Abstract
Differensiering av kreft stamceller (cscs) seg til kreftceller fører til økt følsomhet for cytostatika. Selv om inhibering av pattedyr-target av rapamycin (mTOR) fører til CSC overlevelse, effekten av forgrenede aminosyrer (BCAA), en mTOR-kompleks 1 (mTORC1) aktivator er ukjent. I denne studien undersøkte vi effekten av BCAA på leverkreft (HCC) celler som uttrykker en lever CSC markør, EpCAM. Vi undersøkte effekten av BCAA og /eller 5-fluorouracil (FU) på ekspresjon av EpCAM og andre CSC-relaterte markører, så vel som celleproliferasjon i HCC celler og i en xenograft musemodell. Vi kjennetegnes også CSC-relaterte og mTOR signalrelatert molekyl uttrykk og tumorigenicity i HCC celler med knockdown av Rictor eller Raptor, eller overekspresjon av konstitutivt aktiv rheb (caRheb). mTOR signalrelatert molekyl uttrykk ble også undersøkt i BCAA-behandlede HCC celler.
In-vitro
BCAA reduserte hyppigheten av EpCAM-positive celler og forbedret følsomhet for den anti-proliferative effekt av 5-FU. Kombinert 5-FU og BCAA gitt bedre antitumor effekt enn 5-FU alene i xenograft modell. Stimulering med høye doser av BCAA aktivert mTORC1. Knockdown og overekspresjon eksperimenter viste at inhibering av mTOR-komplekset 2 (mTORC2) eller aktivering av mTORC1 førte til redusert EpCAM ekspresjon og lite eller ingen tumorgenisitet. BCAA kan øke følsomheten til kjemoterapi ved å redusere bestanden av cscs via mTOR veien. Dette resultatet tyder på nytten av BCAA i leverkreft terapi.
Citation: Nishitani S, Horie M, Ishizaki S, Yano H (2013) forgrenede Amino Acid undertrykker Hepatocellulær kreftstamceller gjennom Aktivering av mammalian target of Rapamycin. PLoS ONE 8 (11): e82346. doi: 10,1371 /journal.pone.0082346
Redaktør: Diego Calvisi, Institut für Pathologie, Greifswald, Tyskland, Tyskland
mottatt: 28 juli 2013; Godkjent: 31 oktober 2013; Publisert: 27.11.2013
Copyright: © 2013 Nishitani et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne har ingen finansiering eller støtte til rapporten.
Konkurrerende interesser: Denne forskningen tilhører Ajinomoto Pharmaceutical Company. Forfatterne erklærer at de har søkt om patent knyttet til BCAA brukt i denne studien (Patent navn: Agent for å øke antitumor aktivitet av kjemoterapeutisk stoff, patentsøknad nr: WO2012 /111790). SN, MH og SI er ansatt av Ajinomoto Pharmaceuticals, Co, Ltd Denne studien er utført på dyremodeller, og har ingen direkte konsekvenser for mennesker. Imidlertid vil arbeidet med denne studien oversettes til mennesker i fremtidige studier og dermed denne publikasjonen kan legge til noen fordel for Ajinomoto Pharmaceuticals, Co, Ltd Det er ingen ytterligere patenter, produkter under utvikling erklære. Compounding forholdet mellom BCAA anvendt i denne studien er samme som en blandeforholdet mellom BCAA granuler som selges av Ajinomoto Pharmaceuticals Co. Ltd. i Japan under navnet LIVACT ® granuler. Imidlertid har selskapet ikke trekke en direkte kommersiell nytte av denne studien som det ikke er utført i mennesker. