller RV9 rotte mAb. Etter å ha blitt skylt i PBS, ble vevssnitt sekvensielt inkubert med artsspesifikke biotinylated esel anti-rotte IgG (H + L), ABC reagens og underlaget løsning som inneholder DAB og H
2o
2. Kjerner ble farget med hematoksylin. Non-eller kreft vev bety prøver fra en identisk pasient.
Seksjoner fra PFA-fiksert og parafininnstøpte menneskelig vev ble behandlet med mikrobølger i citratbuffer for henting av antigener, og inkubert med biotinylert GV5. Etter å ha blitt skylt i PBS, ble vevssnitt inkubert med ABC reagens og underlaget løsning som inneholder DAB og H
2o
2. Kjerner ble farget med hematoksylin.
Anti-CD44R1 GV5 menneskelig mAb utstilt
in vivo
terapeutisk effekt på menneske karsinomer i xenograft modeller
GV5 ble vurdert for anti- tumor effekt mot humane tumorer i atymiske mus. Størrelsen av hver tumor ble dannet ble periodisk målt, som beskrevet andre steder [30] – [32]. Først GV5 ble undersøkt med hensyn til virkning på tumordannelse ved å ME180 humane cervix kreftceller i en tumormodell nøytralisering [33]. Denne modellen for å evaluere lokal effekt av antistoffer mot tumorvekst historisk stammer fra Winn test [34] beregnet for evaluering av antitumoreffekten av cytotoksiske T-lymfocytter. Kreftceller ble inokulert subkutant i atymiske mus med eller uten GV5 (50 ug /område), og tumorvekst i GV5 treatedmice var signifikant hemmet sammenlignet med den for kontrollmusene (fig. 7). Deretter GV5 ble undersøkt for anti-tumoreffekt mot en HSC-3 human strupehode kreft i en etablert tumor modell [35]. I denne systemisk administrering av mAb til tumorbærende mus, vi bevisst innført intraperitonealt, men ikke intravenøs injeksjon for administrering av en nøyaktig mengde av mAb til hver mus. Syv dager etter HSC-3-celler ble inokulert subkutant i atymiske mus og et synlig tumor i alle mus ble fastslått, ble GV5or bærerkontroll injisert intraperitonealt to ganger med et intervall på en uke. I denne eksperimentelle modellen, tumorvekst i GV5 treatedmice var igjen signifikant hemmet sammenlignet med den for kontrollmusene (fig. 8).
Tumor nøytralisering modellen ble tatt i bruk. ME180 humane tumorceller (1,0 x 10
6) med eller uten mAb (50 ug /site) i 200 ul PBS ble inokulert subkutant inn i høyre dorsale flanke av hvert dyr. Størrelsen av hver tumor ble dannet, ble målt med jevne mellomrom, og tumorvolum (mm
3) ble beregnet ved formelen 0,4 x (lengde) x (bredde)
2. Resultatene ble analysert statistisk ved to-veis ANOVA tester med gjentatte målinger.
Etablert tumormodell ble vedtatt. Syv dager etter human strupehode carcinoma-avledet HSC-3-tumorceller (1,0 x 10
6) i 200 ul PBS ble inokulert subkutant i atymiske mus og synlig tumor i alle mus ble fastslått, 500 ul PBS med eller uten GV5 (100 ug) ble inokulert intraperitonealt på dag 7 og dag 14 (vertikale piler). Størrelsen av hver tumor ble dannet, ble målt med jevne mellomrom, og tumorvolum (mm
3) ble beregnet ved formelen 0,4 x (lengde) x (bredde)
2. Resultatene ble analysert statistisk ved tosidig Student
t
tester (øvre), og etter to-veis ANOVA tester med gjentatte målinger (lavere). Vertikale linjer viser standardavvik.
