Abstract
ATP-gated P2X7 har vist seg å spille en viktig rolle i invasivitet og metastasering av noen svulster. Imidlertid har de mulige linker og underliggende mekanismer mellom P2X7 og prostatakreft ikke klarlagt. Her viste vi at P2X7 ble sterkt uttrykt i noen prostatakreftceller. Nedregulering av P2X7 av siRNA betydelig svekket ATP- eller BzATP drevet migrasjon og invasjon av prostatakreftceller in vitro, og hemmet tumor invasivitet og metastaser i nakne mus. I tillegg stanse av P2X7 bemerkelsesverdig svekket ATP- eller BzATP- drevet uttrykk endringer av EMT /invasjonsrelaterte gener Snail, E-cadherin, claudin-1, IL-8 og MMP-3, og svekket fosforylering av PI3K /AKT og ERK1 /2 in vitro. Lignende effekter ble observert i nakne mus. Disse data indikerer at P2X7 stimulerer celleinvasjon og metastase i prostatakreftceller via noen EMT /invasjons-relaterte gener, så vel som PI3K /AKT og ERK1 /2 signalveier. P2X7 kan være et lovende terapeutisk mål for prostatakreft
Citation. Qiu Y, Li W-h, Zhang H-q, Liu Y, Tian X-X, Fang W-G (2014) P2X7 formidler ATP-Driven Invasivitet i prostata kreft celler. PLoS ONE 9 (12): e114371. doi: 10,1371 /journal.pone.0114371
Redaktør: Jean Kanellopoulos, Universitetet Paris Sud, Frankrike
mottatt: 15 juni 2014; Godkjent: 06.11.2014; Publisert: 08.12.2014
Copyright: © 2014 Qiu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd til WGF fra National Natural Science Foundation of China (81321003, 30971152), og 973 Program (2010CB529402) fra Ministry of Science and Technology i Kina. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft er en av de vanligste ondartede svulster, og også en av de viktigste årsakene til mannlig kreftrelaterte dødsfall på verdensbasis [1]. De fleste av pasientene dør ikke av lokale primærtumor, men av fjernmetastaser. Prosessen med kreft metastaser består av sekvensielle og beslektede arrangementer [2]. På den ene siden, kan kreftceller skaffe trekkende og invasive egenskapene ved epitelial mesenchymale overgang (EMT), som gjør dem i stand til å tilegne seg evnen til å infiltrere omliggende vev og til slutt metastaserer til fjerne steder [3]. På den annen side, interaksjoner mellom kreftceller og tumormikromiljø er avgjørende for den metastatiske spredning av tumorer celler [4]. Våre tidligere studier har fokusert på et viktig tumormikro molekyl, adenosin-5′-trifosfat (ATP).
I tillegg til å ha et intracellulært rolle i cellemetabolismen som energikilde, ATP er blitt bredt akseptert som et ekstracellulært aliserte molekyl, og kan frigis til ekstracellulære miljø i både fysiologiske og patologiske situasjoner som neurotransmisjon, vev skader, et al [5], [6], [7]. Det er nå klart at ATP er en av de mange biokjemiske komponentene i svulsten mikromiljøet og spiller en nøkkelrolle i host-tumor interaksjon. Ekstracellulært ATP virker som et signalmolekyl gjennom interaksjon med P2-reseptorer og medierer en rekke biologiske prosesser som celle proliferasjon, migrering og invasjon [8], [9], [10]. P2-reseptorer er delt opp i to distinkte familier: G protein-koblede reseptorer P2Y (P2Y1, 2, 4, 6, 11, 12, 13 og 14) og ligand-gated kation-permeable kanal P2X-reseptorer (P2X1-7) [11]. En rekke av P2-reseptorer er blitt rapportert å bli uttrykt i prostatakreftceller [10], [12]. Vår tidligere studie viste at ekstracellulært ATP var et viktig pro-invasiv agent og P2Y2 var en av de sentrale reseptorer som formidlet ATP-forfremmet migrasjon og invasjon av prostatakreftceller [10]. Men vi fant også at ATP-mediert pro-invasivitet ikke kan være helt avskaffet etter maksimal stanse all P2Y2, noe som indikerer at en annen reseptor subtype (e) kan være involvert i denne prosessen. Blant de P2X-reseptor-familien, er P2X7 den siste klonet medlem [13], og ble opprinnelig ansett for å være en cytolytisk reseptor siden langvarig aktivering fører til celledød [14]. Nylig ble det funnet at P2X7 var rikelig uttrykt i cancerceller for leukemi, neuroblastom, melanom, så vel som i prostata, bryst og thyroid kreft [15], [16], [17], [18], [19], og ble til og med foreslått å være en biomarkør for tidlig kreft [17], [20], [21]. Videre aktivering av P2X7 ble rapportert å ha anti-apoptotiske virkninger, stimulere svulstcellevekst [22], [23], og til og med for å fremme celle invasivitet i enkelte kreftceller [24], [25], som er motstridende til den opprinnelige antagelsen om at P2X7 var en «død reseptor». I denne studien ønsket vi å undersøke hvilken rolle P2X7 i invasjonen og metastasering av prostatakreft, og å avdekke de underliggende mekanismene.