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Begrepet «kreft stamcelle» (CSC) refererer til en kreftcelle med egenskapene til en stamcelle. Stamceller bære potensial til å fornye seg selv og differensiere til andre celletyper, og kan dermed gjenopprette celler som gjennomgår apoptose. Det er en hypotese at karsinom utviklings fra stamceller gjennomgå en prosess med asymmetrisk divisjon. Cscs ble først identifisert i akutt myelogen leukemi [1] og har senere blitt oppdaget i andre kreftformer. En utfordring oppsto da det ble antatt at cscs var resistente mot behandling. Mange kjemoterapeutika målrette aktive prolifererende celler, og kan ikke være effektiv mot celler som gjennomgår begrenset spredning. Overlevende kreftceller ble bestemt til å være en faktor av gjenoppblussing eller metastasering til andre vev [2,3]. Studier har funnet mange CSC markører i ulike kreftformer. I leverkreft (HCC), har CD133 og EpCAM blitt identifisert som CSC markører [4]. Videre cscs uttrykke ABC transportører når aktivt utsettes for cytostatika, bidra til terapeutisk motstand [5]. En kombinasjon studie som undersøkte disse behandlings ildfast cscs funnet at eksisterende kreftceller kan bli helt forankret ute [6]
To tilnærminger til kreftbehandling har blitt foreslått. Våkn opp terapi og Sleep terapi. Våkn opp terapi forbedrer følsomhet for cytostatika ved å indusere differensiering fra cscs til kreftceller. Oncostatin M, et cytokin av IL-6-familien, er en kjent induser av differensiering. Kombinasjonen av dette cytokin med et kjemoterapeutisk middel forbedret antitumor effekt hos et HCC xenograft-modell [7]. Men onkostatin M har ikke blitt klinisk testet. Sleep terapi opprettvelig lav spredning av cscs, men patofysiologien av dette fenomenet er fortsatt uklart. Studier har i hovedsak fokusert på hematopoetiske celler med mammalian target of rapamycin (mTOR) signaler knyttet til differensiering [8,9]. Det er vel kjent at forgrenede aminosyrer (BCAA), særlig leucin, aktiverer mTORC1 [10,11]. BCAA er nødvendig for ammonium metabolismen i musklene når leveren er i stand til å utføre denne funksjonen. Nylige rapporter har vist at BCAA aktiverer albumin-syntese i rotter primære hepatocytter [12] og cirrhose rottelever [13] via mTOR signalering, en sentral regulator av proteinsyntese, ved å detektere næringsforhold [14]. I Japan er farmakologisk kosttilskudd med BCAA granulater brukes til å behandle hypoalbuminemi hos pasienter med dekompensert levercirrhose (LC) [15]. BCAA granuler, foreskrevet tre ganger daglig etter måltider for å gi en total daglig dose på 12 g av BCAA, har en 2: 1: 1,2 vektforhold mellom leucine til isoleucin til valin. BCAA undertrykker opptreden av HCC i dyremodeller [16,17] og LC-pasienter [18]. Vi har fokusert på å indusere differensiering CSC, særlig forbedringen av kjemoterapeutiske følsomhet. CSC differensiering ble evaluert ved å aktivere mTORC1 med BCAA, og den anti-tumor effekt av kombinasjonen av BCAA og kjemoterapeutisk middel ble undersøkt
in vitro
og
vivo
. Resultatene vil være av stor verdi for å forstå den kliniske effekten av leverkreft hos pasienter med LC.
Materialer og metoder
Alle dyr arbeidet ble gjennomført i henhold til relevante nasjonale og internasjonale retningslinjer.
cellekultur og reagenser
To HCC cellelinjer, HAK1-B [19] og Huh7, ble opprettholdt i RPMI 1640 (Nacalai Tesque, Japan) og DMEM (Nacalai Tesque, Japan) henholdsvis eller LC medium, som er et medium med lav Fischer-forhold (forholdet mellom BCAA-konsentrasjonen i løpet av aromatisk syrekonsentrasjon) [20] inneholdende 1% penicillin /streptomycin og 10% føtalt bovint serum (FBS). Reagenser som brukes inkluderte anti-EpCAM FITC konjugert antistoff (Abcam, USA), Hoechst 33342 løsning (DOJINDO, Tokyo, Japan) for nukleær farging og celle nummer telling av matrise skanning system (Thermo Fischer teknologi, USA); 5-Fluorouracil (5-FU) ble hentet fra Kyowa Kirin, Japan.