GV5 indusert internalisering av CD44R1 og ADCC
in vitro
For å analysere mekanismene i
in vivo
anti-tumoreffekten av GV5 mot humane krefttransplantater i atymiske mus, internalizations av CD44R1, komplementavhengig cytotoksisitet (CDC) og antistoffavhengig cellulær cytotoksisitet (ADCC) ved GV5 ble undersøkt. Siden dysfunksjon av CD44R1 ved mAb kan lede til veksthemming eller celledød av kreftcellene gjennom en mangel på signal fra et adhesjonssubstrat, undersøkte vi effekten av GV5 på fordelingen av celle-overflate CD44-proteiner. Ved tilsetning av GV5 til kulturen av HSC-3-celler i 12 timer, omtrent 50% av CD44R1 proteiner forsvunnet fra celleoverflaten (fig. 9A). CDC ved hjelp GV5 kombinert med mus, kanin eller humant serum ikke resultere i død av tumorceller (Fig. 9B). I ADCC, splenocytter av atymiske mus ble for-dyrket med IL-2 i 12 timer for å forbedre drepingen aktiviteten av effektorceller. Ved anvendelse av IL-2-behandlede effektorceller, GV5clearly forsterket cytotoksisitet mot HSC-3-tumorceller i ADCC (fig. 9C, D).
(A) HSC3-celler ble dyrket med eller uten GV5 ( 10 ug /ml) i 12 timer, og ble immunfarget med GV5 etterfulgt av FITC-konjugert esel-anti-humant IgG (H + L). Celleoverflate CD44R1 proteiner i disse cellene ble påvist ved FCM. Forsøkene ble gjentatt tre ganger, og lignende resultater ble oppnådd. (B) Når HSC-3-celler og sera for komplement og mAb ble blandet og inkubert i hver brønn av U-bunnet 96-brønns plate i 1 time, DAPI ble tilsatt til hver brønn. Prosenter av DAPI-fargede celler (døde celler) ble beregnet til FCM. Forsøkene ble gjentatt tre ganger, og lignende resultater ble oppnådd. (C) HSC-3-celler (1,5 x 10
5) ble blandet med effektor celler av splenocytter (3 x 10
6 eller 9 x 10
6) fra KNS nakne mus, som var pre-dyrket over natten med LL-2, med eller uten mAb, i hver brønn av U-bunnet 96-brønns plate i 5 timer, og PI ble tilsatt til hver brønn. Cytotoksisitet ble analysert ved hjelp av en Accuri strømningscytometer. R1, HSC3 menneskelig målceller; R2, mus effektorceller; R3, PI-farget døde celler i R1; R4, PI-unstained levende celler i R1. (D) Celledød (%) av HSC-3-celler av mus effektorcellene (E /T = 0, 20 eller 60) med eller uten GV5 ble plottet. E /T betyr effektor og mål ratio.
GV5 indusert effektiv ADCC med menneskelige effektorceller
Siden vi bekreftet ADCC aktivitet GV5 med musen effektorceller, vi neste undersøkt ADCC aktivitet GV5 med menneskelige effektorceller. GV5 viste signifikant ADCC-aktivitet mot HSC-3-tumorceller med IL-2-stimulerte humane, perifere blod-lymfocytter (PBL) som effektorceller, selv ved en lav effektor /target (E /T) forhold på 2,5 (Fig. 10A). Ved en E /T-forhold på 10, viste GV5 forsterket cytotoksisitet mot HCS-3-celler sammenlignet med humane effektorceller alene, ved alle tidspunkter mellom to timer og 7 h (fig. 10B).
HSC-3- cellene ble merket med Calcein-AM, og celler (2 x 10
5) ble blandet med effektor-celler av human PBL (5 x 10
5 eller 2 x 10
6), som ble for-dyrket over natten med IL-2 med eller uten mAb i hver brønn av U-bunnet 96-brønns plate i 7 timer. Cytotoksisitet ble evaluert av utgivelsen av Calcein-AM av døde kreftceller inn i mediet, og resultatene ble automatisk registrert ved hjelp av en Terascan VP microfluorocytometer 1 timers mellomrom i 7 timer. Resultatene ble analysert statistisk ved to-veis ANOVA tester med gjentatte målinger (A) og ved tosidig Student
t
tester (A og B). Flekker og vertikale linjer viser henholdsvis gjennomsnitt og standardfeil.