Materialer og metoder
Kjemi og antistoffer
ATP, ble BzATP, KN62, LY294002, U0126 og Digitonin hentet fra Sigma (St Louis, MO, USA). Kanin anti-P2X7-antistoff (# APR-008) ble oppnådd fra Alomone Labs (Jerusalem, Israel), og antistoffer med β-aktin (# TA-09), ERK1 /2 (# SC-94) og E-cadherin (# SC-7870) ble oppnådd fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Antistoffer fra Snail (# 3895S), claudin-en (# 4933P), p-AKT (# 4056S), AKT (# 4691S), og p-ERK1 /2 (# 9101S) ble kjøpt fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA , USA). HRP-konjugert geit-anti-mus (# ZB-2305) og geite-anti-kanin-IgG (# ZB-2301) ble oppnådd fra OriGene (Maryland, USA). Fluo-4 AM (# F14201) ble oppnådd fra Molecular Probes (Eugene, Oregon, USA). HBSS (# 14025092) ble kjøpt fra Invitrogen (Carlsbad, CA, USA).
Cellelinjer og kulturforhold
1E8 og 2B4 celler ble avledet fra PC-3M menneskelige prostata kreft celle linje. 1E8 var svært metastatisk, mens 2B4 var ikke-metastatisk [26]. 22RV1 prostatakreft cellelinje og BPH1 ble kjøpt fra American Type Culture Collection. Alle celler ble dyrket i RPMI 1640 (GIBCO, Grand Island, NY, USA) supplert med 10% føtalt bovint serum i en fuktet atmosfære inneholdende 5% CO
2 ved 37 ° C.
Revers transkripsjon og real-time PCR
Total RNA ble ekstrahert ved hjelp Trizol reagens (Invitrogen) etter produsentens anvisninger. 2 mikrogram total RNA ble omvendt transkribert til cDNA ved hjelp MMLV revers transkriptase (Promega, Madison, Wisconsin, USA), og real-time PCR ble utført ved hjelp av ABI StepOne Real-Time PCR System (Applied Biosystems, USA). De spesifikke primere ble kjøpt fra Invitrogen og oppført i S1 tabell. De termiske syklus Betingelsene var som følger: 10 min ved 95 ° C, 30 sykluser av 15 sekunder ved 95 ° C og 1 min ved 60 ° C. Relative genuttrykk nivåer, normalisert til p-aktin uttrykk, ble beregnet ved hjelp av to
-. △△ Ct metode [27]
Cell lyse og western blot analyse
Hele cellelysat ble ekstrahert med RIPA buffer (Applygen Technologies Inc, Beijing, Kina) som inneholder proteasehemmere og fosfatase hemmere (Roche, Mannheim, Tyskland). Konsentrasjonen av protein ble bestemt ved bruk av en BCA reagens (Applygen Technologies Inc, Beijing, Kina). Like mengder protein ble separert ved SDS-PAGE-gel og overført til nitrocellulosemembraner (Bio-Rad, Hercules, CA, USA), som ble inkubert ved 4 ° C over natten med primære antistoffer mot P2X7 (1:200), E-cadherin (1:500), claudin-1 (1:1000), sneglen (1:1000), β-actin (1:1000), ERK1 /2 (1:1000), AKT (1:1000), p-ERK1 /2 (1:1000) eller p-AKT (1:1000) respektivt. Immunreaktive proteiner ble visualisert ved chemiluminescence (Applygen Technologies Inc) og kvantifisert ved densitometri analyse ved hjelp Antall Én programvare (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
Cellene ble dyrket i nærvær eller fravær av ATP, og supernatanten ble samlet opp etter annen behandling. Supernatanten ble lagret ved -80 ° C etter sentrifugering ved 12 000 rpm i 15 minutter ved 4 ° C. IL-8 og MMP-3 protein nivåer ble målt separat med IL-8 ELISA kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) og MMP-3 ELISA kit (BOOSTER, Wuhan, Kina) etter produsentens anvisninger. Konsentrasjonen av IL-8 og MMP-3 ble bestemt ved å sammenligne absorbans med standard protein, og deretter normalisert til total protein.
