Abstract
Aggressive kreftfremvise en effektiv konvertering av store mengder glukose til laktat ledsaget av syresekresjon, et fenomen kjent som den Warburg virkning. Den sure mikromiljøet og den alkaliske cytosol skape en proton-gradient (syre gradient) over plasmamembranen som representerer proton-motiv energi. Økende eksperimentelle data fra fysiologiske relevante modeller tyder på at syre gradient stimulerer tumor spredning, og kan også støtte sitt energibehov. Imidlertid er direkte biokjemiske bevis knytter ekstracellulære syre gradient til generasjon av intracellulær ATP mangler. I dette arbeidet, viser vi at kreftceller kan syntetisere vesentlige mengder av fosfatbindinger fra fosfat i respons til syre gradienten over plasmamembranen. Den kjente fenomen eksisterer i fravær av glykolyse og mitokondrielle ATP syntese, og er unik for kreft. Biokjemiske analyser ved anvendelse av levedyktige kreftceller og renset plasmamembranvesiklene som anvender radioaktivt fosfat, bekreftet fosfat-binding syntese fra fri fosfat (P
i), og også lokalisering av denne aktiviteten til plasmamembranen. I tillegg til ATP, dominerende dannelse av pyrofosfat (PP
i) fra P
i ble også observert da plasma membran vesikler fra kreftceller ble utsatt for trans-membran syre gradient. Kreft cytosols ble funnet stand til å konvertere PP
i til ATP, og også stimulere ATP syntese fra P
i fra blemmer. Acid gradient skapt gjennom glukosemetabolismen av kreftceller, som observert i tumorer, viste seg også kritisk for fosfat-bindingen syntese. I korte trekk, disse observasjonene viser en rolle surt svulst miljøet som en potensiell energikilde og kan tilby en roman terapeutisk mål
Citation. Dhar G, Sen S, Chaudhuri G (2015) Acid Gradient over plasmamembranen Can Kjør fosfat Bond Synthesis i kreftceller: Surt Tumor Milieu som en potensiell energikilde. PLoS ONE 10 (4): e0124070. doi: 10,1371 /journal.pone.0124070
Academic Redaktør: Marie-Joelle Virolle, Universitetet Paris Sør, FRANCE
mottatt: 01.12.2014; Godkjent: 25 februar 2015; Publisert: 15 april 2015
Copyright: © 2015 Dhar et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd til GC fra Carl og Roberta Deutsch Foundation og Kelly Day. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Warburg-effekten er en metabolsk kjennetegn på mest aggressive kreftceller, hvorved det meste av glukose omdannes til laktat i nærvær av oksygen [1, 2]. Den aerob glykolyse er ledsaget av surgjøring av tumormikromiljøet [3, 4] som overfører selektive vekstfordel til kreftceller ved omprogrammering metabolsk [5-7], økes invasivitet [8-10] og regulering av cellesyklusen [11]. Aggressiv kreft celler krever ATP for å generere nok byggeklosser som proteiner, lipider og DNA for spredning. Omdannelse av glukose til laktat produserer bare to molekyler av ATP i motsetning til 38 molekyler når koplet til oksidativ fosforylering [12]. Derfor, selv om aerob glykolyse og ekstracellulære forsuring overfører selektiv vekst fordel for kreft som omtalt ovenfor, om hvordan kreftcellene møte sin energibehovet under denne tilstanden forblir et paradoks.
Acid gradient eller proton drivkraften tvers membranene er en kilde til energi som brukes av mitokondriene, kloroplast og den mikrobielle verden for å syntetisere fosfatbindinger [12-16]. Først foreslått av Peter Mitchell i sin berømte chemo-osmotisk teori [17], forble syre gradient over membranen den mest anvendte metoden i levende systemer for å lagre energien fra metabolske drivstoff som elektrokjemisk potensiell energi. Cellemaskineriet senere utnytter denne energien til å drive syntesen av høyenergi fosfatbindinger i form av ATP og andre strøm molekyler for utnyttelse i cellulære prosesser. [13, 16].