I denne studien har vi lykkes produsert fullt menneskelig GV5 mAb spesifikt gjenkjenner CD44R1, og demonstrerte veksthemming av menneskelige krefttransplantater i atymiske mus ved GV5 . Når det gjelder antitumormekanismer mot humane xenografter av GV5 i atymiske mus, vi forsøksvis foreslå bidraget av induserte internalisering av CD44R1 ved GV5 og forsterket cytotoksisitet i ADCC av mus effektorceller med GV5. Vi forventer også at GV5can vise en ADCC-mediert terapeutisk effekt på menneskelige kreftformer, siden GV5has viste ADCC aktivitet med human PBL som effektorceller. Effektene av anti-CD44R1 mAb på inkorporering av hyaluronat er nå undersøkes; Vi har imidlertid allerede bekreftet at GV5 kunne fremkalle internalisering av CD44R1 fra celleoverflaten, noe som tyder på mulige effekter på inkorporering av hyaluronat og utvidet anti-tumor effekten av dette mAb, i tillegg til ADCC-aktivitet.
Nylig spesifikk kimære eller humaniserte mAb mot de ekstracellulære domener av HER2 [24], [25], HER1 [26], [27] og CD20 [36] – [38] har blitt introdusert for behandling av brystkreft, tykktarmskreft eller B cellemaligniteter, respektivt. Selv om fase I kliniske studier med anti-CD44v6 kimære mAb mot plateepitelkarsinom har nylig blitt utført [39] – [41], alvorlige hud toksisitet ble observert sannsynligvis på grunn av binding til CD44v6 på hud keratinocytter [39], [40]. I denne sammenheng, reaktiviteten av GV5 med human normal hud keratinocytter var negativ eller ubetydelig (fig. 3A), noe som tyder på lav hud toksisitet av våre anti CD44R1 (v8) humant mAb.
akkumulerte bevis har vist at CD44 er karakteristisk uttrykt i cscs av forskjellig opprinnelse vev [11] – [16]. Vi har nå fokusere på CD44v (CD44R1) men ikke CD44s uttrykt på overflaten av cscs i forstadier regionen av mage adenokarsinomer av
K19-Wnt1 /C2mE
gene mus [9], [10]. Reaktivitet av GV5 med ME180 eller HSC-3 virket relativt heterogent; Men svulstdannelse eller tumorvekst ble nesten helt hemmet av GV5, noe som tyder på at cscs er hovedsakelig sammensatt av GV5-reaktive CD44R1
høye celler, men ikke fra GV5-reaktive CD44R1
lave celler. I denne sammenheng, har våre nye data gitt bevis for at ekspresjon av CD44R1 og dens assosiasjon med XCT cystein-glutamat antiporter, en lett kjede-subenhet av CD98 oncoprotein [10], [23], [30] – [32], [42 ], [43], blokkere reaktive oksygenarter (ROS) -indusert spenning signalering som resulterer i vekstarrest, celledifferensiering og senescence, og derved å fremme proliferasjon av kreftceller og dannelse av dødelige gastrointestinale tumorer [44]. Gitt at CD44R1-uttrykker cscs spille en sentral rolle i motstanden mot kreft terapi, bør det postulert at terapeutisk mAb kunne målrette CD44R1
høy cellepopulasjon i kreft.
Vår nåværende analyser indikerer sterkt at kreftbehandling med anti-CD44R1 humant mAb er lovende, spesielt mot ulike menneskelige epiteliale kreftformer som adenokarsinomer av bryst, mage og tykktarm, overgangsordning celle carcinoma av blære og nyrekreft, i tillegg til plateepitelkarsinom fra ulike kroppsområder.