Cell transfeksjon
For transient genet Slå, to distinkte siRNA oligonukleotider målretting P2X7 ble anvendt med sekvenser som følger: P2X7 siRNA1, 5′-CTAGGATAATGTCCAACTAAA-3 «og P2X7 siRNA2, 5′-CACAGTGTCTTTGACACCGCA-3». En rykke siRNA ble brukt som negativ kontroll. 1E8 og 2B4 prostata kreft celler ble transfektert med oven siRNA hjelp Lipofectamine RNAi Max (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) i henhold til produsentens instruksjoner.
For stabil genet stanse, to plasmider med shRNA (kort hårnål RNA ) rettet mot P2X7 ble bygget ved hjelp av pGPU6 /GFP /Neo kloning system (Genepharma Co, Ltd, Shanghai, Kina). Sekvensene som målretter P2X7 var som følger: shRNA1, 5′-GCATGAATTATGGCACCATTA-3 «, og shRNA2, 5′-GCAATTCAGGGCGGAATAATG-3». Den pGPU6 /GFP /Neo vektor med et kappløp sekvens shRNA ble brukt som en negativ kontroll. Cell transfeksjon ble utført med Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. Cellekloner med stabil knockdown av P2X7 ble etablert i 1E8 celler ved Geneticin (G418) utvalg.
For gen over-uttrykk, ble en uttrykke vektor koding full-lengde human P2X7 (hP2X7) konstruert (Genepharma Co, Ltd , Shanghai, Kina), og transfektert inn 22RV1 prostata kreft celler.
In vitro migrasjon analyse og invasjon analysen
migrasjon og invasivitet evner av prostata kreft celler ble evaluert ved hjelp av Boyden Chamber analyse i henhold til fremgangsmåten beskrevet av Albini et al [28], med noen modifikasjoner. Cellemigrering ble analysert ved bruk av 24-brønners Transwell kammer som inneholdt 8 um porestørrelse polyetylentereftalat membrancelledyrkningsinnsatser (Costar, San Diego, CA, USA). Det øvre kammeret ble podet med 0,5 x 10
5 levedyktige celler og det nedre kammeret ble fylt med 600 ul NIH3T3 kondisjonert medium som et kjemotiltrekkende. Etter inkubasjon med eller uten ATP i 12 timer ved 37 ° C i en fuktet atmosfære inneholdende 5% CO
2, ble kamrene fjernet. Celler på den øvre side av kammeret ble fjernet med bomullstupp spinner, og cellene på undersiden av membranene ble farget med krystallfiolett etter fiksering i 4% formaldehyd. Celle invasive egenskaper ble vurdert ved hjelp av de samme innskudd som nevnt ovenfor, men med membranen dekket med en film av Matrigel (BD, Franklin Lakes, NJ, USA). I dette tilfellet, 1 x 10
5 levedyktige celler ble sådd ut i det øvre kammeret. Membranene ble kuttet og montert på objektglass, og cellene ble observert under mikroskop ved 200 x forstørrelse. Hver Forsøket ble gjentatt minst tre ganger, og resultatene for migrasjon og invasjon ble normalisert til kontrollene.
Etikk uttalelse
Alle mus ble reist i et bestemt patogen gratis (SPF) miljø. Alle dyrene ble håndtert i henhold til Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr. Alle eksperimentelle prosedyrer og protokoller ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité Peking University (No. LA2011-72).