Det er interessant å merke seg at selv om det ekstracellulære pH-verdien av kreftceller er sur, er den intracellulære pH-verdien mer basisk når sammenlignet med normale celler [3, 18, 19]. Den alkaliske intracellulære pH-verdien og syre ekstracellulære pH med plasmamembranen i mellom utgjør en betydelig pool av proton-motiv energi. Tumorer å være i stand til å utnytte denne lagrede potensielle energien til å drive med høy-energi fosfatbinding syntesen i cellene forblir en mulighet. Det er sterke fysiologiske bevis for betydningen av syre gradient i kreft som allerede er etablert av andre forskere. Det ble observert at økning av ekstracellulære pH-verdien ved injeksjon av alkaliske buffere inn i tumoren miljø reduserte tumorstørrelse og metastase også hemmet [20, 21]. Videre kreftcellene utviser forbedret spredning og invasivitet i surt ytre miljø [8-10, 22]. Dette in-vivo fysiologiske bevis tyder på at syre gradient, uavhengig av hvilken modus av magesyre, stimulere spredning av kreftceller, og er også støttende for sine energibehov. Men direkte biokjemiske bevis knytter ekstracellulære syre gradient til generasjon av intracellulært ATP har vært mangelfull, og dette er fokus for dette arbeidet. Det er utfordrende å bekrefte ATP syntese i respons til syre gradient med sikkerhet mens de eliminerer bidrag fra glykolyse eller mitokondrier i en in-vivo system. Inhibering av glykolyse eller mitokondriene in-vivo ville være dødelig. Men dette kan bli undersøkt utnytte dyrkede celler og rensede plasma membran vesikler. Radioaktivt fosfat kan brukes for å bekrefte hvorvidt de nye fosfatbindinger blir dannet fra fri fosfat og ikke av fosfatbinding utveksling. Arbeidet presenteres her bekrefter at kreftceller kan syntetisere betydelige mengder fosfat obligasjoner fra fosfat som svar på syre gradient over plasmamembranen.
Materialer og metoder
Material
Cell linjer som ble anvendt ble oppnådd fra ATCC og ble dyrket som anvist. Celler ble høstet når 80-85% konfluens ved skraping med kald PBS inneholdende 10% FBS, uten behandling med trypsin, for å bevare overflateproteiner.
32P
i ble erholdt fra Perkin Eimer og ble behandlet med reker alkalisk fosfatase, etterfulgt av varmeaktivering for å fjerne forurensende PP
i. Alle andre kjemikalier med mindre annet er nevnt ble kjøpt fra Sigma Chemicals.
analyse for mengder av ATP i cellene i respons til syre gradient
Cell suspensjoner (2-3 millioner celler /ml) i PBS eller bis-tris-buffer, inneholdende 10% FBS og brakt til stabil tilstand ved inkubering ved 37 ° C i 20-30 minutter, ble surgjort enten ved tilsetning av 4 volumer av reaksjonsbuffer (20 mM bis-tris, 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 5 mM MgCl
2, eller ved å tilsette små porsjoner av fortynnet HCl. reaksjonen ble stoppet ved å virvle med kloroform. det vandige lag ble anvendt for å måle ATP ved hjelp av luciferase luminescens assay kit (Promega).
Bestemmelse av størrelsesorden reaksjon (n)
skråningen av linjen av log (A /A
o-1) eller log (A-A
o) mot pH gir størrelsesorden reaksjon. A
o og A er de mengder av ATP før og etter tilsetning av syre hhv. Detaljer om den matematiske modellen er gitt i tilskudd S1 fig.