Plasmid bygging av rheb konstituerende aktiv form
Flag-caRheb plasmid ble gitt av Dr. Tomohiko Maehama (The Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science, Tokyo, Japan).
shRNA plasmider
Små hårnål RNA (shRNA) plasmider ble hentet fra iGENE therapeutics (USA).
shRNA lipofektamin systemet ble utformet i henhold til produsentens instruksjoner. Måltallene sekvenser av shRNA var som følger: sh-Raptor: 5′-GCGGAAAGGATTATGGGT-3 «; sh-Rictor: 5»-GTAGAAAGTTCAACGAGCT-3 «; og U6RepT7STOP (sh-RNA-kontroll-vektor): 5»-CACCTTTTTTTAAAAAAATCCT-3 «
Kvantitativ sanntids-polymerase kjedereaksjon (Q-PCR)
Q-PCR ble anvendt for å detektere mRNA. nivåer av CYP3A4, Bmi1, EpCAM, FOXO3a, Raptor, og Rictor. Totalt 1 × 10
5 HAK-1B-celler ble sådd i RPMI 1640 medium som inneholder 10% FBS i 24 timer før eksperimenter. BCAA (4 mM) ble tilsatt til mediet og opprettholdt i 72 timer. RNA ble isolert ved hjelp TriPure isolasjon reagens (Roche Applied Science) og komplementær DNA (cDNA) ble syntetisert ved hjelp av High Capacity cDNA revers transkripsjon kit (Applied Biosystems, Carlsbad, California). Real-time polymerase chain reaction (PCR) ble utført ved hjelp av 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems) og Power SYBR Grønn PCR Master Mix (Applied Biosystems) inneholder spesifikke primere, i henhold til produsentens instruksjoner. Hver prøve ble normalisert til GAPDH ekspresjon
Primer sekvenser for PCR var som følger: CYP3A4:. Forover 5′-TTGGAAGTGGACCCAGAAAC-3 «, revers 5′-CTGGTGTTCTCAGGCACAGA-3′; Bmi1: forover 5»-CCAGGGCTTTCAAAAATGA-3 «, reverse 5′-GCATCACAGTCATTGCTGCT-3′; EpCAM: sender 5»-GCTGGTGTGTGAACACTGCT-3 «, revers 5′-ACGCGTTGTGATCTCCTTCT-3»;
FOXO3a: sende 5′-TGCTGTATGCAAGAACTTTCCAGTAGCAG-3 «, reverse 5′-ACTCTAGCCCCCATGCTACTAGTG-3»; Raptor: fremover
5′-CCCTGCTACTCGCTTT-3 «, reverse 5′-GTGAGGTGTTTCCCCT-3»;
Rictor: fremover 5′-GGAAGCCTGTTGATGG-3 «, reverse 5»-GGCAGCCTGTTTTATG-3 «
celle~~POS=TRUNC og EpCAM-positiv celle påvisningsmetode
Cellene ble dyrket i nærvær eller fravær av BCAA i 72 timer og deretter fiksert ved hjelp av 4% paraformaldehyd og farget med Hoechst 33342 (10 mg /ml, Dojindo, Tokyo, Japan) i 1 min. Celletellinger ble utført ved anvendelse av målet aktiverings protokoll og en skannerekkesystemet. EpCAM-positive celler ble påvist ved farging av fikserte celler med EpCAM-konjugert FITC-antistoff i 1 time, og antallet EpCAM-positive celler per 5000-celler ble detektert ved skannesystemet
Apoptose assay
Cellene ble dyrket med 5-FU (0, 1, 2 ug /ml) i nærvær eller fravær av 2 mM BCAA i 72 timer i 96-brønners plater (BD Biosciences). Annexin V binding til cellemembraner ble visualisert med en Annexin V-FITC deteksjon kit (TAKARA BIO INC, Tokyo, Japan) og Hoechst 33342 løsning av matrisen scan.
Western blotting
Totalt 1 × 10
5 Huh7 celler ble sådd i DMEM medium 24 timer før for å studere eksperimenter. Mediet ble byttet ut med LC-medium i 3 dager eller DMEM-medium med forskjellige behandlinger: knockdown i 5 dager, overekspresjon for en dag, og BCAA-behandling i 30 minutter eller 3 dager. Western blotting ble utført på vanlig måte. Celler ble vasket i fosfatbufret saltvann (PBS) og lysert i RIPA-buffer inneholdende fullstendig protease og fosfatase-inhibitor cocktail (Roche Applied Science, Indianapolis, INC). Membranene ble blokkert i Blocking One-P (Nacalai Tesque, Japan). Antistoffer inkludert kanin anti-Rictor (Cell Signaling Technology, Beverly, MA), kanin anti-raptor (Bethyl Laboratories, Montgomery, Texas), kanin anti-p-70S6 kinase, anti-total-p-70S6 kinase, kanin anti-p -4EBP1 (T37 /46), kanin anti-p-Akt (T308 eller S473), kanin anti-p-GSK3p (S9), kanin anti-β-catenin (Cell Signaling Technology, Beverly, MA) og mus anti- a-tubulin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Densitometry ble utført direkte på utslettet membranen ved hjelp av en CCD kamerasystem (LAS-4000 Mini, Fujifilm, Tokyo, Japan).