In vivo-analyse
Den mannlige BALB /c naken mus (4 uker gamle) ble kjøpt fra Animal Department of Peking University Health Science Center og ble randomisert i tre grupper (n = 8 per gruppe). To kloner 1E8 med stabil knockdown av P2X7, så vel som en negativ kontroll klon ble anvendt i de følgende eksperimenter. Celler i den logaritmiske vekstfase ble oppsamlet og justert med PBS til konsentrasjonen av 5 x 10
6 celler /ml, og 200 ul cellesuspensjon ble injisert subkutant i hver flanke fremre område på nakne mus. Åtte uker etter vaksinasjon ble alle musene avlivet ved halshugging, og de primære svulster sammen med noen organer som lever, lunger, nyrer og lymfeknuter ble skåret ut. Svulster, lever, lunger og nyrer av mus ble fiksert i 4% paraformaldehyde, i parafin og deretter ble delt inn 4~5 mikrometer skiver. Å observere fjernt micrometastasis av primærtumor, haematoxylin og eosin (HE) flekk ble utført på vev lysbilder. I mellomtiden ble enkelte tumorvev lysert med RIPA-lyseringsbuffer for påvisning av protein uttrykk for EMT /invasjons-relaterte gener ved hjelp av western blot-analyse. Videre ble noen vevsprøver nedsenket i OTC medium, og frosne deler av fem mikrometer tykkelse ble forberedt for immunfluorescens analysen.
immunfluorescens analysen
For immunfluorescens farging, kreftprøver ble nedsenket i OTC medium , og frosne deler av 5 um i tykkelse ble fremstilt. Snittene ble fiksert med aceton i 10 minutter ved -20 ° C, og deretter ikke-spesifikk binding ble blokkert i geiteserum i 1 time ved romtemperatur. Seksjoner ble inkubert over natten ved 4 ° C med primære antistoffer mot sneglen (Cell Signaling Technology), E-cadherin (Santa Cruz), eller claudin-1 (Invitrogen) henholdsvis, og deretter inkubert med et FITC-konjugert sekundært antistoff (Sigma) i 1 time ved romtemperatur. DAPI farging ble brukt for å visualisere kjerner. Bilder ble tatt med konfokalmikroskopi.
Fluo-4 AM og etidiumbromid opptaks analyser
Endringer i ledig internt kalsiumkonsentrasjonen ble målt med fluorescerende indikator Fluo-4 AM. Celler sådd ut 1 mm glassbunn rett ble lastet i 30 minutter ved 37 ° C med 1 uM Fluo-4 AM i HBSS-buffer. Overskudd av fargestoff ble fjernet ved skylling av cellene to ganger med HBSS. Deretter ble cellene inkubert i ytterligere 10 minutter i HBSS, og behandlet med eller uten ATP og BzATP som indikert i figur sagn. Bilder ble kjøpt til 5 s intervaller; flere celler i et synsfelt ble målt for 350 s for å oppnå den midlere Fluo-4 fluorescerende signal. For å måle etidium opptak, etidiumbromid (25 uM) ble tilsatt til superfusjonsløsninger. Bilder ble kjøpt til 5 s intervaller for 900 s. Det totale opptak av etidiumbromid ble estimert ved å tilsette digitonin (100 uM) i kyvetten. Den permeabilizing effekten av ATP eller BzATP ble beregnet ved sammenligning med permeabilization målt i nærvær av digitonin.
Cell overlevelse analyse
For å vurdere celleoverlevelse, 2 × 10
5 celler ble sådd per brønn i seks-brønns plater i en kontrollkulturmedium eller i nærvær av 1 mM ATP (eller 100 uM BzATP), og ble dyrket i 24 timer. Celle overlevelse ble beregnet med MTT-analyse og data ble uttrykt som% celle overlevelse sammenlignet med kontroll. Resultatene ble validert ved manuell celletelling. Minst tre uavhengige eksperimenter ble utført.