Laster celler med
32P
jeg og svar på syre
Om lag 10-12 millioner celler ble høstet fra kultur plater med scrapping i kaldt PBS-20% FBS. De ble deretter vasket med cellesuspensjon buffer SB som er 50 mM HEPES-MES (1: 1) pH 7,6, 100 mM NaCl, 2 mM KCl, 2 mM MgCl
2, 0,2 mM CaCl
2, 0,4 mM spermin (relativt frisk), 0,25 mg /ml BSA, og deretter suspendert i 1 ml av den samme buffer, inkubert ved 37 ° C i 30 minutter med leilighetsvis blanding. Cellepelleten ble utvunnet og suspendert i friskt 500 ul buffer SB og inkubert ved 37 ° C i 5 minutter. Til dette ble det tilsatt 5 uM oligomycin og 1 pM atractyloside og holdt på is i 15 minutter. Ouabain (0,2 mM) ble tilsatt og inkubert på is i ytterligere 15 minutter. Lokal forsuring på grunn av bosetting av cellene ble unngått i alle trinn ved forsiktig å snu rørene og til. Etter inkubering ved 37 ° C i 5 minutter ble en blanding av kald natriumfosfat, pH 7,5 og radioaktivt fosfat (
32P
i) ble tilsatt slik at den endelige fosfatkonsentrasjonen var 1 mM med omtrent 0,20 mCi /ml av radioaktivitet . Dette ble deretter inkubert i kulden i 45 minutter med forsiktig rotasjon. Cellepelleten ble utvunnet ved sentrifugering og vasket med 500 ul vaskebuffer (WB) som var buffer SB inneholdende 1 mM natriumfosfat, 0,2 pM bafilomycin i tillegg til oligomycin, atractyloside og ouabain som før. Cellene ble suspendert i WB til en densitet på 10 millioner celler /ml og aliquoter av ca. 175 ul ble tatt opp i separate 1,5 ml rør. Etter inkubering i 1 minutt ved 37 ° C, ble cellesuspensjoner surgjort til den ønskede pH ved tilsetning av små porsjoner av fortynnet HCl og inkubert i 45 sekunder til ett minutt, hvoretter cellene ble pelletert ved sentrifugering ved lav hastighet, og supernatanten ble fjernet. Til pelleten ble det tilsatt 75 ul kloroform og virvles. Pelleten skal bli suspendert i kloroform for effektiv lysering av cellen. Ved tilsetning av syre inntil det punkt da kloroform ble tilsatt, ble ansett som den inkubasjonstid i syre og var typisk ca. 90 sekunder til 2 minutter. 50 ul av ekstraksjonsbuffer (EB), som var 1 mM kaliumfosfat, pH 6,5, 0,2 mM EDTA, ble tilsatt, vortex-omrørt og deretter holdt i vibrator i 10-15 minutter. Dette ble så sentrifugert, og det vandige lag ble forsiktig tatt ut og oppbevart ved -80 ° C. For analyse av prøven, ble omtrent 20 pl av det vandige ekstraktet tørket ved speed-vac og analysert ved TLC. Prøver ble også brukt til å beregne den absolutte mengden av ATP ved hjelp av luciferase luminescens analysesett (Promega).
Enzymatisk karakterisering av produktene fra
32P
Jeg lastet celler
Den vandige trekke ut fra surgjøring av celler ble fortynnet med 4 volumdeler av buffer inneholdende 10 mM Tris pH 8,0, 0,2 mM EDTA, 1 mM MgCl
2. 10 ul av denne reaksjonsblanding ble deretter behandlet med forskjellige enzymer (en enhet) enkeltvis eller i kombinasjon sammen med tilsatte substrater. En totalt 8 forskjellige reaksjoner ble gjort. Hver reaksjon hadde en spesifikk mål i identifisering av arten av de nukleotider som beskrevet nedenfor. Forsvinningen av et bånd under en karakteristisk reaksjon indikert sin identitet. 1. alkalisk fosfatase (P-ASE, Promega) -Fjerner terminalfosfatgrupper med monoester kobling. Så det kan indikere om bandene har terminale fosfatbindinger. 2. Uorganisk Pyrophosphatase (PP
i-ase, fra New England Biolab) -hydrolyses pyrofosfat (PP
i). GTP vandrer på samme sted som PP
i i TLC, slik at denne reaksjonen kan skille mellom PP
i og GTP. 3. fosfodiesterase (PDE) -cleaves den α-β fosfodiester sammenhengen derfor det kan generere PP
i fra NTPs og fosfat fra NDPS. Så band av NDP og NTP forsvant med utseendet på et band for PP
i. 4. PDE fulgt av PP
i-ASE-PP
i genereres fra reaksjonen med PDE ble spaltet av PP
i-ase som bekreftet at det er PP
i og ikke GTP. 5. adenylatkinase (ADK) og 1 mM AMP-konverterer ATP til ADP, slik at ATP båndet redusert, mens ADP båndet økes. GTP kan også fungere som svakt substrat for denne reaksjon så GTP båndet også redusert. 6. Nukleotid diphospho kinase (NDK) og 1 mM ATP-NDK kan overføre terminal fosfat fra ATP til NDPS, så ADP og BNP-band forsvant. 7. NDK og 1 mM ADP-ADP omdannet til ATP ved fosfat overføring fra GTP, så GTP båndet forsvant.