Materialer og metoder
Celler og celledyrkningsbetingelser
celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP fra human strupehode karsinom (ca) (HSC-3), bryst Ca (BT20, SK-BR-3) , mage ca (GAS-en, MKN-7, MKN-28, KATOIII), tykktarms ca (LS-174T, HCT116), livmorhalsen ca (ME180, HeLa-S), nedsatt ca (KPK-en, TOS-1 ), blære ca (KU-1), melanom (SK-Mel-37), osteosarkom (U-2OS), fetal tarm (Int407) og en rotte hepatomcellelinje (RH7777;. generøst gitt av Tanabe Mitsubishi Pharm) ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) supplert med 7% varme-inaktivert føtalt bovint serum (FBS; ICN Biomedicals, Aurora, OH, USA) i en fuktet inkubator (5% CO
2) ved 37 ° C. GAS-en, MKN-28 eller TOS-1 ble henholdsvis hentet fra Kotanagi H (Akita University), japansk Innsamling av forsknings Bioressurser (JCRB) Cell Bank eller Satoh M (Tohoku University). T-celle-leukemi (Jurkat, Molt-4), B-celle-leukemi (Daudi), promyelocytisk leukemi (HL60) av human opprinnelse, human PBL med eller uten rekombinant humant interleukin 2 (IL-2, 100 IU; Shionogi Co . Ltd., Osaka, Japan) og musesplenocyter med IL-2 (100 IU) for ADCC, musmyelomer (SP2, X63) og etablerte hybridomceller ble dyrket i RPMI 1640 medium (RPMI, Sigma-Aldrich) supplert med 7% varme inaktivert FBS under de betingelser som er nevnt ovenfor. For å få aktiverte humane lymfocytter for FCM, PBL ble også dyrket og stimulert med IL-2 (100 IE) i 48 timer eller 12-
O
-tetradecanoylphorbol-13-acetat (TPA, 20 ng /ml; Sigma -Aldrich) pluss Ca ionofor (A23187, 0,3 mikrometer, Calbiochem, La Jolla, CA, USA) for 24 timer i RPMI med 7% FBS. HUVEC (Takara Bio Inc., Otsu, Japan) ble opprettholdt i EGM-2 medium (Lonza, Walkers, MO, USA) og brukes på tredje til femte passasjer. NHEK (Takara Bio Inc.) ble dyrket i HuMedia-KG2 (Lonza) og brukes på tredje til fjerde passasjer. HEK293F humane embryonale nyreceller (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) og en human epidermal keratinocytt-avledet cellelinje (EK325) som er fastsatt av oss ble dyrket i FreeStyle293 ekspresjons-medium (Invitrogen) i en fuktet inkubator (5% CO
2 ). GFP ble genetisk fusjonert til cytoplasma karboksylenden av menneskelige CD44s eller CD44R1 i en pAcGFP ekspresjonsvektor (BD Biosciences, Mountain View, CA, USA), og HEK293F og RH7777 celler ble henholdsvis transfektert med disse CD44-GFP plasmider ved 293fectin (Invitrogen) eller Lipofectamine 2000 (Invitrogen), i henhold til produsentens anvisninger, valgte å bruke kultur medier som inneholder G418 (Nacalai Tesque, Kyoto, Japan) fortynnet til 400 mikrogram /ml, og klone-sortert for cellulær grønn fluorescens ved hjelp av en JSAN celle sorter (Bay Bioscience, Kobe, Japan). Disse etablerte HEK293F og RH7777 cellelinjer som uttrykker CD44-GFP proteiner ble opprettholdt i FreeStyle293 uttrykk medium med G418 (400 ug /ml). Celler ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC), med mindre annet er angitt. De fleste cellelinjer som inneholder HSC-3 ble nevnt andre steder [45].
Eksisterende terapeutiske monoklonale antistoffer
Anti-HER1 kimære Cetuximab (Merck Serono, Rockland, MA, USA), anti-HER2 humanisert Trastuzumab og anti-CD20 kimære Rituximab (Roche-Chugai, Tokyo, Japan) ble anvendt for farging av humane celler eller vev.
Fremstilling av et rekombinant humant lgG1 mAb gjenkjenner CD44R1
MV1, MV2, MV3, MV4 og MV5 humant IgM mAb ble fremstilt fra cellefusjon mellom miltceller av Kirin-Medarex (KM) mus (22) vaksineres mot et rekombinant Δex5-v8-v9-V10-Δex16 (R1a) protein (8) fusjonert til glutation S-transferase (GST) og SP2-musemyelomceller. Fremgangsmåten for cellefusjonen og etablering av hybridomer ble utført som beskrevet i neste avsnitt. I R1a rekombinante proteiner, Δex5 eller Δex16 svarer henholdsvis til en delvis kort peptid (Δex5, 19 aminosyrer, Δex16, 8 aminosyrer) i tilknytning til V8 eller v10. Revers-transkribert cDNA fra den variable region av tunge og lette kjeder, som ble klonet fra total RNA fra hybridomceller som utskiller et IgM (μ, κ humant mAb mot CD44R1 (MV5), var genetisk endret for å cDNA av humant lgG1 (γ1, κ