Data-analyse og statistikk
Alle forsøk ble gjentatt minst tre ganger. Data er presentert som gjennomsnitt ± SD. Dataene ble analysert med SPSS 19.0. Elevens
t
-test ble utført for å evaluere forskjeller mellom to grupper, og parametriske ANOVA ble brukt når flere midler ble sammenlignet. Forskjeller ble vurdert som statistisk signifikant på p. 0,05
Resultater
prostata kreftceller uttrykt funksjonell P2X7
Det første vi analyserte mRNA uttrykk for P2X7 i prostatakreftceller 1E8, 2B4 og 22RV1 så vel som i ikke-ondartet udødelig prostata epitelcelle BPH1 ved hjelp av sanntids-PCR, og fant at P2X7 ble markert uttrykt i 1E8 og 2B4 prostata kreftceller, mens dets ekspresjon var meget svak i 22RV1 og BPH1-celler (fig. 1A). I tillegg ble P2X7 protein sterkt uttrykt i 1E8 og 2B4 (fig. 1B) prostata kreftceller. Deretter undersøkte vi den intracellulære frie kalsiumkonsentrasjon ([Ca
2 +] i) å avgjøre om P2X7 i prostatakreftceller var funksjonell. Ekstracellulært ATP (1 mm) eller BzATP (100 mm) behandling utløste en bemerkelsesverdig økning av [Ca
2 +] i i prostatakreftceller, overvåket av Fluo-4 fluorescens. Imidlertid, KN62 (1 uM), en P2X7-antagonist, inhiberte signifikant ATP eller BzATP indusert [Ca
2 +] i øke (fig. 1C). Etidium-opptaket ble også registrert i prostatakreftceller etter stimulert med ATP eller BzATP, som ble betydelig inhibert når KN62 ble tilsatt til den eksterne løsningen (fig. 1D-E). Alle disse resultatene antydet at P2X7 uttrykt i prostatakreftceller var funksjonell.
(A) Relativ mRNA uttrykk for P2X7 ble normalisert ved β-aktin avskrift i 1E8, 2B4, 22RV1 og BPH1 celler. (B) Protein nivåer av P2X7 i prostatakreftceller ble påvist ved western blot analyse og data ble normalisert til p-aktin. Proteinekspresjon av P2X7 i BPH1 celler ble definert som 1. Verdier ble presentert som gjennomsnitt ± S.D. (vertikale søyler). (C) Representative intracellulære kalsium forandringer i respons til ATP (1 mM) eller BzATP (100 uM) i nærvær eller fravær av KN62 (1 uM). (D) Representative etidium opptak av prostata kreftceller i basal tilstand eller ved stimulering med ATP (1 mM) eller BzATP (100 uM) i nærvær eller fravær av KN62. ATP /BzATP ble tilsatt, som antydet med pilen, til HBSS inneholdende 25 uM etidiumbromid. (E) Ethidium fluorescensintensiteten i basal tilstand eller ved stimulering med ATP (1 mM) eller BzATP (100 uM) i nærvær eller fravær av KN62, ble presentert som en prosentandel i forhold til verdien av digitonin-indusert permeabilisation. Minst tre uavhengige eksperimenter ble utført. * P. 0,05
P2X7 var involvert i ATP /BzATP-drevet migrasjon og invasjon av prostata kreft celler in vitro
P2X7 har vist seg å være over-uttrykt i flere svulster [15], [16], [17], [18], [19], men dens rolle i progresjon av kreft er fortsatt uklar. Våre tidligere studier vist at ekstracellulært ATP kan forbedre migrasjon og invasjon av prostatakreftceller [29], [30]. Vi lurte på om P2X7 spilt en rolle i ATP-mediert biologiske oppførsel av prostatakreftceller. For det første, analyserte vi effekten av P2X7 på overlevelse av prostatakreftceller, og funnet at aktivering av P2X7 med ATP eller BzATP hadde ingen effekt på cellelevedyktighet (fig. 2A). I motsetning til dette har vi funnet at aktivering av P2X7 av ATP forårsaket en signifikant forbedring av cellemigrering og invasjon i prostatakreftceller (Fig. 2C-D). Deretter ble to forskjellige sirnas (siRNA1 og siRNA2) brukes til taushet P2X7 uttrykk, og hver siRNA oppnådd en fremtredende effekt på knockdown av P2X7 i prostatakreftceller (Fig. 2B). Nedregulering av P2X7 ved siRNA bemerkelsesverdig hemmet ATP-drevet migrering og invasjon i 1E8 og 2B4 prostatakreftceller (Fig. 2C-D). Tilsvarende knockdown av P2X7 også betydelig blokkert BzATP-mediert migrasjon og invasjon av prostatakreftceller i 1E8 og 2B4 prostatakreftceller (S1 figur). Videre over-uttrykk for P2X7 tydelig forbedret ATP-indusert migrasjon og invasjon i 22RV1 prostatakreftceller (S2A-B figur). Disse resultatene antydet at P2X7 var involvert i ATP-mediert migrasjon og invasjon av prostatakreftceller.