Fremstilling av plasmamembranen
Plasmamembranen ble fremstilt ved den vanlige metoden for svelling av celler i lav saltbuffer og sprekker ved å passere gjennom en smal 25 gauge nål. De buffere og tidspunkt ble valgt for å bevare beste aktiviteten. EDTA ble ikke tilsatt i løpet av rensingen. Vanligvis 200 millioner celler ble kassert og høstet fra kulturplater med PBS-20% FBS og vasket med 5 ml av 2,5 mM kaliumfosfatbuffer pH 7,5 og suspenderes i 10 ml buffer A som var 10 mM HEPES-MES (1: 1), 100 mM NaCl, 2 mM KCl ved pH 7,0. Til dette ble det tilsatt 0,1 mM PMSF og 2% FBS og holdt på is i 20 minutter, hvoretter natriumfosfat pH 7,5 ble tilsatt til 1 mM. Cellesuspensjonen ble lysert med 20 fulle slag med 10 ml sprøyte utstyrt med 25 gauge nål mens du fremdeles holder på is. Det lyserte Suspensjonen ble sentrifugert ved 1000 x g i 5 minutter for å fjerne intakte celler og cellekjernen og deretter ved 5000xg i 15 minutter for å fjerne mitokondriene. Den relativt klare supernatanten fra dette trinnet ble deretter sentrifugert ved 75000xg i 40 minutter i en ultrasentrifuge. Supernatanten ble tømt fullstendig og pelletene ble slått sammen og vasket med buffer B som var buffer A inneholdende 1 mM natriumfosfat og 0,5 mg /ml ultrarent BSA (Invitrogen). Pelletene ble deretter suspendert i 300 ul buffer A inneholdende 0,5 mg /ml ultrarent BSA og holdt så 75 ul porsjoner ved -80 ° C. Flere fryse-tiner påvirkes i stor grad aktiviteten av enzymene. For å bevare aktiviteten av enzymet, ble pelletene som dannes ved sentrifugering alltid suspendert ved forsiktig pipettering og sterk virvling ble unngått ved alle trinn. Alle operasjoner ble utført i kaldt eller på is.
Protein konsentrasjon i membranpreparat.
For å bestemme proteinkonsentrasjonen ble membranpreparater gjort i fravær av BSA. De ble oppløst i 0,5% SDS og mengden av protein ble estimert ved hjelp av BCA-proteinanalysesett (fra Pierce). Vanligvis blir proteinkonsentrasjoner var i området fra omtrent 0,5 mg /ml. Membraner tilsvarende ca. 12-15 ug protein per reaksjon ble brukt som utgangsmembrankonsentrasjon i løpet av vesikel-fremstillingen.
Membran renhet og western blot.
immunoblotanalyse anvendelse av standard teknikker ble utført for å fastslå renheten av plasmamembranfraksjoner. Membranpelletene ble oppløst ved oppvarming i 1% SDS ved 65 ° C i 10 minutter. Hele celleekstrakter oppvarmet i 1% SDS ved 65 ° C i 10 minutter ble anvendt som kontroll. Antistoffer mot Na-K ATPase (ab7671, Abcam Cambridge) og E cadherin (ab15148, Abcam, Cambridge) ble anvendt for å bestemme anrikning av plasmamembranproteiner. Antistoffer mot VDAC (ab34726, Cambridge, MA) og COXIV (ab124538, Abcam, Cambridge) ble brukt til å utelukke forurensninger fra mitokondrielle membran fraksjoner. Antistoffer mot GAPDH (ab8245, Abcam, Cambridge) ble brukt til å utelukke cytoplasma forurensning.