Knockdown Eksperimenter
Huh-7 celler ble transfektert med negativ kontroll (NC) eller target (mTORC1 eller mTOR2 regulatoriske assosiert protein av Raptor og Rictor) liten hårnål RNA (shRNA) med Lipofectamine ™ LTX reagens (Invitrogen Technology, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. Stabile transfektanter ble valgt ut, som tidligere beskrevet [21], for resistens overfor puromycin i 2 dager og deretter dyrket i DMEM inneholdende 10% FBS i 2 dager. Q-PCR og Western blotting bekreftet knockdown effekt.
Dyrestudier
Animals.
Følgende forsøksprotokoll ble gjennomgått og godkjent av Animal Care komité Ajinomoto Co., Inc. BALB /c nakne mus, eller NOD /SCID-mus i en alder av 6 uker ble oppnådd fra Charles River Japan (Yokohama, Japan). De ble holdt i individuelle bur i et rent, luftkondisjonerte rom (24 ± 1 ° C) med en 12 h-12 h lys-mørke-syklus (lys på 0700-1900). Dyrene ble fôret en aksje sterile pulver diett (CRF-1, Oriental gjær, Tokyo, Japan).
Kjemoterapi.
En million HAK-1B celler ble suspendert i 100 ul RPMI 1640 med FBS, og en subkutan injeksjon ble utført. Forekomsten og størrelse av subkutane svulster ble registrert når den gjennomsnittlige volum hadde nådd 100 mm
3 som tidligere beskrevet [7]. Tumor injeksjoner av 50 ul av 10% DMSO /PBS (kontroll), eller 5-FU (250 ug /tumor) ble gitt to ganger ukentlig og 3% BCAA-supplementert eller 3% kasein-supplert diett ble gitt daglig i 2 uker utgangs 7 dager etter tumorcelle injeksjon. Tumorvolumer ble evaluert ved hjelp av kalibermålinger og beregnet med formelen V = 1/2 ×
en
2 ×
b
der
en
er den korte aksen og
b
er den lange aksen av svulsten. På de 14
th dag ble alle musene avlivet under bedøvelse, ble isolert tumorene veies, deres volumer beregnet, og vev analysert for mRNA-ekspresjon.
tumorgenese.
En million celler Huh7 transfektert med lipofectal partikler som inneholder NC, Raptor, eller Rictor shRNA, kontroll plasmid cDNA (pcDNA), eller flagg caRheb plasmid ble høstet og injisert subkutant i NOD /SCID-mus (n = 5 i hver gruppe). Tumorvolumene ble undersøkt som før. Mus som bærer NC, knockdown (KD), ble eller eldre uttrykk xenografter avlivet etter 4 uker.
statistiske metoder.
Resultatene ble uttrykt som gjennomsnitt ± SE. Betydning ble bestemt i EXSUS versjon 7.7.1 (CAC Corporation, Tokyo, Japan) ved å utføre Dunnetts test, Tukey test og Student
t
-test, og forskjeller ble ansett signifikant ved P-verdiene 0,05
Resultater
Effekten av BCAA på EpCAM-positivitet i HAK-1B celler
HAK-1B cellene var omtrent 10% EpCAM-positive (figur S1).; dette ble redusert betraktelig på en doseavhengig måte i nærvær av 1-4 mM BCAA (figur 1A). 4 mM BCAA førte til en økning i ekspresjonen CYP3A4 mRNA, en differensiert markør, og derimot 1-4mM BCAA tendens til å avta i ekspresjonen av mRNA Bmi1, en udifferensiert markør (figur 1B). Disse resultatene tyder på BCAA redusert EpCAM-positivitet via differensiering. Derfor evaluert vi kjemoterapeutisk følsomheten HAK-1B inneholder EpCAM-positive celler. Annexin V-ekspresjon, som ble brukt til å detektere de primære apoptose arrangementet, økte med økende doser av 5-FU; denne økningen var større i celler behandlet med kombinasjonen BCAA og 5-FU (figur 1C). I tillegg ble HAK-1B spredning mer sterkt inhibert ved en kombinasjon av BCAA og 5-FU enn med 5-FU alene (figur 1D).