(A) 1E8 og 2B4 prostata kreft celler ble behandlet med 1 mM ATP for 12 timer og 24 timer. Celleoverlevelse ble bedømt ved MTT-analyse og data ble normalisert til de under kontroll tilstand. (B) 1E8 og 2B4 celler ble transfektert med to forskjellige P2X7 sirnas (siRNA1 og siRNA2) eller en kontroll siRNA (NC). Western blot eksperimenter ble utført for å påvise den knockdown effektivitet. (C-D) In vitro-migrasjon og invasjons analysene ble utført som beskrevet i metodedelen i fravær (kontroll) eller nærvær av 1 mM ATP (ATP 12 timer). Data for cellemigrasjon eller invasjon ble beregnet som en prosentandel av kontrollceller. Resultatene ble demonstrert av histogrammer og verdier ble presentert som gjennomsnitt ± S.D. (vertikale søyler). Minst tre uavhengige eksperimenter ble utført. * P. 0,05
P2X7 deltok i regulering av EMT /invasjon relaterte genuttrykk i prostatakreftceller
Ved å bruke cDNA microarray analyse, vår tidligere studie viste at ekstracellulært ATP kunne regulere mRNA uttrykk for sneglen, E-cadherin, claudin-1 og IL-8, som spiller viktige roller i EMT og tumorprogresjon [10]. Dessuten vår tidligere studie i prostata cancer viste at ATP behandling kan øke ekspresjonen av MMP-3, som er mye involvert i invasjon og metastase av kreft [30]. Derfor lurte vi på om P2X7 deltok i disse ATP-mediert genekspresjon. Som vist på fig. 3, i nærvær av ATP, uttrykk for sneglen, IL-8 og MMP-3 ble signifikant økt i prostatakreftceller 1E8 og 2B4, mens uttrykk for E-cadherin og claudin-1 ble tydelig redusert. BzATP viste tilsvarende effekt på uttrykk for EMT /invasjonsrelaterte gener i prostatakreftceller (S3 figur). Ikke desto mindre, etter knockdown av P2X7 ved siRNA, endringene i uttrykket av sneglen, IL-8, MMP-3, E-cadherin og claudin-1, mediert av ATP eller BzATP, ble svekket (fig. 3 og S3 figur). Videre spesifikt blokkerer aktivering av P2X7 av sin antagonist KN62, ATP og BzATP kunne ikke påvirke uttrykk for Snail, E-cadherin og claudin-en lenger (S4 og S5 Tall). Tilsvarende ATP ført til økt uttrykk av sneglen og redusert uttrykk av E-cadherin i 22RV1 celler som eksogent uttrykt P2X7 (S2C figur). Alle disse dataene antydet at P2X7 var nødvendig for ATP-medierte uttrykk endringer av EMT /invasjonsrelaterte gener i prostata kreft celler.
P2X7 forstummet celler (siRNA1 og siRNA2) og styrer siRNA celler (NC) ble behandlet med eller uten 1 mM ATP i 12 timer. Proteinnivåer av sneglen (A), E-cadherin (B) og claudin-1 (C) ble undersøkt ved Western blot-analyse. Protein nivåer av IL-8 (D) og MMP-3 (E) ble evaluert ved ELISA-analyse. Uttrykk for disse proteinene ble normalisert til sine respektive ekspresjon i kontrollcellene (uten ATP). Resultatene ble presentert som gjennomsnitt ± S.D. (vertikale søyler). Minst tre uavhengige eksperimenter ble utført. * P. 0,05
Aktivering av PI3K /AKT og ERK1 /2 signalveier var kritiske i ATP- /BzATP-drevet migrasjon, invasjon og uttrykk endringer av EMT /invasjonsrelaterte gener
i vår tidligere undersøkelse, har det blitt demonstrert at ATP aktivert PI3K /AKT og ERK1 /2 signalveier i en tids- og doseavhengig måte i 1E8 og 2B4 prostatakreftceller [29], [30]. Her fant vi at BzATP behandling også forårsaket en bemerkelsesverdig aktivering av PI3K /AKT og ERK1 /2 signalveier i prostatakreftceller (S6a-B figur). For å forstå den funksjonelle virkningen av PI3K /AKT og ERK1 /2 signalveier i prostatakreftceller, to farmakologiske inhibitorer, LY294002 og U0126 ble brukt til å blokkere PI3K /AKT og ERK1 /2-signalveien henholdsvis (fig. 4A-B og S6A- B figur). Resultatene viste at ATP- og BzATP drevet migrering og invasjon av prostatakreft-celler ble signifikant undertrykt når PI3K /AKT eller ERK1 /2-signalveien er sperret (fig. 4C-D og S6C-D figur). Videre hemming av enten PI3K /AKT eller ERK1 /2 signalveien betydelig svekket uttrykket endringer av EMT /invasjonsrelaterte gener indusert av ATP eller BzATP i prostatakreftceller (Fig. 5 og S7 figur).