Utarbeidelse av right-out plasmamembranblærer og syre reaksjon
Metoden er oppgitt her er en prototype og mest av den tiden ble det skalert i henhold til behovet av forsøket. Vanligvis 150 ul plasmamembranpreparat ble fortynnet til 300 pl (avhengig av tettheten til den membranpreparat) med buffer A inneholdende 0,5 mg /ml BSA og deretter suspenderes godt ved å anvende 10 slag med en ml sprøyte utstyrt med 25 gauge nål. Det endelige volum ble kontrollert og om nødvendig justert til 300 ml med den samme buffer. I de følgende trinnene, ble ingrediensene strengt lagt i nevnte rekkefølge vurderer et sluttvolum på 400 mL. Bestanddelene ble tilsatt sekvensielt til en sluttkonsentrasjon som er anført: Hepes-MES (1: 1) pH 7,0 til 50 mM, KCl 20 mM, natriumfosfat til 1 mM, ouabain til 0,2 mM, oligomycin 10 uM, bafilomycin til 200 nM , atractyloside til 1 mM og BSA til 1 mg /ml. ADP eller andre ingredienser som måtte være pakket inn i vesikkel ble også tilsatt som nødvendig. PH ble deretter justert til 7,6 med 1 N natriumhydroksyd og bekreftet ved en pH-elektrode. Volumet ble kontrollert og om nødvendig justert med vann for å få et sluttvolum på 400 pl etter tilsetning av radioaktivitet. Dette ble så underkastet 10 slag med en ml sprøyte utstyrt med 25 gauge nål før tilsetning av radioaktivitet. 0,4 mCi /ml
32P
i ble deretter tilsatt, og holdt på is i 20 minutter, hvoretter 10 slag ble påført med sprøyte. Vesiklene ble nå forseglet av følgende sekvens av trinn. Relativt frisk spermin oppløsning ble tilsatt til 1,6 mM, anvendt 10 slag med sprøyte, deretter MgCl
2 ble tilsatt til 4 mM, anvendes en annen 10 slag med sprøyte og holdt på is i 20 minutter. Til dette ble det tilsatt valinomycin til 10 uM, holdt på is i 10 minutter fulgt av CaCl
2 til 0,4 mm, og inkubert på is i ytterligere 10 minutter. Magnesium over 6 mm, spermin over 1 mm (endelig etter fortynning) og kalsium enn 1 mm hemmet aktiviteten så overflødig tillegg ble alltid unngås.
Binding til Cona perler.
300 mikroliter Cona perler ( rad /GE Healthcare) ble vasket to ganger i 1 ml buffer inneholdende 10 mM HEPES-MES (1: 1) pH 7,0, 100 mM NaCl, 1 mM CaCl
2, 0,25 mM BSA (ingen MnCl
2 ble lagt til). Etter siste vask all væsken ble sugd ut ved pipettering med fine gel lasting tips (som ikke tillater perler å få i) ved å dyppe den dypt inn perlene. Dette ble suspendert i 2 ml rør med 3 volumer av fortynningsbuffer (DB) med hensyn til vesikkel-preparat, som i dette tilfellet ville være 1,2 ml. Sammensetningen av DB var 50 mM HEPES-MES (1: 1) pH 7,6, 100 mM NaCl, 1 mM natriumfosfat, 4 mM MgCl
2, 0,4 mM CaCl
2. Til kulesuspensjonen ble det tilsatt 400 ul lukket vesikkel preparat (fra ovenfor). Fortynning av kalium på dette stadiet hjelper i å binde til ConA kuler, som vanligvis inhiberes ved høye kalium. Røret ble forseglet og rotert på en sikker måte meget lett i kaldt i 50 minutter for å tillate binding uten å skade membranen. Perlene ble vasket 3 ganger med 3 volumer iskald vaskebuffer (IM) ved sentrifugering ved 1500 rpm i 30 sekunder. Vaskebufferen inneholdt 50 mM HEPES-MES (1: 1) pH 7,6, 100 mM NaCl, 1 mM natriumfosfat, 2 mM KCl, 4 mM MgCl
2, 0,4 mM CaCl
2, 0,4 mM spermin, 0,25 mg /ml ultrarent BSA, 0,1 mM ouabain, 2,5 uM oligomycin, 100 nM bafilomycin, 1 uM atractyloside. Hver gang alle væsker ble aspirert ut fra sengen med fine gel lasting tips ved å dyppe den dypt ned i perlene. Effektiviteten av vaske ble kontrollert ved reduksjon av radioaktiviteten av kulene mellom påfølgende vask ved hjelp av geigerteller. Perlene ble deretter suspendert i ca 1 ml vaskebuffer, porsjonert jevnt til ca 6 rør (195 mikroliter suspensjon) og umiddelbart brukes til vesikkel analysen som beskrevet nedenfor.
Perle bundet vesikkel analysen.
det perlesuspensjon ble inkubert ved 37 ° C i 1 minutt, og til det lagt målte mengder av 1 N HCI for å skifte pH til ønskede verdier. Etter at ønsket tidsintervall (5 sekunder til 2 minutter), ble det sentrifugert i 15 sekunder ved 1000 rpm og supernatanten ble raskt fjernet med fin gel lasting tips ved å dyppe den i kulene. 75 ul av kloroform-2,5% metanol-blanding ble deretter tilsatt til kulene og virvlet. Til dette ble det tilsatt 50 ul utvinning buffer EB (1 mM kaliumfosfat, pH 6,5, 0,2 mM EDTA). Blandingen ble deretter holdt i vibrator i 30 minutter, sentrifugert ved 8000 rpm i 10 minutter, og den øverste vandige lag ble forsiktig tatt ut unngår kloroform hjelp av gode gel lasting tips. Kulene ble re-ekstrahert med ytterligere 25 ul av EB, ved å virvle i 5 minutter og sentrifugering som før. De vandige lagene fra dette i to trinn ble slått sammen og sentrifugert ved 10000 rpm i 1 minutt for å utfelle eventuelle kuler og den klare vandige lag ble tatt ut. Dette ble deretter holdt ved -80 ° C. For analyse av prøven, ble ca. 25-30 pl av det vandige ekstraktet tørket ved speed-vac og analysert på TLC.