Dunnetts test, * p 0,05, ** p 0,01 n = 6, middelverdi ± SE.
Prosenten av Annexin V-positive celler (C) og relativ levedyktig celletall (D) av matrisen skanne i HAK-1B-celler dyrket i RPMI1640 inneholdende 10% FBS med eller uten 2 mM BCAA i nærvær (1 eller 2 ug /ml) eller fravær av 5-FU i 72 timer ved hjelp av target aktivering protokoll fra matrisen scan. Student
t
-test, * p 0,05, ** p 0,01, n = 7, gjennomsnitt ± SE.
De samme resultatene ble oppnådd med Huh7 celler og er vist i Figur S2 AB.
kjemoterapeutiske følsomhet
in vivo
for å teste hypotesen om at EpCAM positivitet øker kjemoterapeutisk følsomhet i nærvær av BCAA, vi brukte kombinert BCAA og 5-FU behandling i et BALB /c naken mus modell transplantert med subkutan HAK-1B.
Antitumor effekt var signifikant med 5-FU alene, og et enda sterkere antitumor effekt ble oppnådd med kombinasjonen BCAA og 5-FU behandling. Men det antitumoreffekt av BCAA alene var ikke bemerkelsesverdig (figur 2A, B, figur S3). EpCAM mRNA uttrykk ble betydelig redusert i BCAA-behandlede mus tumorer (Figur 2C). FOXO mRNA (figur 2D), rapportert å være uttrykt i cscs [22], ble signifikant redusert på en lignende måte.
Den relative ekspresjon av mRNA av ulike molekyler av hver tumor ble forbundet med CSC egenskaper (C, D). Kontroll: 10% DMSO /saltvann /tumorinjeksjon + 3% kasein inneholdende diett, 5-FU: 250 ug /tumorinjeksjon + 3% kasein inneholdende diett, BCAA dietten: 10% DMSO /saltvann /tumorinjeksjon + 3% BCAA inneholdende 5-FU + BCAA dietten: 250 ug /tumorinjeksjon + 3% BCAA inneholdende diett i 14 dager. Tukey test: * p 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001 vs. kontroll, #p 0,05 vs. 5-FU, $$ p 0,01 vs. BCAA, n = 6, gjennomsnitt ± SE.
Mekanisme BCAA effekter på EpCAM-positive Huh7 celler
Vurderer den eksperimentelle transfeksjon effektiviteten av Huh7 celler, brukte vi dem for å evaluere mekanismen for BCAA, forutsatt at 40% av Huh7 ble EpCAM-positive som tidligere rapportert [7]. Som i HAK-1B, ble EpCAM-positive celler i Huh7 signifikant redusert med BCAA; i tillegg ble mTORC1 aktivert ved BCAA behandling og hemmet av rapamycin (figur 3A, figur S4A). Reduksjonen i EpCAM-positive celler på grunn av BCAA ble fullstendig opphevet ved forbehandling med rapamycin, en inhibitor av mTORC1 (figur 3A, figur S4A). I tillegg LC medium, en lav Fischer-forhold medium, hemmet mTORC1 aktivitet og økt hastighet på cscs (figur 3B). mTORC1 aktivering ble undertrykket ved LC-medium (figur 3B, fig S4B).
renteendring på EpCAM-positive celler i 5000 celler med overekspresjon av caRheb eller kontroll plasmid cDNA (pc DNA) i kontrollmedium (DMEM inneholder 10% FBS) med og uten 4 mM BCAA stimulering i 24 timer i Huh7 (C).
påvisning av P70S6 kinasefosforylasjon, et medlem av nedstrøms mTOR signalering, i nærvær av DMEM, BCAA behandling, forbehandling med rapamycin og BCAA behandling, eller LC stimulering i 72 timer i Huh7 ( A, B).
Tukey test ** p 0,01 vs. kontroll, $$$ p 0,001 g BCAA, n = 8, gjennomsnitt ± SE (A)
Student t-test * p 0,05, **** p 0,0001, n = 8, gjennomsnitt ± SE (B, C).
Til slutt EpCAM-positive celler ble betydelig redusert ved mTORC1 aktivering via overekspresjon av caRheb, en aktiverende faktor på mTORC1 uten BCAA stimulering ( Figur 3C). Dermed blir virkningen av BCAA på EpCAM-positive celler var avhengig av mTORC1 aktivering.