IE8 og 2B4-celler ble behandlet med LY294002 (kolonnene betegnet som LY294002) eller U0126 (kolonnene betegnet som U0126) eller uten behandling (tjente som en negativ kontroll, baner betegnet som NC). (A-B) og LY294002 U0126 hemmet ATP-mediert PI3K /AKT og ERK1 /2 aktiveringen hhv. (C-D) Effekter av LY294002 og U0126 om migrasjon og invasjon i 1E8 og 2B4 prostata kreft celler. Data for cellemigrasjon eller invasjon ble beregnet som en prosentandel av kontrollceller. Resultatene ble demonstrert av histogrammer, og verdiene ble presentert som gjennomsnitt ± standardavvik (vertikale søyler). Minst tre uavhengige eksperimenter ble utført. * P. 0,05
IE8 og 2B4 celler ble behandlet med LY294002 (baner betegnet som LY294002) eller U0126 (baner betegnet som U0126) eller uten behandling (serveres som en negativ kontroll, baner betegnet som NC ). Uttrykk for Snail (A), E-cadherin (B) og claudin-en (C) ble oppdaget av vestlige blotter. Uttrykk for IL-8 (D) og MMP-3 (E) ble påvist ved hjelp av ELISA. Uttrykk for disse proteinene ble normalisert til sine respektive ekspresjon i kontrollcellene (uten ATP). Resultatene ble presentert som gjennomsnitt ± S.D. (vertikale søyler). Minst tre uavhengige eksperimenter ble utført. * P. 0,05
P2X7 var nødvendig for ATP /BzATP-indusert aktivering av PI3K /AKT og ERK1 /2 signalveier
Siden vi observert at P2X7 samt PI3K /AKT og ERK1 /2 signalveier utstilt viktige effekter på ATP- og BzATP-drevet migrasjon, invasjon og uttrykk endringer av EMT /invasjonsrelaterte gener i prostata kreft celler, vi lurte på om P2X7 var involvert i ATP- og BzATP-indusert aktivering av PI3K /AKT og ERK1 /2 signalveier. Som vist på fig. 6 og S8 figur, knockdown av P2X7 resultert i fremtredende hemming av ATP- og BzATP-indusert fosforylering av PI3K /AKT og ERK1 /2 signalveier. Samlet utgjør disse resultatene antydet en viktig rolle P2X7 i ATP-mediert aktivering av PI3K /AKT og ERK1 /2 signalveier.
P2X7 forstummet celler (siRNA1 og siRNA2) og styrer siRNA celler (NC) ble behandlet med eller uten 1 mM ATP i 15 min. Western blot eksperimenter ble utført for å analysere fosforylering nivå av AKT (A) og ERK1 /2 (B). Uttrykk for p-AKT og p-ERK1 /2 ble normalisert til sine respektive ekspresjon i kontrollcellene (uten ATP). Resultatene ble presentert som gjennomsnitt ± S.D. (vertikale søyler). Minst tre uavhengige eksperimenter ble utført. * P. 0,05
P2X7 var nødvendig for in vivo invasivitet og metastasering samt regulering av uttrykk for EMT /invasjonsrelaterte gener
Til slutt, vi analysert in vivo effekten av P2X7 på invasjon og metastaser i nakne mus. Tumorer i mus, utviklet med injisert subkutant kontrollceller, viste betydelig invasivitet til nærliggende vev, slik som fett og muskel. Videre er det i de mus injisert med kontrollceller, 37,5% av dem presentert fjernmetastaser i nyre og 87,5% presentert lymfeknutemetastaser. Men i de to gruppene injisert med P2X7-forstummet celler, bare en mus hadde metastaser til lymfeknuter (Fig. 7).