Inni-out vesikkel (IOV) assay
Membrane vesikkel ble tatt i buffer inneholdende 10 mM HEPES-MES-acetat (1,5: 1: 1) pH 6,34, 2 mM KCl, 150 mM NaCl, 10 uM oligomycin og forseglet med 6 mM MgCl
2. Tilsatt 10 pM valinomycin, etterfulgt av en fjerdedel volum av den ovenfor nevnte buffer, men inneholdende 150 mM KCl i stedet for NaCl.
32P
i (0,2-0,5 mM, 0,3 mCi /ml) og ADP (25 uM, når det er nødvendig) ble deretter tilsatt. Etter kort alkalisering i 90 sekunder ved å tilsette alkali, 20 uM av pyrofosfat, og /eller 20 uM ATP ble tilsatt for å fortynne (beskytte) den radioaktive produktene og vortex-blandet med kloroform (inneholdende 2% metanol). Det vandige laget ble analysert ved hjelp av TLC.
Fremstilling av cytosolisk ekstrakt
Celler (100 millioner /ml) ble tillatt å svelle i 2 mM K
2HPO
4 pH 7,4 i 5 minutter, hvoretter bufferen ble justert til 10 mM og NaCl til 100 mM. Til dette ble det tilsatt 1 mM dietylpyrokarbonat, 50 uM vanadat, 50 uM pyrofosfat og lysert ved å passere gjennom 25-gauge nål. Dette ble sentrifugert to ganger ved 13,000xg i 15 minutter og deretter enten sentrifugert ved 74000xg i 40 minutter eller sekvensielt føres gjennom 0,65 um, 0,22 um og 0,11 um membran kolonne for å fjerne membraner. Protein innholdet var ca 3 mg /ml.
IOV og cytosolic ekstrakt kombinasjon analysen
cytosol (5 ug protein) ble lagt til IOV blanding som inneholder
32P
i (0,2 mM , 0,3 mCi /ml) og ADP (100 uM) og hurtig gjøres alkalisk i 10 sekunder. Reaksjonen ble stanset med 2 mM dietylpyrokarbonat og 1/1000
th-fosfatase-inhibitor cocktail B (Santa Cruz Biotech) og vortexblanding med kloroform (inneholdende 2% metanol). Det vandige laget ble analysert ved hjelp av TLC.
Analyse for omdannelse av
32PP
i til ATP ved cytosolisk ekstrakt
cytosolisk ekstrakt (2 ug protein) ble anvendt pr 50 ul reaksjons som inneholdt 10 mM Tris pH 7,5, 1 mM NaH
2PO
4, 100 mM NaCl,
32PP
i (200 uM, 30 uCi /ml), 1 mM MgCl
2 og 250 mikrometer ADP. Reaksjonene ble stanset med 1 mM NHS-biotin (Pierce) og deretter analysert ved TLC.