Sammenhengen mellom mTOR signal og EpCAM-positivitet
De mTOR signaler inkluderer to undergrupper: mTORC1 og mTORC2 [23]. Spesielt har mTORC1 Raptor, et regulatorisk protein av mTORC1 komplekse, og blir stimulert av BCAA, spesielt leucine. I kontrast, har mTORC2 Rictor, et regulatorisk protein av mTORC2 komplekset, som signaliserer Akt nedstrøms.
Rapamycin hemmer mTORC1 og mTORC2, avhengig av varigheten av stimulering [24,25]. Dermed kan vi fastslå effekten av å hemme mTORC1 alene eller dual hemming av mTORC1 /2 på EpCAM-positive celler ved forbehandling med rapamycin i 1 time eller 24 timer, henholdsvis. Vi fant ut at EpCAM-positive celler økte signifikant med hemming av mTORC1. I motsetning til dette, EpCAM-positive celler ble redusert med dual inhibering av mTORC1 /2, spesielt mTORC2 hemming, ved forbehandling i 72 timer (Figur 4A).
Dunnetts test, * p 0,05, *** p 0,001 vs. kontroll, n = 6, gjennomsnitt ± SE
De relative uttrykk for EpCAM, c-myc, og FOXO3a mRNA ved Raptor og Rictor knockdown (BD)
Dunnetts test, ** p 0,01, *** p 0,001 vs kontroll n = 8, gjennomsnitt ± SE.
Disse funnene tyder på nærvær eller fravær av EpCAM-positive celler er avhengig av mTORC1 eller mTORC2, respektivt. Vi undersøkte deretter ekspresjonen av EpCAM mRNA i nærvær av mTORC1 eller mTORC2 tap av funksjon ved knockdown av Raptor eller Rictor, respektivt. Tap av mTORC1 funksjon forårsaket EpCAM mRNA-ekspresjon for å øke på samme måte som mTORC1 inhibering ved forbehandling med rapamycin i 1 time. Men tap av mTORC2 funksjon forårsaket EpCAM mRNA uttrykk for å redusere betraktelig. Videre er c-myc og FOXO3a mRNA-ekspresjon omsatt på samme måte som EpCAM mRNA ekspresjon (figur 4B-D).
Rictor, Raptor, og β-catenin var også forbundet med mTOR og Wnt /β-catenin signaler (figur 5A). Når mTORC1 ble hemmet av Raptor knockdown, fosforylering av p70S6 kinase, nedstrøms signal av mTORC1, redusert, og fosforylering av Akt (Ser473) økt. Dette tyder på at hemming av mTORC2 fosforylering av P70S6kinase ble opphevet ved Raptor knockdown. I motsetning til dette, når mTORC2 ble inhibert med Rictor knockdown, fosforylering av p70S6 kinase økt, og fosforylering av Akt redusert.
Rictor eller Raptor knockdown i forhold til negativ kontroll (NC), caRheb sammenlignet med kontroll plasmid cDNA (pc DNA), BCAA behandling sammenlignet med DMEM (FBS 10%) bare (Ctrl) (A). Den gjennomsnittlige tumorvolumer og tumorigenesis forhold på 4
th uke i en xenograft modell med transplanterte celler med negativ kontroll, knockdown av Raptor, Rictor i 5 dager, eller overekspresjon av kontroll plasmid-DNA, caRheb for en dag (C), og tumorigenesis rate (B)
Dunnetts test, * p. 0,05, *** p 0.001 vs. N.C. n = 5, gjennomsnitt ± SE.
Når mTORC1 ble aktivert ved caRheb overekspresjon eller 4 mM BCAA behandling, fosforylering av p70S6 kinase økt og fosforylering av Akt redusert. Videre ble β-catenin protein ble redusert ved inhibering av fosforylering av GSK3P via mTORC1 aktivering.
I tillegg GSK3P ble fosforylert av Akt (Ser473) som reaksjon på Raptor knockdown; imidlertid, fosforylering av GSK3P og β-catenin protein ble ikke påvirket av Rictor knockdown.
tumorigenesis av mTOR-knockdown og mTORC1-aktiverte celler
Aktivering av mTORC1 eller hemming av mTORC2 ble antatt å undertrykke EpCAM-positive celler. Den tumorigent evne cscs ble undersøkt ved hjelp av en xenograft modell subkutant implantert med Raptor eller Rictor knockdown, kontroll plasmid cDNA, eller caRheb overekspresjon Huh7 celler i mus for 4 uker (Figur 5B og 5C).