(A) 1E8 celler ble stabilt transfektert med P2X7 shRNA eller en rykke shRNA (NC ). To stabile P2X7 shRNA kloner (shRNA1 og shRNA2) ble vist å uttrykke lave nivåer av P2X7 ved hjelp av western blot-analyse. (B) Representant fotografi av tumorsnitt og tilstøtende vev (farget med hematoksylin og eosin (H E)). Skala barer = 100 mikrometer. (C) Representative fotografier av nyre seksjon og lymfeknute seksjon (farget med H E) fra tumor-bærende mus. Skala barer = 50 mikrometer. (D) Antallet micrometastasis i nyre og lymfeknuter angitt i del fra tumor-bærende mus. * P. 0,05
Vi har også analysert uttrykk for Snail, E-cadherin, claudin-1 og IL-8 samt fosforylering nivåer av AKT og ERK1 /2 i primærtumorvevet musene dannet av 1E8 kontroll shRNA celler og P2X7 shRNA celler. Etter knockdown av P2X7, ble uttrykk for sneglen og IL-8 tydeligvis hemmet mens uttrykk for E-cadherin og claudin-1 ble signifikant øket (fig. 8A-C). Dessuten P2X7 knockdown betydelig hemmet aktivering av AKT og ERK1 /2 i tumorvev (Fig. 8D). Disse resultatene var i samsvar med resultatene observert in vitro.
(A) Immunofluorescens farging for snegle, E-cadherin, claudin-1 (grønn) og DAPI (blå) ble utført i tumorvev hos mus. Bilder ble tatt av konfokal mikroskopi. Skala linjene representerer 75 um eller 25 um som vist i fig. (B) Western blotting ble utført for å påvise proteinnivåer Snail, E-cadherin og claudin-en i tumorvev. (C) ELISA ble anvendt for å undersøke ekspresjon av IL-8. (D) Western blotting ble utført for å analysere fosforylering nivået av AKT og ERK1 /2 i tumorvev. For hver gruppe ble minst tre forskjellige tumorer fra tre forskjellige mus anvendt i eksperimentene. * P. 0,05
Diskusjoner
Mange studier har vist at den ekstracellulære mikromiljøet av svulster inneholdt mye høyere konsentrasjoner av ATP enn friskt vev, og ATP kan representere en stressende stimulans i kreft progresjon [7]. ATP kan bli utskilt av levende tumorceller inn i deres mikromiljø ved forholdsvis høye konsentrasjoner, så vel som frigjøres fra nekrotiske celler i perilesional regioner av kreft [6], [7], [24]. Som en allestedsnærværende ekstracellulært messenger, ATP funksjoner via sin interaksjon med P2X og P2Y reseptorer.
Blant P2 reseptorer engasjert av ekstracellulært ATP, er P2X7 den mest konsekvent uttrykt eller over-uttrykt av tumorceller. P2X7 er en ATP-gated ionekanal og har lenge vært kjent for sin cytotoksiske aktivitet er imidlertid foreslått en økende bevis en rolle for P2X7 i celleproliferasjon. P2X7 er blitt vist å stimulere proliferasjon av lymfoide celler og fremme serumuavhengig vekst [22], [23]. Omfattende studier av immunceller viste den viktige rollen som P2X7 som et immunmodulerende reseptor som er involvert i interleukin (IL) -1β modning og slipp, antigen presentasjon og transplantat-mot-vert-reaksjon [31], [32], [33]. I løpet av det siste tiåret har høy uttrykk for P2X7 blitt funnet i ulike typer svulster og bevis har samlet viser pro-kreft effekter av P2X7 [15], [16], [17]. Melanomceller med høyt uttrykt P2X7, viste anti-apoptotiske virkning [16]. Etter transfeksjon med P2X7, HEK293 fibroblaster og CT26 kolon carcinoma celler demonstrert med forbedringer i tumorgenese, in vivo vekst og angiogenese, og reduksjon av apoptose [34]. Dessuten, aktivering av P2X7 fremmes migrering og invasivitet av brystkreftceller [24] og lymfoid neoplasma-celler [35]. I foreliggende studie demonstrerte vi at P2X7 var sterkt uttrykt i enkelte prostata kreftceller. Knockdown av P2X7 av siRNA betydelig avskaffet ATP-forbedret migrasjon og invasjon in vitro. Dessuten, nedregulering av P2X7 førte til bemerkelsesverdig inhibering av tumor invasivitet og metastaser i nakne mus.