Tynnsjiktkromatografi (TLC)
PEI-cellulose TLC-plater med 250 pm tykkelse (fra JT Baker Inc.) ble anvendt. Flekkene ble utviklet med 0,75 M KH
2PO
4, pH 3,5
statistikker
Alle resultater vises som gjennomsnitt blir presentert som gjennomsnitt ± 2.SD (SD. Standard avvik) fra tre eller flere uavhengige eksperimenter. Med mindre annet er angitt, ble p-verdier beregnet ved hjelp av Student to-tailed test:. (P 0,05 ble ansett som signifikant)
Resultater
ekstracellulær syre gradient er avgjørende for høy ATP nivåer under aerobic glykolyse
Under aerobe glykolyse kreftceller forbruker glukose til å danne laktat med samtidig ekstrudering av syre som er reflektert av den senkning av pH i det eksterne medium [23]. I utgangspunktet ønsket vi å undersøke den kritiske rollen syre gradient i å opprettholde ATP nivåer under aerob glykolyse. Vi har utviklet et eksperiment for samtidig å måle nivåene av ATP, laktat, glukose og pH i det eksterne medium i sanntid under aerob glykolyse av høyt glykolytiske brystkreftceller, MDA-MB-231 [24]. Vi har også lagt 10 mm oligomycin, en bonafide mitokondriell ATP syntese inhibitor, for å eliminere eventuelle bidrag av mitokondriell ATP syntese. Glykolyse ble initiert ved tilsetning av 0,1% glukose. Aliquoter fra cellesuspensjoner ble tatt ut hvert 5. minutt, tilsatt i kloroform og straks virvlet for effektiv lysering av cellene og inaktivering av enzymene. Det vandige laget ble benyttet for estimering av vannløselige metabolitter som ATP, glukose og laktat. Vi har observert at når glukose var forbrukt under dannelse av laktat, det var en jevn nedgang i pH-verdi med tiden ledsaget av samtidig økning i steady-state nivå av ATP i cellene i forhold til startverdien (figur 1A). Cellene forbrukt glukose i en mengde på 3,08 nmol /min /mill-celler (SD = ± 0,24, 7 datasett) og produsert laktat ved en hastighet på 4,95 nmol /min /mill-celler (SD = ± 0,46, 7 datasett ) (figur 1B). Dette beløper seg til omtrent 80,7% (S.D. = ± 8,78, 7 datasett) omdannelse av glukose til laktat under denne tilstand som er lik den som sees av andre forskere [25, 26]. På den annen side, når det ekstruderte syre ble kontinuerlig nøytralisert ved å tilsette små porsjoner av alkali slik at det ekstracellulære pH-verdien konstant på omkring 7,4, ble nivåer av ATP ikke øke med tiden i forhold til startverdien (figur 1C). Men utbredelsen av glukose forbruk (3,46 nmol /min /million-celler, SD = ± 0,17, 3 datasett) og laktat produksjon (5,95 nmol /min /million-celler, sd = ± 0,50, tre datasett) viste ingen betydelig endring (fig 1D). Dette forsøk viste at den ekstracellulære syre gradient spiller en avgjørende rolle selv under aerob glykolyse i å opprettholde et høyt nivå av ATP i kreftceller. Dette oppmuntret oss til å undersøke om ekstracellulære syre gradient alene kan drive ATP syntese i kreftceller i fravær av enhver tilsatt glukose.
For å MDA-MB-231 cellesuspensjoner i PBS-10% FBS inneholder 10 mikrometer oligomycin ble lagt 0,1% glukose under forsiktig mekanisk omrøring. PH i mediet (ekstracellulære pH) ble overvåket i sann tid mens ATP, glukose og laktat ble målt (per million celler) fra alikvoter tatt ut ved angitte tidspunkter (feilfelt = 2.s.d., n = 3). (A) Steady state ATP og syre ekstrudering (pH) under glykolyse. ATP-verdiene økte kontinuerlig i forhold til startverdien med gradvis reduksjon i pH i det eksterne medium. (B) Glukose konsumert (åpen sirkel) og laktat produsert (fast sirkel) med tid for forsøket i panelet A. (C) Steady state ATP ved kontinuerlig nøytralisering av syre. Den utskilte syre ble kontinuerlig nøytralisert ved å tilsette små porsjoner av alkali. ATP verdiene tilnærmet uendret i forhold til utgangsverdien etter denne tilstanden. (D) Glukose forbrukt (åpen sirkel) og laktat produsert (fast sirkel) for forsøket i panel C. Disse forsøk ble gjentatt tre ganger.