BCAA aktivert mTORC1; har imidlertid BCAA to effekter på mTORC1. Stimulering med høye doser av BCAA redusert EpCAM-positive celler via aktivering av mTORC1, mens stimulering med lave doser økte EpCAM-positive celler via hemming av mTORC1 (figur 3A og 3B). Høy dose BCAA kan ikke opprettholdes gjennom svulst implantasjon, og tumorigenesis ble ikke etablert når celler behandlet med høydose BCAA ble subkutant implantert. I stedet brukte vi caRheb-overekspresjon celler som mTORC1 aktiverende celler for tumorigenesis studien, som kan opprettholde mTORC1 aktivering i minst en uke.
Selv om tumorstørrelse var mindre i gruppen implantert med Raptor knockdown celler enn i den negative kontrollgruppen (figur 5C), tumorigenese ble opprettholdt i alle 5 mus, i likhet med den negative kontroll transfeksjon celle implanterte gruppe (figur 5B). De to grupper bestående av Rictor knockdown-celler og caRheb overuttrykker celler hadde 0/5 mus eller bare 1/5 mus bibeholder tumorgenese potensialet, respektivt. Videre tumorstørrelse i caRheb overekspresjon gruppe var mindre enn i kontrollgruppen plasmid cDNA gruppe.
Diskusjoner
En av de nye bidragene i denne studien var å finne at kreftceller opplevd økt følsomhet for kjemoterapi etter EpCAM-positive celler differensiert etter BCAA behandling via mTORC1 aktivering (figur 1). I tillegg er lav BCAA stimulering med LC medium med en lav Fischer-forhold (forholdet mellom BCAA-konsentrasjonen i løpet av aromatisk syrekonsentrasjon), førte til undertrykkes mTORC1 aktivering, noe som resulterer i økt EpCAM-positive celler (figur 3B). Hos pasienter med kronisk hepatitt eller cirrhose, hypoalbuminemi og redusert plasmaverdiene for Fischer forholdet mellom BCAA til aromatiske syrer er ofte observert [26]. Disse pasientene kan utvikle HCC eller har et tilbakefall av HCC. BCAA tilskudd er kjent for å forbedre Fischer-forholdet i levercirrhose [27]. Derfor kan en høyere Fischer ratio hindre leverkreftutvikling eller tilbakefall på grunn av cscs. I Japan er BCAA granulater indisert for dekompensert levercirrhose hos pasienter med hypoalbuminemi tross tilstrekkelig inntak, og peroral administrasjon av BCAA granulater løfter konsentrasjonene av plasma BCAA på ca 1 mm [20]. Etter oral administrasjon av BCAA i rotter ble plasmakonsentrasjonen av BCAA i portalvenen var flere ganger høyere enn den konsentrasjon av BCAA i perifert blod (data ikke vist). Derfor vurderte vi at konsentrasjonen av BCAA brukes
in vitro plakater (2
~ 4 mm) var ikke signifikant forskjellig fra konsentrasjonen av BCAA
in vivo
.
Vi fant også at mTORC1 aktivering av BCAA behandling trykt EpCAM-positive celler og økt følsomhet av kjemoterapeutika i HCC tumor (figur 2). Vi undersøkte EpCAM mRNA i leveren etter administrering av BCAA i normale mus for å undersøke om det er noen virkning på leveren. Som et resultat, har BCAA ikke viser noen effekt på ekspresjonen av EpCAM i leveren (data ikke vist).
Mekanismen av virkningen av BCAA-behandling på EpCAM-positive celler ble evaluert ved akselerert differensiering til kreft celler via aktivering av mTORC1. Fosforylering av GSK3P ble inhibert ved å aktivere mTORC1 og nedstrøms Wnt /β-catenin signal, mens fosforylering av β-catenin ble opprettholdt, noe som resulterer i β-catenin degradering. Det ble antydet at dette inhiberte den kjernefysiske translokasjon av β-catenin, og deretter hemmet transkripsjon av c-myc, EpCAM, og Bmi1. Videre ble nedstrømssignalene fra EpCAM bestemt til å ha en c-myc transkripsjon signal [28], som korrelert med ekspresjonen av EpCAM og c-myc. Dette antydet at EpCAM, nedsatt c-myc ekspresjonen og mTORC1 aktivering økte følsomhet overfor kjemoterapi (figur 2).