Ekstracellulær syre gradient alene er tilstrekkelig til å drive ATP-syntese i kreftceller
Vi ønsket å vurdere om ekstracellulære syre gradient alene er tilstrekkelig til å drive ATP syntese i kreft. Brystkreftcellelinjen MDA-MB-231 i glukose-fri buffer ble anvendt for å standardisere analysen og for å forstå de grunnleggende egenskapene til reaksjonen. Cellene ble tatt i glukose-fri fjæring buffer og oppbevares ved 37 ° C i 20 minutter. Dette var nødvendig for å tillate cellene å konsumere cytosolisk glukose, og for å bringe de basale nivåene av ATP til en stabil tilstand i løpet av forsøkene. De ble surgjort og deretter lysert med kloroform etter angitt tid (5 sekunder til 2 minutter). ATP ble fremstilt ble estimert fra det vandige laget ved luciferase-assay. Vi har observert at ATP-produksjonen i respons til ekstracellulære syre var hurtig og robust. ATP-konsentrasjonen i cellene økte raskt i løpet av 20 sekunder og nådde en stabil tilstand ved 1 minutt ved forskyvning av pH 7,5 til 7,0 (figur 2A). Frekvensen av ATP syntese beregnet ut fra de første 20 sekundene var ca 1,5 nmol /min /million-celler. Netto økning på ATP-nivåer ved steady state var ca 0,7 nmol per million celler for dette eksemplet. Dette tilsvarer en økning på 0,35 mM ATP i celler [27]. Dette indikerer i det vesentlige robuste syntese av ATP med tanke på at steady state konsentrasjon av ATP i celler som er omkring 1 mm. Ved pH 6,7, frekvensen av ATP syntese var for rask til å nøyaktig overvåke før den oppnår steady state. Vi overvåket mengden av ATP økning etter 5 sekunder av forsuring og anslått en omtrentlig hastighet på ca 5,5 nmol /min /million-celler (S.D. = ± 1,3, 3 datasett). Cellene beholdt sin levedyktighet og integritet under disse vilkår som fastsatt av trypanblått eksklusjon. Nesten alle ATP som produseres (mer enn 98%) ble funnet i cellepelleten som indikerer eksklusiv intracellulær produksjon av ATP. Disse forsøk bekreftet at ekstracellulær syre gradient i seg selv er tilstrekkelig til å drive ATP-syntese i kreftceller. Membran ruptur av fryse-tine, mekanisk homogenisering eller sonikering avskaffet også denne aktiviteten indikerer at intakt membran var avgjørende for dette fenomenet.
(A) Tid kinetikk ATP produksjonen ved pH 7,0. MDA-MB-231 (stabil tilstand), ved pH 7,5 i glukose-fri buffer, ble surgjort til pH 7,0 ved 37 ° C i den angitte tid, behandlet med kloroform og mengdene av ATP ble bestemt fra den vandige fraksjon. ATP verdier er per million celler (feilfelt = 2.s.d., n = 3). (B) Økning i steady-state nivåer av ATP med nedgang i ekstracellulære pH. Cellesuspensjoner (steady state) ved pH 7,5 i glukose-fri buffer ble surgjort til den angitte pH-verdi i 2 minutter ved 37 ° C og stoppet med kloroform. Mengdene av ATP i cellene ble bestemt fra den vandige fraksjon. Økning i ATP per million celler er vist (feilfelt = 2.s.d., n = 3). Vekten ble holdt lignende for brystkreft celler MDA-MB-231 og MCF-10A, og for lungeceller A549 og Beas2 for sammenligning. Rekkefølgen av reaksjons (n) for dette eksperimentet ved hjelp av steady state ligning (se metoder) er vist i den supplement (S2 Fig). De gjennomsnittlige verdier av n (helling) fra flere slike forsøk er: MDA-MB 231, 0,89 (S.D. = ± 0,07, 7 datasett); A549, 0,79 (standardavvik = ± 0,06, 4 datasett) og Paca-2, 2,12 (standardavvik = ± 0,23, 6 datasett). (C) Vendbar natur syre gradient avhengig ATP dannelse. MDA-MB-231 cellesuspensjon (steady state) ved pH 7,5 i glukose-fri buffer ble surgjort på trinnvis måte fra pH 7.5 til 6.2 ved å tilsette små porsjoner av syre under forsiktig omrøring tilstand ved 37 ° C. Ved hvert trinn blir pH-verdien av cellesuspensjonen ble notert, og prøver ble tatt ut etter 2 minutter for bestemmelse av ATP (fast sirkel med heltrukket linje). Etter å ha nådd pH 6,2, ble porsjoner av alkali tilsettes på en trinnvis måte for å bringe pH tilbake til 7,5 (åpen sirkel og stiplet linje). Økningen i ATP-nivåer er per million celler (feilfelt = 2.sd, n = 3).
Etter disse innledende forsøk ble effekten av ekstracellulær pH på steady state nivået av ATP ble bedømt ved pH-verdier «som strekker seg 6,0 til 7,5. Vi brukte et panel av aggressive kreftcellelinjer erholdt fra forskjellige typer vev, MDA-MB-231 (brystkreft), A549 (lungecancer) og MIA-PACA-2 (kreft i bukspyttkjertelen, heretter kalt PACA-2), for å kunne bestemme universalitet av fenomenet.