Videre fant vi at mTORC1 aktivering redusert protein uttrykk for Rictor via overekspresjon av caRheb (figur 5A). Studier har tidligere rapportert at aktivering av p70S6 kinase tilbakemelding hemmet Rictor fosforylering, noe som resulterer i undertrykkelse av Rictor funksjon [29]. Men våre data viser at protein uttrykk for Rictor redusert. Den mekanismen som mTORC1 aktivering redusert protein uttrykk for Rictor fortsatt uklart, og er en potensiell fremtidig forskning retning.
Inhiberingen av mTORC2 funksjon av Rictor knockdown førte til aktivering av p70S6 kinase, et signal av mTORC1, redusert EpCAM, c-myc, og FOXO3a uttrykk, og fosforylering av Akt, men hadde ingen effekt på GSK3p og protein ekspresjon av β-catenin. Det var ikke klart hvorvidt p70S6 kinase ble direkte aktivert av Rictor knockdown, selv om det er mulig at mTORC1 aktivering og inhibering av Akt-signaler ført til redusert EpCAM uttrykk. Flere studier har antydet at hemming av mTORC2, og ikke mTORC1, undertrykker kreftutvikling [19,30]. I andre rapporter, fosforylering av Akt (Ser473) korrelerte signifikant med kreft stemness [31,32]. Klinisk forskning har rapportert at pasienter med høyt Rictor eller EpCAM mRNA uttrykk i isolerte leverkreft hadde en høyere rate av tilbakefall [33,34].
I denne studien våre funn tyder på at CSC potensialet er sterkt assosiert med mTORC signaler. Videre har mTORC2 en rolle i å opprettholde stamcellepotensial mens mTORC1 undertrykker dette potensialet (figur 6).
Underernæring eller lav Fischer forholdet trykkes mTORC1 aktivering som førte til økt kreft stemness. I motsetning opprettholder mTORC2 kreft stemness. Men hemmer mTORC1 mTORC2. BCAA undertrykker kreft stemness ved aktivering av mTORC1, og forbedrer antitumor effekt av kjemoterapi.
Det er mulig at aktivering alene av mTORC1 av BCAA behandling førte til redusert Rictor protein uttrykk, som var lik Rictor knockdown, og dermed hemme mTORC2 og aktivering mTORC1. Disse funnene antyder at mTORC2 kan være en sann kreft terapeutisk mål, særlig i karsinogenese relatert til CSC og aktivering av mTORC1 alene fører til reduksjoner i EpCAM og c-myc ekspresjonen. Derfor anbefaler vi at nye kreft terapi strategier tar sikte på å hemme mTORC2 og aktivere mTORC1 samtidig.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
representativt bilde av EpCAM positiv celle som ble farget som en metode som er beskrevet i Materialer og amp; Metoder
doi:. 10,1371 /journal.pone.0082346.s001 plakater (TIF)
Figur S2.
Prosentandelen av annexin V-positive celler (A) og relative levedyktig celletall (B) av matrisen skanne i Huh7-celler dyrket i DMEM inneholdende 10% FBS med eller uten BCAA 4 mM i nærvær av (1 eller 2 ug /ml) eller fravær av 5-FU i 72 timer ved hjelp av target aktivering protokollen rekke scan. Student
t
-test, * p 0,05, ** p 0,01, n = 7, gjennomsnitt ± SE
doi:. 10,1371 /journal.pone.0082346.s002 plakater (TIF)
Figur S3.
Tumor volum i HAK-1B xenograft mus modell på den 14. dagen etter inntak av BCAA og 5-FU-injeksjon. Tukey test: * p 0,05, ** p 0,01 vs. kontroll, $$ p 0,01 vs. BCAA, n = 6, gjennomsnitt ± SE
doi:. 10,1371 /journal.pone.0082346.s003 plakater (TIF)
Figur S4.
Påvisning av total-p-70S6 kinase i nærvær av DMEM, BCAA behandling, behandling med rapamycin (A) og BCAA-behandling, eller LC stimulering (B) i 72 timer i Huh7
doi:. 10,1371 /journal.pone.0082346.s004 product: (TIF)
